一种识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株及其构建方法

摘要

本发明提供了一种识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株及其构建方法。本发明通过phiC31整合酶，构建得到带有Bxb1的整合位点的CHO‑S稳转细胞工程株CHO‑JJ‑9，保藏编号为CCTCC NO：C2020246；再通过Bxb1整合酶快速高效地把目的基因转入CHO‑JJ‑9稳转细胞工程株，构建得到可用于表达目的基因的CHO‑S稳转细胞株；其中通过Bxb1整合酶把识别H3 K18la的抗体基因转入工程菌CHO‑JJ‑9，获得了一种识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株，保藏编号为CCTCC NO：C2020245。本发明提供的方法大幅缩短稳转细胞株构建时间，提高构建稳转细胞株的成功率，且获得的稳转细胞株均是高拷贝的，可以明显缩短大批量供货给工业客户的周期，减少成本。

说明书

技术领域

本发明属于抗体制备领域，具体而言，本发明涉及一种识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株及其构建方法。

背景技术

分泌单克隆抗体传统制备方法为通过免疫兔子，然后取兔子的免疫细胞与兔骨髓瘤细胞融合法，包括抗原免疫、B细胞分选、细胞融合、细胞株筛选、细胞库构建等过程。传统制备的融合细胞株容易产生染色体丢失、基因缺失等现象，严重影响抗体生产不同批次间稳定性，影响产品质量。此外，融合细胞株还存在抗体产量低，细胞培养困难等问题。

随后人们使用重组技术将抗体基因克隆出来，然后转染至细胞株中，而目前大部分公司使用瞬时转染体系，这个体系的优点是周期短，缺点是成本高(主要是转染试剂和质粒提取成本)，表达量低。因此，稳转细胞株才是供应大量抗体的最佳选择，然而传统CHO-S稳转细胞株构建是通过电击转染，然后经过约1.5个月筛选，之后进行亚克隆，最终获得稳转细胞株，整个周期需要约3-4个月，而且这个方法中目的基因是随机整合至CHO-S基因组中，且效率非常低。因此急需一种稳转效率更高、周期更短的获得单克隆抗体的CHO-S稳转细胞株的方法。

乳酸于1780年被瑞典化学家卡尔·W·希尔(Carl Wilhelm Scheele)首次从牛奶中分离出，长时间以来乳酸被认为仅仅是糖酵解过程中产生的废物。近些年来，乳酸的一些新功能被陆续发现，比如乳酸可以被肿瘤细胞吸收转运至线粒体进行氧化提供能量，肿瘤微环境中的乳酸对免疫细胞的杀伤功能有抑制作用，乳酸是调控天然免疫信号。

美国芝加哥大学Yingming Zhao和Lev Becker等研究人员发现，组蛋白乳酸化修饰能够调控基因表达。2019年10月24日出版的《自然》发表了这项成果。研究人员发现组蛋白赖氨酸残基的乳酸来源的乳酸化作为表观遗传修饰，直接促进了染色质的基因转录。研究人员在人类和小鼠细胞的核心组蛋白上鉴定出28个乳酸化位点。缺氧和细菌刺激通过糖酵解诱导乳酸的产生，并且其作为促进组蛋白乳酸化的前体。使用暴露于细菌的M1巨噬细胞作为模型系统，研究人员发现组蛋白乳酸化与乙酰化具有不同的时间动态。在M1巨噬细胞极化的后期，组蛋白的乳酸化修饰增强，从而诱导涉及伤口愈合的稳态基因，包括Arg1。总体而言，这些结果表明，细菌攻击的M1巨噬细胞中的内源性“乳酸时钟”打开基因表达以促进体内平衡。因此，组蛋白乳酸化提供了一个增进了解乳酸的功能及其在各种病理生理状况(包括感染和癌症)中作用的机会。

H3 K18la抗体是指抗H3组蛋白第18位赖氨酸乳酸化的抗体，构建识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株用于大规模生产H3 K18la兔单克隆抗体，对于癌症和感染等疾病的研究具有重要意义。因此急需一种稳转效率更高、周期更短、更稳定地获得H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种具有较高的抗H3组蛋白第18位赖氨酸乳酸化(H3K18la)抗体产量的抗H3K18la稳转细胞株以及其构建方法和应用。本发明通过phiC31整合酶，构建得到带有Bxb1的整合位点的CHO-S稳转细胞工程株；再通过Bxb1整合酶快速高效地把抗体基因转入CHO-S稳转细胞工程株，构建得到可用于生产抗体的CHO-S稳转细胞株；其中通过Bxb1整合酶把抗H3 K18la抗体基因整合入CHO-JJ-9工程株中，获得了一种识别H3K18la兔单克隆抗体稳转细胞株。本发明提供的方法大幅缩短稳转细胞株构建时间，提高构建稳转细胞株的成功率，且获得的稳转细胞株均是高拷贝的，可以明显缩短大批量供货给工业客户的周期，减少成本。

本研究小组研究发现，phiC31整合酶与CHO-S细胞中普遍存在的一些整合酶具有同源重组相似位点。

并不是说phiC31整合酶是CHO-S细胞本身具备的，而是phiC31整合酶的整合位点与CHO-S细胞中的一些基因同源相似。因此本发明创造性地利用此位点，通过phiC31整合酶将新的整合效率更高的整合酶位点(Bxb1)引入到CHO-S细胞中。

本发明通过phiC31整合酶，在CHO-S细胞中引入整合效率更高的Bxb1整合酶位点，再通过筛选抗生素筛选和GFP(绿色荧光蛋白)整合实验，选择Bxb1整合酶位点拷贝数多的CHO-S细胞，通过测序获得Bxb1整合位点在CHO-S基因组中的位置，作为工程株。

下次构建稳转细胞株时，只需要将目的基因两边带上整合酶的位点，通过化学试剂转染，在整合酶的作用下，相同位点进行同源重组，可以定点整合至CHO-S细胞工程株的Bxb1整合位点中，1个月内可获得均一的稳转细胞株库。

相对传统的制备方法，此工程株可以缩短构建稳转细胞株的时间，提高构建稳转细胞株的成功率(约70％)，且获得的稳转细胞株均是高拷贝的，可以缩短大批量供货周期，减少成本；传统的制备方法由于是随机整合，整合位点不确定，本发明提供的方法获得的细胞株，可以通过测序获得Bxb1整合位点在CHO-S基因组中的位置，整合位点明确，质量稳定。

一方面，本发明提供一种CHO-S稳转细胞工程株，所述工程株包含Bxb1整合酶的整合位点和phiC31整合酶的整合位点。

进一步地，所述phiC31整合酶的整合位点序列如序列表中Seq ID NO.1所示，Bxb1整合酶的整合位点序列如序列表中Seq ID NO.2所示，所述工程株保藏编号为CCTCC NO：C2020246。所述工程株命名为CHO-JJ-9。本发明的CHO-S稳转细胞工程株CHO-JJ-9于2020年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2020246，分类命名为中国仓鼠卵巢细胞CHO-JJ-9，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学校内，邮政编码430072。

另一方面，本发明提供一种用于表达目的基因的CHO-S稳转细胞株，所述细胞株包含Bxb1整合酶的整合位点和phiC31整合酶的整合位点，还包括目的基因。

进一步地，所述目的基因与Bxb1整合酶的整合位点相连，所述目的基因为抗体基因；其中，phiC31整合酶的整合位点序列如序列表中Seq ID NO.1所示，Bxb1整合酶的整合位点序列如序列表中Seq ID NO.2所示。

进一步地，所述目的基因为抗H3 K18la的重链基因和轻链基因；其中，抗H3 K18la的重链基因的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.3所示，抗H3 K18la的轻链基因的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.4所示；所述CHO-S稳转细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2020245。所述CHO-S稳转细胞株可用于稳定表达抗H3 K18la基因，命名为CHO-JJ-9-H3K18la。本发明的CHO-S稳转细胞株CHO-JJ-9-H3K18la于2020年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2020245，分类命名为中国仓鼠卵巢细胞CHO-JJ-9-H3K181a，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学校内，邮政编码430072。

本发明所述的抗H3 K18la的基因片段是通过RT-PCR从兔子的B淋巴细胞中扩增获得，之后通过同源重组将片段构建到载体pcDNA3.4中。所获得的CHO-S稳转细胞株可用于表达抗H3 K18la的重链基因和轻链基因，即为识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株。

再一方面，本发明提供了一种CHO-S稳转细胞工程株的构建方法，包括以下步骤：利用phiC31整合酶将Bxb1整合酶的整合位点插入CHO-S细胞株。

进一步地，所述方法主要通过将含有Bxb1整合酶位点的质粒和含有phiC31整合酶的质粒通过共转的方法转入CHO-S细胞中。

进一步地，所述方法具体包括：

a)转染前一天将细胞调整至3x10

b)轻轻混匀8ul ExpiFectamine CHO转染试剂，将转染试剂稀释到100ul OptiPRO中；

c)将1ug含有phiC31整合酶的质粒和1ug含有Bxb1整合酶位点的质粒共同加入到中100ul OptiPRO培养基中，室温静置5分钟；

(d)将两者混合，室温静置10-20分钟，然后轻轻将混合物滴加到细胞中。

进一步地，所述方法还包括抗性基因筛选并挑选稳定单克隆株的步骤，和/或挑选最优表达量克隆的步骤，其中，phiC31整合酶的整合位点序列如序列表中Seq ID NO.1所示，Bxb1整合酶的整合位点序列如序列表中Seq ID NO.2所示。

进一步地，所述抗性基因筛选并挑选稳定单克隆株的步骤为：

Ⅰ)使用潮霉素进行筛选，获得细胞株；

Ⅱ)将步骤Ⅰ)获得的细胞株进行亚克隆。

进一步地，所述抗性基因筛选并挑选稳定单克隆株的步骤为：

Ⅰ)先将转染完成的细胞放入完全培养液中，培养48h后，将完全培养液更换为含有500-1000ug/ml的潮霉素筛选培养基中，并每隔2-3天更换一次培养液，其中所述的完全培养液为DMEM+10％FBS；

Ⅱ)2-3周后，调整细胞密度为0.5个细胞/孔，将细胞铺到96孔板中，3-4周后观察每个孔的情况，挑选明显有细胞增殖的孔，进行扩大培养。

进一步地，所述挑选最优表达量克隆的步骤为：

①将含有GFP的质粒和含有Bxb1整合酶的质粒共转染至步骤2)挑选的细胞株；

②进行抗生素筛选，根据荧光强度和稳转细胞数量确定最优表达量克隆，作为CHO-S稳转细胞工程株。

进一步地，所述挑选最优表达量克隆的步骤为：

①制备含GFP的质粒，并将此质粒和Bxb1整合酶质粒共转染步骤Ⅱ)挑选的CHO-S细胞；

②对转染完成的CHO-S细胞进行抗生素潮霉素和puromycin进行筛选，获得稳转细胞株，根据荧光强度和稳转细胞数量确定最优的克隆，作为CHO-S稳转细胞工程株。

进一步地，步骤Ⅱ)挑选的CHO-S细胞需为10个或10个以上。

荧光强度越强表示表达量越高，细胞数量越多，表示越稳定。

再一方面，本发明提供了一种用于表达目的基因的CHO-S稳转细胞株的构建方法，主要采用如上所述的方法，还包括将目的基因与含有Bxb1整合酶的质粒共转至CHO-S稳转细胞工程株，建立用于表达目的基因的CHO-S稳转细胞株。

进一步地，还包括对用于表达目的基因的CHO-S稳转细胞株的抗性筛选。

进一步地，所述抗性筛选具体方法为：将转染完成的细胞转至培养液中培养，48h后将完全培养液更换成含有10ug/ml的puromycin和800ug/ml的潮霉素筛选培养液，并每隔3-4天更换一次筛选培养液，直至细胞稳定增长。

进一步地，所属的筛选培养液中的puromycin和潮霉素的终浓度分别为10ug/ml和800ug/ml。

进一步地，将在筛选培养液中的细胞接种至完全培养液汇总继续培养2-3天，接种后，细胞密度为5x10

进一步地，所述目的基因为抗体基因。

进一步地，所述抗体基因为抗体的重链基因和轻链基因。

本发明提供的方法获得的稳转细胞株均是拷贝数较多的稳转细胞株，只需要将含有抗体重链基因和轻链基因的质粒按照瞬时转染的操作，即可在1个月内获得生产抗体的稳转细胞株。

进一步地，所述目的基因为抗H3 K18la的重链基因和轻链基因，其中，抗H3 K18la的重链基因的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.3所示，抗H3 K18la的轻链基因的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.4所示。

再一方面，本发明提供了一种通过识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株生产抗H3K18la抗体的方法，包括以下步骤：

⑴将如上所述的识别H3 K18la抗体稳转细胞株转移至摇瓶中，37℃环境中传代培养；

⑵扩大培养；

⑶待细胞密度达到1x10

⑷继续培养6-15天，培养液离心，滤膜过滤，获得细胞培养上清，纯化和洗脱上清，获得H3 K18la抗体。

进一步地，具体包括以下步骤：

⑴将如上所述的H3 K18la抗体稳转细胞株转移至含有50ml培养基的250ml的的摇瓶中，置于37℃，8％CO

⑵传代培养完成后，将细胞转移至较大体积的摇瓶中，细胞接种后初始密度要大于3x10

⑶待细胞密度达到1x10

⑷继续培养6-15天，收集培养液，离心并经过0.45um的滤膜过滤，获得细胞培养上清，纯化和洗脱上清，获得抗H3 K18la的抗体。

进一步地，步骤⑴中，至少传代2次，传代培养过程中细胞密度不能超过2x10

本发明的识别H3 K18la兔单克隆抗体CHO-S的产量(H3 K18la抗体)可以达到2.5g/L，是瞬时表达的8倍。

再一方面，本发明提供了Bxb1整合酶用于构建CHO-S稳转细胞株的用途，先将Bxb1整合酶的整合位点通过phiC31整合酶插入CHO-S细胞株，再将目的基因和Bxb1整合酶通过共转染至CHO-S细胞株，从而构建CHO-S稳转细胞株。

进一步地，所述目的基因为抗体基因。

进一步地，所述抗体基因为抗体的重链基因和轻链基因。

进一步地，所述CHO-S稳转细胞株为用于生产抗体的CHO-S稳转细胞株。

进一步地，所述生产抗体的CHO-S稳转细胞株为识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株，所述抗体的重链基因和轻链基因为抗H3 K18la的重链基因和轻链基因。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、传统方法构建稳转细胞株至少需要4个月，稳转效率仅为5％；本发明提供了一个CHO-S稳转细胞工程株，可以在一个月内获得CHO-S稳转细胞株，且稳转效率可达到70％左右；

2、传统方法由于是随机整合，整合位点不确定，本发明提供的方法可以通过测序获得Bxb1整合位点在CHO-S基因组中的位置，整合位点明确，质量稳定。

3、本发明提供的CHO-S稳转细胞株不需要进行亚克隆，可形成一个稳转细胞池，且细胞池中抗体表达量均比较高；

4、本发明提供的用于生产抗体的CHO-S稳转细胞株的抗体表达量是瞬时表达的8倍，不同生产批次间抗体产量稳定，抗体质量高。

5、获得的稳转细胞株均是高拷贝的，可以明显缩短大批量供货给工业客户的周期，减少成本。

附图说明

图1为实施例1中CHO-S稳转细胞工程株的构建方法流程图

图2为实施例1中CHO-S稳转细胞工程株的构建方法流程示意图

图3为实施例1中的抗性筛选过程中的细胞增殖情况对比图

图4为实施例1中的转染GFP蛋白表达量对比图

图5为实施例2中CHO-S稳转细胞株的构建方法与传统方法获得的细胞株的GFP转染FC检测对比图

图6为实施例4中CHO-S稳转细胞株的构建方法与传统方法获得的细胞株培养上清SDS-PAGE电泳结果对比图

图7为实施例5中获得纯化的H3 K18la抗体的WB检测结果图

图8为实施例5中获得纯化的H3 K18la抗体Dot检测抗体特异性结果图

图9为实施例5中获得纯化的H3 K18la抗体IHC检测抗体特异性结果图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。实施例中未注明具体条件者按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过市售购买获得的常规产品。

实施例1 CHO-S稳转细胞工程株的构建

本实施例提供的CHO-S稳转细胞工程株的构建方法如流程图(图1)和流程示意图(图2)所示，包括如下步骤：

步骤1)利用phiC31整合酶将Bxb1整合酶的整合位点插入CHO-S细胞株

a)转染前一天将细胞调整至3x10

b)轻轻混匀8ul ExpiFectamine CHO转染试剂，将转染试剂稀释到100ul OptiPRO中；

c)基因合成含有phiC31整合酶、Bxb1整合酶的整合位点的质粒，按照Omega中提试剂盒提取方法提取质粒，按照expiCHO-S transfection的方法，将1ug含有phiC31整合酶的质粒和1ug含有Bxb1整合酶位点的质粒共同加入到中100ul OptiPRO培养基中，室温静置5分钟；

(d)将两者混合，室温静置10-20分钟，然后轻轻将混合物滴加到细胞中。

步骤2)抗性基因筛选并挑选稳定单克隆株

Ⅰ)先将转染完成的细胞放入完全培养液中，培养48h后，将完全培养液更换为含有500-1000ug/ml的潮霉素筛选培养基中，优选为完全培养液+800ug/ml潮霉素的培养基中，并每隔2-3天更换一次培养液，其中所述的完全培养液为DMEM+10％FBS；

Ⅱ)2-3周后，细胞增殖情况如图3所示，其中图3左侧照片为细胞有一定增殖，图3右边照片为有明显增殖，使用胰酶将贴壁的阳性CHO细胞消化下来，使用有限稀释法，调整细胞密度为0.5个细胞/孔，将细胞铺到96孔板中，3-4周后观察每个孔的情况，挑选细胞生长较快的10个克隆进行扩大培养并冻存，10个克隆命名为CHO-JJ-1至CHO-JJ-10。

步骤3)转染GFP蛋白挑选最优表达量克隆

①制备含GFP的质粒，并将此质粒和Bxb1整合酶质粒按照expi CHO-Stransfection的方法共转染步骤2)挑选的10个CHO-S细胞；

②对转染完成的CHO-S细胞进行抗生素潮霉素和puromycin进行筛选，获得稳转细胞株，将10个克隆分别置于显微镜下观察，结果如图4所示，根据荧光强度和稳转细胞数量确定最优的克隆，挑选表达量高的克隆，我们发现克隆号为CHO-JJ-9的荧光强度和表达量为最优，CHO-JJ-9见图4左侧的照片，其中图4右侧的照片为其他表达量较低的克隆。选取CHO-JJ-9作为CHO-S稳转细胞工程株，并进行细胞保藏，保藏编号是C2020246。

实施例2本发明提供的CHO-S稳转细胞株的构建方法与传统方法的比较

本实施例分别按照实施例1提供的采用phiC31和Bxb1整合酶进行构建的方法获得CHO-JJ-9，以及未采用phiC31和Bxb1整合酶，仅随机瞬时转染含GFP的质粒进行构建获得的细胞株，培养2周后分别进行FC(流式细胞仪)检测，结果如图5所示，其中左图为阴性对照，中间图为采用实施例1提供的CHO-JJ-9的检测结果，转染表达率为96.1％，右图为采用瞬时转染获得的细胞株的检测结果，转染表达率为36.7％。将转染表达率除以最初筛选前的细胞总数，可以得出稳转效率，其中采用实施例1的方法稳转效率为75％，而采用随机瞬时转染稳转效率仅为4.5％。

实施例3识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株的构建

本实施例采用实施实例1获得的CHO-JJ-9工程株，通过抗H3 K18la的基因和Bxb1整合酶共转染，获得识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株，具体包括以下步骤，

(1)将抗H3 K18la重链片段和轻链片段的质粒和含有Bxb1整合酶的质粒共转染至工程株CHO-JJ-9中，其中抗H3 K18la的重链核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，抗H3 K18la的轻链核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。质粒的制备方法按照Omega转染质粒提取试剂盒提取，质粒转染步骤按照expi CHO-S transfection kit说明书进行。

(2)48h后换成含有10ug/ml的puromycin和800ug/ml的潮霉素进行培养，每隔2-3天更换一次培养基，2-3周后，即可获得稳转细胞株池。

(3)使用胰酶消化，转移至含有30ml CHO-S expression medium中125ml摇瓶中静止培养约一周。

(4)然后按照细胞密度0.5x10

实施例4识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株的构建方法与传统方法的比较

本实施例分别按照实施例3提供的识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株的构建方法，以及未采用phiC31和Bxb1整合酶，仅随机瞬时转染含抗H3 K18la的重链片段和轻链片段的质粒进行构建，获得的细胞株培养上清分别进行SDS-PAGE电泳结果，结果如图6所示，其中目标抗体为55KD和25KD，通道5和6为按照实施例3提供的方法构建的识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株上清，通道1、2、3、4、7、8都为随机瞬时转染含抗H3 K18la的重链片段和轻链片段的质粒构建的细胞株上清。再经分光光度计(Nanodropp)测定OD280数值来明确各通道细胞株上清中的抗体含量，结果如表1所示。

表1实施例3提供的方法与传统方法构建的细胞株上清中抗体含量

由表1可见，通道5和6(实施例3提供的识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株)的上清中抗体含量明显高于其他通道的细胞株；其他通道中，抗体含量最高的为7和8，通道1、2、3、4、7、8的平均值约为240ug/ml，通道5和6的细胞株约为平均值的8倍，可见采用实施例3提供的识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株的构建方法，获得的稳转细胞株上清的抗体表达量，可以达到传统方法获得的细胞株上清抗体表达量的8倍以上。

实施例5识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株生产抗H3 K18la抗体

本实施例采用实施例3获得的识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株，进一步获得抗H3K18la抗体，具体方法为：

(1)将实施例3获得的H3 K18la抗体稳转细胞株转移至含有50ml培养基的250ml的的摇瓶中，置于37℃，8％CO

(2)传代培养完成后，将细胞转移至较大体积的摇瓶中，细胞接种后初始密度要大于3x10

(3)培养48h后，用显微镜检测培养液中的细胞密度是否达到1x10

(4)继续培养6-15天(培养液中细胞密度最高可达到7-8x10

使用WB(Western Blot蛋白质印迹法)检测纯化的H3 K18la抗体，检测结果如图7所示，其中左边的通道为H3 K18la抗体检测HeLa细胞裂解液，右边的通道为H3 K18la抗体检测HeLa细胞加入sodium lactate诱导后制备的细胞裂解液检。组蛋白第18位乳酸化修饰在HeLa细胞中本身就有低水平的修饰，当加入诱导剂sodium lactate之后会诱导HeLa细胞产生更多的组蛋白的乳酸化修饰。从图7中可以看出，此条带大小在15kd左右，说明是此抗体识别的是组蛋白H3，而右边条带明显比左边条带强很多，说明此抗体识别的是组蛋白H3的乳酸化。

使用Dot blot(斑点印迹杂交)检测H3 K18la抗体的特异性，检测结果如图8所示，其中通道1-14所代表的多肽如表2所示，可见此抗体仅识别H3K18la这个多肽(即组蛋白H3第18位赖氨酸乳酸化修饰)，与其他多肽几乎没有交叉。

表2 Dot blot检测中各通道及对应的多肽

使用IHC检测H3 K18la抗体的特异性，检测结果如图9所示，此抗体识别经甲醛固定和石蜡包埋的人乳腺癌组织，其中A为用非乳酸化修饰的H3多肽和H3K18la抗体孵育2小时，B为经特异性肽(H3K18la)与H3K18la抗体孵育2小时。可见我们的抗体在非乳酸化修饰的H3多肽孵育后有明显的核染色，而经过H3K18la多肽特异阻断后，未见到核染色，可见经本实施例获得的H3 K18la抗体的确为H3 K18la抗体，特异性非常好。

虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

序列表

<110> 杭州景杰生物科技有限公司

<120> 一种识别H3 K18la兔单克隆抗体稳转细胞株及其构建方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatgggtgag gtggagtacg cgcccgggga gcccaagggc acgccctggc acccgcaccg 60

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtggtttgtc tggtcaacca ccgcggtctc agtggtgtac ggtacaaacc ca 52

<210> 3

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60

tcgctggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120

acagtctctg gattctccct cagtaactat ggaatagtct gggtccgcca ggctccaggg 180

aaggggctgg aatatatcgg aataataact atttttaatg tcatatccta cgcgacctgg 240

gtaaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc ccggccacgg tggatctgag aatgactggt 300

ctggcaatcg aggacacggc cacctacttc tgtgccagac atgctagtga tggctacata 360

tggggcccag gcaccctggt caccgtctcc tcagggcaac ctaaggctcc atcagtcttc 420

ccactggccc cctgctgcgg ggacacaccc agctccacgg tgaccctggg ctgcctggtc 480

aaagggtacc tcccggagcc agtgaccgtg acctggaact cgggcaccct caccaatggg 540

gtacgcacct tcccgtccgt ccggcagtcc tcaggcctct actcgctgag cagcgtggtg 600

agcgtgacct caagcagcca gcccgtcacc tgcaacgtgg cccacccagc caccaacacc 660

aaagtggaca agaccgttgc gccctcgaca tgcagcaagc ccacgtgccc accccctgaa 720

ctcctggggg gaccgtctgt cttcatcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 780

tcacgcaccc ccgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccaggatga ccccgaggtg 840

cagttcacat ggtacataaa caacgagcag gtgcgcaccg cccggccgcc gctacgggag 900

cagcagttca acagcacgat ccgcgtggtc agcaccctcc ccatcgcgca ccaggactgg 960

ctgaggggca aggagttcaa gtgcaaagtc cacaacaagg cactcccggc ccccatcgag 1020

aaaaccatct ccaaagccag agggcagccc ctggagccga aggtctacac catgggccct 1080

ccccgggagg agctgagcag caggtcggtc agcctgacct gcatgatcaa cggcttctac 1140

ccttccgaca tctcggtgga gtgggagaag aacgggaagg cagaggacaa ctacaagacc 1200

acgccggccg tgctggacag cgacggctcc tacttcctct acagcaagct ctcagtgccc 1260

acgagtgagt ggcagcgggg cgacgtcttc acctgctccg tgatgcacga ggccttgcac 1320

aaccactaca cgcagaagtc catctcccgc tctccgggta aatga 1365

<210> 4

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

acatttgctc aagtgctgac ccagactcca tcctccgtgt ctgcagctgc gggaggcaca 120

gtcaccatca attgccagtc cagtcagagt gtttatgagt ataatcgttt atcctggtat 180

cagcagaaac cagggcagcc tcccaagcaa ctgatctatg gtgcatccac tctggattct 240

ggggtcccat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac acttcactct caccattagc 300

gacctggaat gtgacgatgc tggcacttat tattgtgcag gcggttatag tggtaatatt 360

gattctttcg gcggagggac cgaggtggtc gtcaaaggtg atccagttgc acctactgtc 420

ctcatcttcc caccatctgc tgatcttgtg gcaactggaa cagtcaccat cgtgtgtgtg 480

gcgaataaat actttcccga tgtcaccgtc acctgggagg tggatggcac cacccaaaca 540

actggcatcg agaacagtaa aacaccgcag aattctgcag attgtaccta caacctcagc 600

agcactctga cactgaccag cacacagtac aacagccaca aagagtacac ctgcaaggtg 660

acccagggca cgacctcagt cgtccagagc ttcaataggg gtgactgtta g 711