一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒及半定量检测方法

摘要

本发明涉及一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒包括渗滤装置、胶体金标记的猫SAA抗体、封闭液、洗涤液，所述渗滤装置从上往下依次包括滤液层、微孔滤膜、吸水垫层以及底板，所述滤液层上设有与微孔滤膜相对应的通孔，所述微孔滤膜上包被有猫SAA抗体，本申请还提供了一种应用检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒的半定量检测方法。应用本申请的试剂盒及半定量检测方法可以快速、精准的检测出猫体内的SAA含量，具有特异性高、费用低廉、仪器简单易携、灵敏度高等优点，可用于现场检验。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒及半定量检测方法。

背景技术

血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A，英文缩写SAA)，是由肝细胞产生的分泌到血清中的一种敏感的急性时相反应蛋白，是淀粉样蛋白A(amyloid A，AA)的前体物质，其敏感性及特异性均高于C-反应蛋白(CRP)，在现代医学卫生领域已成为一项新的研究热点，能更好地反应炎症程度，当机体发生感染或损伤时，这种蛋白会在短时间内急剧升高，当机体感染消除后又会迅速降低至正常水平。猫血清淀粉样蛋白A(即猫SAA)作为猫全身炎症反应指标中最灵敏的物质，当SAA值升高时，表明一定会有病变。当猫咪临床症状不清楚时，也可通过检测猫体内是否含有SAA来判断猫是否患有炎症。当患病猫术后或治疗后复检时，也可通过检测猫体内是否含有SAA，可判断手术效果或术后恢复状况及是否有术后感染等情况。

临床实验室检测猫SAA一般使用免疫比浊法、化学发光免疫分析、酶联免疫法等方法，其中，免疫比浊法检测成本相对较高，需配套仪器使用；化学发光免疫分析选择性差，会对一个系列的化合物做出反应，而不是针对单个的某一化合物，且化学发光免疫分析的发射强度依赖于各种环境因素，在不同的环境体系中，发射强度和时间的曲线有较大的差别，所以必须严格控制外界的各种因素；酶联免疫法是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测，该方法检测速度快、费用低廉、仪器简单易携、灵敏度高和选择性强等优点，可用于现场检验，但其特异性和重复性有待提高。

1971年，Faulk和Taylor(Immunochem，8：1081，1971)首先使用免疫胶体金作为标记物用于免疫电镜技术，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法得到了广泛的应用。常用的金标免疫方法有斑点免疫金渗滤法(dotimmune-gold filtration assay)和侧向免疫金层析法(bilateral immune-chromatographic assay)，而侧向免疫金层析法对环境要求严格，长时间检测会受到空气湿度影响，因此该技术在临床上受到约束。胶体金免疫渗滤也是一种成熟的技术，目前在市场上有多家厂商已经生产了多种不同检测物的诊断试剂盒供应，但是尚未有关于检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于如何快速、准确的检测猫SAA，提供了一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒及检测方法。

为实现上述目的，本申请提供了一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒，包括渗滤装置、胶体金标记的猫SAA抗体、封闭液、洗涤液，所述渗滤装置从上往下依次包括滤液层、微孔滤膜、吸水垫层以及底板，所述滤液层上设有与微孔滤膜相对应的通孔，所述微孔滤膜上包被有猫SAA抗体。

作为本申请的进一步改进，所述微孔滤膜上包被的所述猫SAA抗体的浓度为0.3mg/ml～1.5mg/ml，所述封闭液的pH值为6.5～7.0，所述洗涤液的pH值为6.5～7.5。

作为本申请的进一步改进，所述封闭液包括0.05％Triton-100和0.2％BSA，所述洗涤液为50mol/L、pH7.2的PBS溶液。

作为本申请的进一步改进，所述微孔滤膜上包被的所述猫SAA抗体的浓度为0.8mg/ml。

作为本申请的进一步改进，所述胶体金标记的猫SAA抗体按以下步骤制备：S1、胶体金溶液的制备：将100ml、0.01％的氯金酸溶液煮沸，加热搅拌下缓慢加入1％的柠檬三钠1ml～2ml，继续煮沸15min，直至颜色稳定为红色，冷却后用双蒸水恢复到原体积，得到胶体金溶液；用0.1mol/L的K

作为本申请的进一步改进，步骤S2中，所述猫SAA抗体的稀释浓度为0.2mg/ml～0.3mg/ml。

作为本申请的进一步改进，包被有猫SAA抗体的所述微孔滤膜按以下步骤制备：将猫SAA抗体应用PBS缓冲溶液稀释后，点样到微孔滤膜上，自然晾干后，将所述微孔滤膜浸入1％BSA溶液中，封闭，室温自然干燥后密封干燥保存。

作为本申请的进一步改进，所述点样设备为微量点样器，所述点样量为1ul～2ul。

为实现上述目的，本申请还提供了一种应用检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒的半定量检测方法，包括如下步骤：S1、通过渗滤装置上的通孔向微孔滤膜上滴加封闭液，待所述封闭液完全渗入所述微孔滤膜；S2、再通过渗滤装置上的所述通孔向步骤S1中所述的微孔滤膜上滴加待测样本，使所述待测样本充分渗入所述微孔滤膜；S3、再通过渗滤装置上的所述通孔向步骤S2中所述的微孔滤膜上滴加洗涤液，使所述洗涤液完全渗入所述微孔滤膜；S4、再通过渗滤装置上的所述通孔向步骤S3中所述的微孔滤膜上滴加胶体金标记的猫SAA抗体，待所述胶体金标记的猫SAA抗体完全渗入所述微孔滤膜；S5、再通过渗滤装置上的所述通孔向步骤S4中所述的微孔滤膜上滴加所述洗涤液，使所述洗涤液完全渗入所述微孔滤膜；S6、应用金标读数仪对显色结果进行数值分析；S7、设置一组含猫SAA抗原的标准待测样本，所述标准待测样本中猫SAA抗原的浓度的分别设置为0ug/ml、0.5ug/ml、1.0ug/ml、2.0ug/ml、4.0ug/ml、8.0ug/ml、10.0ug/ml、14.0ug/ml、18.0ug/ml，将所述标准待测样本分别按S1～S6的步骤进行检测，以所述标准待测样本的检测结果为基准制作标准曲线，所述标准曲线中：以猫SAA抗原浓度为横坐标，所述金标读数仪的数值为纵坐标；将未知猫SAA浓度的未知待测样本按S1～S6的步骤进行检测，根据所述的标准曲线判定结果。

作为本申请的进一步改进，步骤S1中，所述封闭液的量为50ul；步骤S2中，所述待测样本的量为25ul；步骤S3中，所述洗涤液的量为50ul；步骤S4中，所述胶体金标记的猫SAA抗体的量为25ul；步骤S5中，所述洗涤液的量为50ul。

本申请的有益效果在于，本申请提供了一种检测猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒，包括渗滤装置、胶体金标记的猫SAA抗体、封闭液、洗涤液，所述渗滤装置从上往下依次包括滤液层、微孔滤膜、吸水垫层以及底板，所述滤液层上设有与微孔滤膜相对应的通孔，所述微孔滤膜上包被有猫SAA抗体，本申请还提供了一种应用检测猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒的半定量检测方法。应用本申请的试剂盒及半定量检测方法可以快速、精准的检测出猫内的SAA，方法敏感、特异性高，且标记物简单，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不需要荧光显微镜，检测速度快、费用低廉、仪器简单易携、灵敏度高等优点，可用于现场检验。

附图说明

图1为一种检测猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒中渗滤装置的结构示意图；

图中：1、滤液层；2、微孔滤膜；3、吸水垫层；4、底板。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例及相应的附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，不用来限制本发明的范围。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

为了提高猫SAA的检测速度和精准度，降低检测成本，本申请提供了一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒，包括渗滤装置、胶体金标记的猫SAA抗体、封闭液、洗涤液，所述渗滤装置从上往下依次包括滤液层1、微孔滤膜2、吸水垫层3以及底板4，所述滤液层1上设有与微孔滤膜2相对应的通孔，所述微孔滤膜2上包被有猫SAA抗体。本申请中，所述的微孔滤膜2进一步优选为硝酸纤维素膜；作为一个优选的实施例，所述微孔滤膜2上包被的所述猫SAA抗体的浓度为0.3mg/ml～1.5mg/ml，所述封闭液的pH值为6.5～7.0，所述洗涤液的pH值为6.5～7.5。进一步优选的，所述微孔滤膜2上包被的所述猫SAA抗体的浓度为0.8mg/ml。

本申请中，包被有猫SAA抗体的所述微孔滤膜2按以下步骤制备：将猫SAA抗体应用PBS缓冲溶液稀释后，点样到微孔滤膜2上，自然晾干后，将所述微孔滤膜2浸入1％BSA溶液中，封闭，室温自然干燥后密封干燥保存。进一步优选的，所述点样设备为微量点样器，所述点样量为1ul～2ul。本申请中，作为一个优选的实施例，所述渗滤装置为一个尺寸为3cm*3cm*0.6cm的塑料小盒，分为上下盖层和底层两层，盖层为所述的渗滤层，盖层的中央有一个直径为0.5cm的小孔，底层充填吸水性较强的垫料，垫料相当于吸水垫层3，底层相当于底板4，盖层的小孔下，紧贴垫料放置一片直径为1.2cm的微孔滤膜2，所述微孔滤膜2进一步优选为NC膜，紧闭盖层和底层，即为渗滤装置。进一步的所述渗滤装置中，所述微孔滤膜2上使用微量点样器点样1ul～2ul的用PBS稀释好浓度为0.8mg/ml的猫SAA抗体，自然晾干后浸入1％BSA中1min封闭，然后室温自然干燥，保存于放干燥剂的密封塑料袋中。作为一个优选的实施例，所述封闭液包括0.05％Triton-100和0.2％BSA，所述洗涤液为50mol/L、pH7.2的PBS溶液。

本申请中，作为另一个优选的实施例，所述渗滤装置从上往下依次包括滤液层1、微孔滤膜2、吸水垫层3以及底板4，所述滤液层1上设有与微孔滤膜2相对应的通孔，所述吸水垫层3设于所述底板4上，所述滤液层1上设有与微孔滤膜2相对的通孔，所述微孔滤膜2上包被有猫SAA抗体。所述滤液层1为由非吸水材料制备而成，设在所述滤液层1中心上的所述通孔的直径进一步优选为0.5cm，所述非吸水材料进一步优选为离型纸；所述微孔滤膜2是一种与蛋白质有亲和力的微孔膜，进一步优选为NC膜，其上包被猫SAA抗体；所述吸水垫层3为由吸水材料制备而成。作为优选的实施例，所述吸水垫层3中央有凹槽，凹槽的中心位置有与包被探针形状大小相匹配的凸起，探针包被区域与吸水垫凸起部分紧密相连，所述微孔滤膜2其余部分与所述吸水垫层3不接触。

本申请中，作为一个优选的实施例，所述胶体金标记的猫SAA抗体按以下步骤制备：S1、胶体金溶液的制备：将100ml、0.01％的氯金酸溶液煮沸，加热搅拌下缓慢加入1％的柠檬三钠1ml～2ml，继续煮沸15min，溶液颜色由淡黄色迅速变为灰色，然后变为黑色，最后稳定为红色，直至颜色稳定为红色后冷却，冷却后用双蒸水恢复到原体积，得到胶体金溶液；用0.1mol/L的K

本申请中，作为一个优选的实施例，本申请提供了一种检测猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒的操作方法，其中，所述渗滤装置为一个尺寸为3cm*3cm*0.6cm的塑料小盒，分为上下盖层和底层两层，所述渗滤装置中所述微孔滤膜2为NC膜，1)取出渗滤装置，在通孔的NC膜上，滴加2滴(约50ul)封闭液；2)待其渗入盖层内，在NC膜上，加待检测样本1滴(约25ul)；3)待其渗入盖层内，在NC膜上，滴加2滴(约50ul)洗涤液；4)待其渗入盖层内，在NC膜上，加胶体金标记的猫SAA抗体1滴(约25ul)，使其与NC膜上吸附的检品发生反应；5)待其渗入盖层内，在NC膜上，滴加2滴(约50ul)洗涤液；6)至洗涤液完全渗入盖层内。结果观察：在通孔NC膜上出现红色反应时为阳性反应，阴性不着色。

为提高猫SAA的检测速度和精准度，降低检测成本，本申请还提供了一种应用检测猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒的半定量检测方法，包括如下步骤：S1、通过渗滤装置上的通孔向微孔滤膜2上滴加封闭液，待所述封闭液完全渗入所述微孔滤膜2；S2、再通过渗滤装置上的所述通孔向步骤S1中所述的微孔滤膜2上滴加待测样本，使所述待测样本充分渗入所述微孔滤膜2；S3、再通过渗滤装置上的所述通孔向步骤S2中所述的微孔滤膜2上滴加洗涤液，使所述洗涤液完全渗入所述微孔滤膜2；S4、再通过渗滤装置上的所述通孔向步骤S3中所述的微孔滤膜2上滴加胶体金标记的猫SAA抗体，待所述胶体金标记的猫SAA抗体完全渗入所述微孔滤膜2；S5、再通过渗滤装置上的所述通孔向步骤S4中所述的微孔滤膜2上滴加所述洗涤液，使所述洗涤液完全渗入所述微孔滤膜2；S6、应用金标读数仪对显色结果进行数值分析；S7、设置一组含猫SAA抗原的标准待测样本，所述标准待测样本中猫SAA抗原的浓度的分别设置为0ug/ml、0.5ug/ml、1.0ug/ml、2.0ug/ml、4.0ug/ml、8.0ug/ml、10.0ug/ml、14.0ug/ml、18.0ug/ml，将所述标准待测样本分别按S1～S6的步骤进行检测，以所述标准待测样本的检测结果为基准制作标准曲线，所述标准曲线中：以猫SAA抗原浓度为横坐标，所述金标读数仪的数值为纵坐标；将未知猫SAA抗原浓度的未知待测样本按S1～S6的步骤进行检测，根据所述的标准曲线判定结果。进一步优选的，所述标准待测样本均进行至少5次测试，选取平均测量值。

本申请中，作为优选的实施例：步骤S1中，所述封闭液的量为50ul；步骤S2中，所述待测样本的量为25ul；步骤S3中，所述洗涤液的量为50ul；步骤S4中，所述胶体金标记的猫SAA抗体的量为25ul；步骤S5中，所述洗涤液的量为50ul。

本申请中，作为优选的实施例，本申请还提供了一种应用检测猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒的半定量检测的方法，取试剂盒，分别检测0.5ug/ml、1.0ug/ml、2.0ug/ml、4.0ug/ml、8.0ug/ml、10.0ug/ml、14.0ug/ml、18.0ug/ml的含猫SAA抗原的待检测标准样本，每个浓度充分测5次，以0ug/ml做为空白对照。用金标读数仪对显色结果进行判读定量分析。以猫SAA抗原浓度为横坐标金标读数仪(每个样品的检测结果为该浓度下5个样品检测平均值)为纵坐标，得到一个标准曲线。在标准曲线上，随着待检测标准样本的浓度升高，测得信号值也随之升高，在浓度为10.0ug/ml时达到最高峰，随后曲线趋于平缓。根据标准曲线计算，本试剂盒对浓度0.5ug/ml、1.0ug/ml样品部分检出，对2.0ug/ml的样品全部检出，其最低检出限≤2.0ug/ml，反应颜色的深浅与猫SAA抗原浓度呈正比。结果解释：当浓度≤2.0ug/ml，在小孔NC膜上没有出现红色反应，结果为阴性；当浓度>2.0ug/ml，在小孔NC膜上出现红色反应，结果为阳性，颜色越深，其浓度越高。本申请中，金标读数仪的工作原理主要是通过将样品用检测卡进行浸泡后对检测卡上吸收的颜色进行检测，金标计数仪是反射式光度计。胶体金对光的吸收(反射)具有选择性，对绿光(波长在530nm附近)的反射率随胶体金沉淀量的增加而减少，由此可计算被测物的浓度。基本上只要市面上有的检测卡，金标仪都可以进行快速检测。

本发明的基础原理为：以微孔滤膜2为载体，利用微孔滤膜2的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在以特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。斑点免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展起来的，应用的结合物是酶标记的，称为斑点酶免疫渗滤试验。90年代初发展了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验(dot immune-goldfiltration assay,DIGFA)，又名滴金免疫测定法(简称滴金法)。在滴金法中不需酶对底物的反应，该方法操作完成之后可直接观察结果，检测速度快，且结果一目了然，克服了ELISA操作繁琐，耗时较长的缺点。

为了验证检测猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒的性能，进行了如下性能测试：

稳定性测试：分别于第3d，7d，14d，28d取同批次猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒(均在37度保存)进行稳定性实验，用浓度为2.0ug/ml的标准品进行测试，金标读数仪对显色结果进行判读定量分析，结果一致，表明检测猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒具有良好的稳定性。

敏感性测试：随机选择100份临床猫血清样本用本试剂盒和免疫荧光层析检测卡方法做检测，所得SAA含量范围样本数量如表一所示：

表一：斑点免疫金渗滤试剂盒与免疫荧光层析检测卡的检测结果比对

由上表可知，检测猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒具有良好的稳定性。

批内差异：同一批猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒，用2.0ug/ml的标准品测试，所得结果颜色显色深浅一致，表明检测猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒具有良好的批内差异。

批间差异：不同批次猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒，用2.0ug/ml的标准品测试，所得结果颜色显色深浅一致，表明检测猫SAA斑点免疫金渗滤试剂盒具有良好的批间差异。

综上所述，本申请提供了一种检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒，包括渗滤装置、胶体金标记的猫SAA抗体、封闭液、洗涤液，所述渗滤装置从上往下依次包括滤液层、微孔滤膜、吸水垫层以及底板，所述滤液层上设有与微孔滤膜相对应的通孔，所述微孔滤膜上包被有猫SAA抗体，本申请还提供了一种应用检测猫SAA的斑点免疫金渗滤试剂盒的半定量检测方法。应用本申请的试剂盒及半定量检测方法可以快速、精准的检测出猫内的SAA，方法敏感、特异性高，且标记物简单，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不需要荧光显微镜，检测速度快、费用低廉、仪器简单易携、灵敏度高等优点，可用于现场检验。

虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。