一组子宫内膜容受性生物标志物、试剂盒及判断子宫内膜容受性的方法

摘要

本发明涉及一组子宫内膜容受性生物标志物、试剂盒及判断子宫内膜容受性的方法。该生物标志物可以为PCOS不孕患者的早期发现和诊断、靶向干预及指导胚胎移植提供一种高效、快捷、特异性强、敏感性高的检测评估手段；本发明的用于检测PCOS子宫内膜容受性的试剂盒，含有上述子宫内膜容受性标志物，可以为PCOS不孕症患者的早期发现和诊断提供一种高效、快捷、特异性强、敏感性高的检测评估手段。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一组子宫内膜容受性生物标志物、试剂盒及判断子宫内膜容受性的方法。

背景技术

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄期女性常见的一种生殖功能障碍与糖代谢异常并存的内分泌紊乱综合征，是引起无排卵性不孕的主要原因，而其子宫内膜状态的异常是导致不孕的另一个重要因素，也是PCOS不孕治疗困难的主要原因之一。

PCOS由环境和遗传等相关因素共同作用，雄激素过多、月经失调、排卵障碍是其重要特征，其临床表现、发病机制存在着极大的异质性。肥胖是导致不孕的一大因素，多数肥胖女性存在与排卵异常相关的不孕症，肥胖女性出现无排卵和卵巢多囊样的概率为35％～60％。有研究表明，肥胖PCOS患者存在更严重的腹型肥胖、高血压、胰岛素抵抗、血脂紊乱和高雄激素表现等，提示肥胖加重了PCOS患者内分泌和代谢紊乱的风险，而肥胖无排卵的女性在减重之后其排卵功能及妊娠率均明显好转，但是仍有部分患者减重后仍然无法成功妊娠，目前关于这部分患者的不孕病因尚不明确。

既往研究表明，肥胖型和非肥胖型PCOS患者的基础内分泌指标间存在差异，肥胖组的睾酮-雌激素结合球蛋白(SHBG)、黄体生成素(LH)、雌激素(E2)和孕酮(P)明显低于非肥胖组，但目前关于肥胖组与非肥胖组不孕的病因尚无明确报道，两者发病机制是否存在差异尚未阐明。

子宫内膜是雌孕激素作用的靶器官。PCOS患者由于长期不排卵或卵泡发育发育不佳引起黄体功能缺陷，导致子宫内膜长期受到雌激素的异常刺激，缺少孕激素的调节作用，子宫内膜因此表现出不同程度的增殖性改变，甚至发展为子宫内膜癌。子宫内膜容受性(endometrial receptivity,ER)是指子宫内膜对胚胎的接受能力，即允许胚胎黏附其上直至植入完成的特定阶段，具有严格的时空限制，一般仅为排卵后的6-10天，持续不到48小时。 PCOS患者机体复杂的内分泌和代谢的异常可导致子宫内膜容受性下降，促排卵治疗进一步加重子宫内膜的异常发育和容受性标志分子的异常表达，使胚胎种植率降低。目前提高PCOS患者受孕成功率亟待解决的关键问题是改善 PCOS患者子宫内膜的容受性。

因此，从子宫和内膜中探寻病因对疾病的预防和诊治具有重要临床意义。

评估PCOS患者子宫内膜状态的主要手段包括评估子宫内膜形态学指标和检测影响内膜容受性的调控因子，其中形态学指标包括超声指标和饱饮突等，而目前发现的影响内膜容受性的调控因子主要包括性激素及其受体、整合素、白血病抑制因子和同源框基因HOXA10等基因及因子。其中，整合素在细胞粘附中发挥重要作用，其表达量呈周期性变化，峰值出现时间与种植窗一致；白血病抑制因子是一中具有多重功效的细胞因子，能够诱导细胞增殖、分化、维持细胞生存等，在胚胎发育及移植中发挥重要作用，研究表明不孕女性宫腔冲洗液中白血病抑制因子的表达高于妊娠组；同源框基因参与调控基因的表达和控制器官发生与细胞分化；另外胰岛素样生长因子结合蛋白、表皮生长因子、基质金属蛋白酶等因子或蛋白均参与调控内膜容受性。尽管高分辨率经阴道多普勒超声评价子宫内膜状态具有无创、直观、实时、精确性高以及可重复等特点，但由于超声检测指标目前仍无明确定论、形态学指标评估主观性强、对评估者的经验要求高、且容易出现错误识别和漏辨等风险，因而超声检测在大规模不孕症内膜容受性筛查中受到极大限制。另外虽然影响内膜容受性的一些相关标志物陆续被发现甚至被应用于临床探索，但采用单一的容受性标志物检测准确率有限且特异性不高。也有研究将一些内膜容受性相关因子进行简单组合，在一定程度上解决了部分子宫内膜种植状态受损患者的临床问题，但由于疾病发展的个体化差异，尤其是PCOS 患者具有高度异质性，这些单指标检测的特异性和灵敏性受限，仍有许多未知的功能分子有待进一步挖掘与开发。

转录组学是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。因此转录组谱可以提供特定条件下某些基因表达的信息，并据此推断相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制。通过基于基因表达谱的分子标签，不仅可以辨别细胞的表型归属，还可以用于疾病的诊断。转录组学研究技术不仅可应用于临床疾病的分型和诊断，尤其是对原发性恶性肿瘤，通过转录组差异表达谱的建立，可以详细描绘出患者的生存期以及对药物的反应等；同时转录组学技术常被用于筛选不同样本间的差异表达基因，结合差异基因GO功能分析及KEGG Pathway分析等生物信息学分析手段来揭示样本间的差异，以解析造成样本间差异的分子机制。虽然此前有报道研究影响PCOS内膜容受性的分子，但都属于单一的标志物，检测通量较低、准确率有限。而采用多种生物标志物对PCOS内膜容受性进行判断，可以从细胞粘附、能量代谢、炎症反应等多个方面综合评价种植窗期子宫内膜的状态，并以此判断子宫内膜容受性。如检测到患者多种生物标志物中出现细胞粘附相关的生物标志物的异常表达，说明患者的子宫内膜的细胞粘附功能可能出现异常，进而影响其子宫内膜容受性。因此采用多种生物标志物评估子宫内膜容受性具有更高的准确率和精确度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一组子宫内膜容受性生物标志物、试剂盒及判断子宫内膜容受性的方法。

本发明提供一组子宫内膜容受性生物标志物，所述生物标志物在不同身体质量指数的PCOS不孕人群的子宫内膜的表达量具有显著差异。

进一步，所述生物标志物在PCOS不孕人群中身体质量指数小于25kg/m

进一步，包括至少4种上调基因和/或下调基因；所述上调基因在PCOS 不孕人群中身体质量指数大于或等于25kg/m

所述下调基因在PCOS不孕人群中身体质量指数大于或等于25kg/m

所述上调基因包括：

U1，LIF，gene ID为ENSG00000128342，基因注释为interleukin 6 familycytokine，中文名称为白血病抑制因子。

U2，HOXA13，gene ID为ENSG00000106031，基因注释为homeobox A13，中文名称为同源盒基因A13。

U3，MAP1A，gene ID为ENSG00000166963，基因注释为microtubule associatedprotein 1A，中文名称为微管相关蛋白1A。

U4，ANG，gene ID为ENSG00000214274，基因注释为angiogenin，中文名称为血管生成素。

U5，VEGFA，gene ID为ENSG00000112715，基因注释为vascular endothelialgrowth factor A，中文名称为血管表皮生长因子A。

U6，IGFBP3，gene ID为ENSG00000146674，基因注释为insulin like growthfactor binding protein 3，中文名称为胰岛素样生长因子结合蛋白3。

U7，IGFBP1，gene ID为ENSG00000146678，基因注释为insulin like growthfactor binding protein 1，中文名称为胰岛素样生长因子结合蛋白1。

U8，CSF1，gene ID为ENSG00000184371，基因注释为colony stimulating factor1，中文名称为集落刺激因子1。

U9，CSF3R，gene ID为ENSG00000119535，基因注释为colony stimulating factor3receptor，中文名称为集落刺激因子3受体。

U10，MUC16，gene ID为ENSG00000181143，基因注释为mucin 16,cell surfaceassociated，中文名称为黏蛋白16。

U11，MMP9，gene ID为ENSG00000100985，基因注释为matrix metallopeptidase9，中文名称为基质金属蛋白酶9。

U12，MMP1，gene ID为ENSG00000196611，基因注释为matrix metallopeptidase1，中文名称为基质金属蛋白酶1。

U13，MMP10，gene ID为ENSG00000166670，基因注释为matrix metallopeptidase10，中文名称为基质金属蛋白酶10。

U14，SELE，gene ID为ENSG00000007908，基因注释为selectin E，中文名称为选择素E。

U15，CDHR2，gene ID为ENSG00000074276，基因注释为cadherin related familymember 2，中文名称为钙黏素相关家族成员2。

U16，CDH13，gene ID为ENSG00000140945，基因注释为cadherin 13，中文名称为钙黏素13。

U17，CDH3，gene ID为ENSG00000062038，基因注释为cadherin 3，中文名称为钙黏素3。

U18，KRT36，gene ID为ENSG00000126337，基因注释为keratin 36，中文名称为角蛋白36。

U19，KRT38，gene ID为ENSG00000171360，基因注释为keratin 38，中文名称为角蛋白38。

U20，KRT7，gene ID为ENSG00000135480，基因注释为keratin 7，中文名称为角蛋白7。

U21，FGG，gene ID为ENSG00000171557，基因注释为fibrinogen gamma chain，中文名称为纤维蛋白原γ链。

U22，FGB，gene ID为ENSG00000171564，基因注释为fibrinogen beta chain，中文名称为纤维蛋白原β链。

U23，FGA，gene ID为ENSG00000171560，基因注释为fibrinogen beta chain，中文名称为纤维蛋白原α链。

U24，ANXA4，gene ID为ENSG00000196975，基因注释为annexin A4，中文名称为膜联蛋白A4。

U25，HSPB8，gene ID为ENSG00000152137，基因注释为heat shock proteinfamily B(small)member 8，中文名称为热休克蛋白家族B成员8。

U26，SPP1，gene ID为ENSG00000118785，基因注释为secreted phosphoprotein1，中文名称为分泌型磷酸蛋白1。

U27，DKK1，gene ID为ENSG00000107984，基因注释为dickkopf WNT signalingpathway inhibitor 1，中文名称为dickkopf-WNT信号通路抑制剂1。

U28，CXCL12，gene ID为ENSG00000107562，基因注释为C-X-C motif chemokineligand 12，中文名称为C-X-C基序趋化因子配体12。

U29，CXCL14，gene ID为ENSG00000145824，基因注释为C-X-C motif chemokineligand 14，中文名称为C-X-C基序趋化因子配体14。

U30，CXCL8，gene ID为ENSG00000169429，基因注释为C-X-C motif chemokineligand 8，中文名称为C-X-C基序趋化因子配体8。

U31，SOD2，gene ID为ENSG00000112096，基因注释为superoxide dismutase 2，中文名称为超氧化物歧化酶2。

所述下调基因包括，

D1，LIFR，gene ID为ENSG00000113594，基因注释为LIF receptor alpha，中文名称为白血病抑制因子受体。

D2，MAGED1，gene ID为ENSG00000179222，基因注释为MAGE family member D1，中文名称为黑色素瘤抗原基因家族成员D1。

D3，MAGEA11，gene ID为ENSG00000185247，基因注释为MAGE family member A11，中文名称为黑色素瘤抗原基因家族成员A11。

D4，HOXB4，gene ID为ENSG00000182742，基因注释为homeobox B4，中文名称为同源盒基因B4。

D5，HOXB9，gene ID为ENSG00000170689，基因注释为homeobox B9，中文名称为同源盒基因B9。

D6，HOXB3，gene ID为ENSG00000120093，基因注释为homeobox B3，中文名称为同源盒基因B3。

D7，EGF，gene ID为ENSG00000138798，基因注释为epidermal growth factor，中文名称为表皮生长因子。

D8，MUC6，gene ID为ENSG00000184956，基因注释为mucin 6, oligomeric mucus/gel-forming，中文名称为黏蛋白6。

D9，MUC7，gene ID为ENSG00000171195，基因注释为mucin 7, secreted，中文名称为黏蛋白7。

D10，MMP26，gene ID为ENSG00000167346，基因注释为matrix metallopeptidase26，中文名称为基质金属蛋白酶26。

D11，CALCR，gene ID为ENSG00000064989，基因注释为calcitonin receptor likereceptor，中文名称为降钙素受体样受体。

D12，VMAC，gene ID为ENSG00000187650，基因注释为vimentin typeintermediate filament associated coiled-coil protein，中文名称为波形蛋白型中间丝相关螺旋蛋白。

D13，KRT8，gene ID为ENSG00000170421，基因注释为keratin 8，中文名称为角蛋白8。

D14，KRT5，gene ID为ENSG00000186081，基因注释为keratin 5，中文名称为角蛋白5。

D15，KRT18，gene ID为ENSG00000111057，基因注释为keratin 18，中文名称为角蛋白18。

D16，KRT12，gene ID为ENSG00000187242，基因注释为keratin 12，中文名称为角蛋白12。

D17，FGL1，gene ID为ENSG00000104760，基因注释为fibrinogen like 1，中文名称为纤维蛋白原样1。

D18，AK4，gene ID为ENSG00000162433，基因注释为adenylate kinase 4，中文名称为腺苷酸激酶4。

D19，AK7，gene ID为ENSG00000140057，基因注释为adenylate kinase 7，中文名称为腺苷酸激酶7。

D20，HSPA4L，gene ID为ENSG00000164070，基因注释为heat shock proteinfamily A(Hsp70)member 4like，中文名称为热休克蛋白家族A (Hsp70)成员4样。

D21，TRH，gene ID为ENSG00000170893，基因注释为thyrotropin releasinghormone，中文名称为促甲状腺激素释放激素。

进一步，所述生物标志物的筛选方法为，通过RNA-Seq方法对不同身体质量指数的PCOS不孕人群的子宫内膜中的所有生物标志物基因的表达量进行测定和分析，并根据分析结果筛选在不同身体质量指数的PCOS不孕人群的子宫内膜中表达量绝对值差异倍数大的生物标志物，再由所述表达量绝对值差异倍数大的生物标志物中筛选出与子宫内膜容受性相关的生物标志物。

进一步，所述筛选方法包括如下步骤：

S1、样品采集，所述样品为PCOS不孕患者的子宫内膜组织。

S2、将样品进行分组，其中，由身体质量指数大于或等于25kg/m

S3、分别对所述BMI高组和所述BMI低组的样品中所有生物标志物的基因进行RNA-Seq测定和分析，各生物标志物的表达量在两组样品中的差异倍数。

S4、在表达量绝对值差异倍数大于或等于2倍的生物标志物中，根据各生物标志物的特性，筛选出与子宫内膜容受性相关的一组生物标志物。

进一步，所述试剂盒中含有如上所述的一组子宫内膜容受性生物标志物。

进一步，含有4～5种代表生物标志物，所述代表生物标志物的筛选方式为，将所述一组PCOS子宫内膜标志物中每一个生物标志物根据其在不同身体质量指数人群中表达的差异倍数绝对值及其具体生物学功能进行权重，其中，权重高的为代表生物标志物。

本发明提供一种判断不同身体质量指数PCOS不孕人群的子宫内膜容受性的方法，使用如上述用于检测子宫内膜容受性的试剂盒进行判断，包括如下步骤：

1)检测一定样本量的不同身体质量指数范围的正常妊娠女性的子宫内膜的所述试剂盒中的生物标志物的表达量，计算得到所述试剂盒中的生物标志物在该身体质量指数范围的正常表达量参考值范围；

2)采用所述试剂盒检测患者的子宫内膜中对应的所述生物标志物的表达量；

3)将所述步骤2)中得到所述生物标志物的表达量与所述步骤1)中对应的参考值范围进行对比，其中，对比方式为，将相同身体质量指数范围的患者测得的生物标志物表达量和正常表达量的参考值范围进行对比；

当所述生物标志物的表达量在所述参考值范围内时，则判断该患者的子宫内膜容受性良好；当所述生物标志物的表达量在所述参考值范围之外时，则判断该患者的子宫内膜容受性差。

附图说明

图1为本发明技术路线图；

图2为本发明不同BMI的PCOS子宫内膜差异表达基因热图；

图3为本发明一组PCOS子宫内膜容受性的生物标志物的差异表达基因的热图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明的一组子宫内膜容受性生物标志物，在不同身体质量指数的PCOS 不孕人群的子宫内膜的表达量具有显著差异。上述不同身体质量指数是指根据患者的身体质量指数(BMI)将患者分组，而一组子宫内膜容受性生物标志物的表达量差异是指在上述不同的分组之间具有的差异；同时，具有显著差异的判断具体需要通过统计学进行判断，通常当表达量的差异大于或等于 1倍时认为具有显著差异。

不同的生物标志物在不同的身体质量指数BMI的患者的子宫内膜的表达量具有很大差异，因此不能通过简单的检测某种或某些差异基因的表达量的绝对值而判断其表达量的高低，也就是说，作为生物标志物的差异基因在不同BMI患者的子宫内膜的表达量是与该患者的BMI值相关的，某种或某些差异基因在一患者的子宫内膜的表达量绝对值高于另一患者的表达量，但由于两者的BMI值不同，并不能直接判断表达量高的患者其子宫内膜容受性一定良好，这也是为什么一些BMI值高的患者减重之后仍然无法成功妊娠的原因。

通过转录组学分析(RNA-Seq)可得到一组与子宫内膜状态相关的生物标志物，以解决现有技术的不足。

因此，本申请拟通过RNA-Seq技术检测不同身体质量指数(body mass index,BMI)的PCOS不孕人群子宫内膜的基因表达谱，以差异倍数(fold change,FC)和P值(p-value)来筛选不同比较组间的差异基因，进一步验证并筛选出一组评估不同BMI的PCOS不孕人群子宫内膜容受性的相应标志物，这些生物标志物可用于准确判断不同PCOS不孕人群的子宫内膜容受性。

本发明的有益效果在于，提供一组PCOS子宫内膜容受性的生物标志物，可以为PCOS不孕患者的早期发现和诊断、靶向干预及指导胚胎移植提供一种高效、快捷、特异性强、敏感性高的检测评估手段；本发明首次通过RNA-Seq 转录组学技术筛选在BMI高组和BMI低组PCOS子宫内膜中差异表达的内膜容受性基因，为PCOS子宫内膜容受性标志物的筛选开辟了一条新的途径，为PCOS不孕症患者的早期发现和诊断提供一种高效、快捷、特异性强、敏感性高的检测评估手段；本发明的用于检测PCOS子宫内膜容受性的试剂盒，含有上述子宫内膜容受性标志物，可以为PCOS不孕症患者的早期发现和诊断提供一种高效、快捷、特异性强、敏感性高的检测评估手段。

实施例

本实施例为本发明的一组PCOS子宫内膜容受性的生物标志物的筛选方法，具体步骤如下：

步骤1：采集样品

对不孕患者黄体中期的子宫内膜进行子宫内搔刮，具体包括如下：

在患者的黄体期(LH)的第7-9天，使用一次性子宫内膜取样管进行内膜取样，具体的取样步骤为：

冲洗消毒：用0.1％安多福冲洗外阴，阴道2遍；

放入窥器：将窥器闭合式放入阴道，再撑开窥器，暴露宫颈，固定；

取样：将取样管从宫颈放入宫腔，按患者子宫位置调整角度，到达宫底后将取样管针芯向外拉至宫颈口位置，取样管前后拉动抽吸组织，大约6-8mm 即可，取出取样管；将取出的内膜组织放入已装有生理盐水的皿中。

本实施例中，患者年龄小于等于40岁。

步骤2：对子宫内膜样品进行分组

收集不孕患者子宫内膜样品后按照如下依据进行分组：

1)根据多囊卵巢综合征诊断标准(2003年Rotterdam诊断标准)，在步骤1中得到的样品中筛选出多囊卵巢综合征的内膜样品；

2)将多囊卵巢综合征的内膜样品按照患者的身体质量指数(BMI)分为 BMI高组和BMI低组；其中，根据WHO规定，BMI高组为BMI≥25kg/m

其中，多囊卵巢综合征的内膜样品的入选标准为：符合以下三项中的任何两项，即可判定为PCOS：高雄激素的临床或者生化改变；稀发排卵或者无排卵；超声发现卵巢呈多囊样改变。

排除标准为：患者患有染色体异常、地中海贫血、发生病毒感染、宫内死亡、死胎及异位妊娠等不良妊娠结局、盆腔黏连任一疾病；BMI数据不全；其他原因引起的胰岛素抵抗。

上述入选标准和排除标准是要同时满足的，也就是说若满足排除标准中的任一项则不入选。

根据上述入组标准，本实施例共招募多囊卵巢综合征患者12例，其中 BMI高组6例、BMI低组6例，患者基本信息如表1所示：

表1患者基本信息

步骤3：对多囊卵巢综合征的内膜样品RNA-Seq检测

具体步骤如下：

1)RNA提取与检测：将多囊卵巢综合征的子宫内膜样品进行总RNA (total RNA)提取，并对提取后的total RNA进行RAN完整性及纯度分析，包括琼脂糖凝胶电泳分析样品RNA完整性及是否存在DNA污染。

其中，采用NanoPhotometer spectrophometer检测RNA纯度；采用Qubit2.0Fluorometer对RNA浓度进行精确定量；采用Agilent 2100bioanalyzer 精确检测RNA完整性。

2)文库构建与质检：建库起始RNA为total RNA，总量≥1μg。建库中使用的建库试剂盒为Illumina的

3)上机测序：库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina测序，并产生150bp配对末端读数。测序的基本原理是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)。在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。

4)数据分析：高通量测序仪测得的图像数据经转换后进行质控分析、序列比对、新转录本预测、基因表达水平定量、差异表达分析、差异基因富集分析、差异基因蛋白网络互作分析、可变剪切分析以及SNP分析，具体分析步骤如下：

a.数据质控：测序片段被高通量测序仪测得的图像数据经CASAVA碱基识别转化为序列数据(reads)，文件为fastq格式，其中主要包含测序片段的序列信息以及其对应的测序质量信息。测序获得的原始数据中包含少量带有测序接头或测序质量较低的reads。为了保证数据分析的质量及可靠性，需要对原始数据进行过滤。主要包括去除带接头(adapter)的reads、去除含N(N表示无法确定碱基信息)的reads、去除低质量reads(Qphred≤20 的碱基数占整个read长度的50％以上的reads)。同时，对clean data进行 Q20，Q30和GC含量计算。后续所有分析均是基于clean data进行的高质量分析。

b.序列比对到参考基因组

直接从基因组网站下载参考基因组和基因模型注释文件。使用HISAT2 v2.0.5构建参考基因组的索引，并使用HISAT2 v2.0.5将配对末端clean reads与参照基因组比对。我们选择HISAT2作为比对工具，因为HISAT2可以基于基因模型注释文件生成拼接连接的数据库，因此比其他非拼接比对工具有更好的比对效果。

c.新转录本预测:采用StringTie(Mihaela Pertea.et al.2015)进行新基因预测。StringTie应用网络流算法以及可选的从头组装来拼接转录本。

d.基因表达水平定量:featureCounts用于计算映射到每个基因的读数。然后根据基因的长度计算每个基因的FPKM，并计算映射到该基因的读数。 FPKM指每百万碱基对测序的转录本序列片段的每千碱基片段的预期数量。

e.差异表达分析:使用DESeq2 R软件(1.16.1)进行两个比较组合之间的差异表达分析(每个组两个生物学重复)。DESeq2提供了统计程序，用于使用基于负二项式分布的模型来确定数字基因表达数据中的差异表达。使用 Benjamini和Hochberg的方法来调整所得P值以控制错误发现率。通过 DESeq2发现调整的P值<0.05的基因被分配为差异表达的。(对于没有生物学重复的采用edgeR)在进行差异基因表达分析之前，对于每个测序文库，通过一个比例归一化因子通过edgeR程序包调整读取计数。两个条件的差异表达分析使用edgeRR软件包(3.18.1)进行。使用Benjamini&Hochberg 方法调整P值。校正后的P值以及|log2foldchange|作为显著差异表达的阈值。

f.差异基因富集分析:通过clusterProfiler R软件实现差异表达基因的GO富集分析，其中修正了基因长度偏差。考虑具有小于0.05的校正的P 值的GO term通过差异表达基因显著富集。

g.差异基因蛋白网络互作分析:差异表达基因的PPI分析基于已知和预测蛋白质-蛋白质相互作用的STRING数据库。对于数据库中存在的物种，我们通过从数据库中提取目标基因列表来构建网络；否则，使用diamond (0.9.13)将目标基因序列与选择的参考蛋白序列进行比对，然后根据所选参考物种的已知相互作用建立网络。

h.可变剪切分析:选择性剪接是调控基因表达和蛋白质变量的重要机制。使用rMATS(3.2.5)软件分析AS事件，主要包括SE、RI、MXE、A5SS、 A3SS五种可变剪接事件。

i.SNP分析:使用GATK软件对样本数据进行变异位点分析，并用SnpEff 软件对变异位点进行注释。

经过RNA-Seq检测与数据分析，得到结果如下：

与BMI高组相比，BMI低组中鉴定到的表达量的绝对值差异在2.0倍以上的内膜差异基因共3291个，其中上调基因2020个，下调基因1271个，图2为上述差异基因热图。

步骤4：对步骤3中得到的差异基因进行筛选，筛选出一组能够反映BMI 高组和BMI低组的内膜状态的差异性特征的生物标志物，该组生物标志物包括52个差异基因，其中上调基因31个(U1～U31)，下调基因21个(D1～D21)，具体的基因及表达量比值如表2所示，图3为上述一组子宫内膜容受性生物标志物的差异基因表达热图。

其中，上调基因是指在身体质量指数大于或等于25kg/m

表2一组子宫内膜容受性生物标志物及其在BMI高组和BMI低组的表达量绝对值的比值的对数值

由于目前的技术手段无法直接检测和提取与子宫内膜容受性相关的生物标志物，因此需要通过本发明的筛选方法，先对子宫内膜的所有差异基因进行检测，再通过各生物标志物已知的特性，筛选出差异基因中与子宫内膜容受性相关的生物标志物。

本发明提供的一种用于检测子宫内膜容受性的试剂盒中含有上述的一组子宫内膜容受性生物标志物。

将上述一组PCOS子宫内膜标志物中每一个生物标志物根据其在不同身体质量指数人群中表达的差异倍数及其具体生物学功能进行权重，其中，权重高的为代表生物标志物，将其中的4～5种代表生物标志物组合后得到上述试剂盒，该试剂盒可用于检测PCOS不孕患者的子宫内膜容受性。

具体生物学功能是指在实际应用中进一步检测对不孕患者的症状影响更大；具体的权重方式有待于针对每个具体的生物标志物进行进一步分析。

该试剂盒说明及使用方法包括如下步骤：

1)检测一定样本量的不同身体质量指数范围的正常妊娠女性的子宫内膜的所述试剂盒中的生物标志物的表达量，计算得到所述试剂盒中的生物标志物在该身体质量指数范围的正常表达量参考值范围；

2)采用所述试剂盒检测患者的子宫内膜中对应的所述生物标志物的表达量；

3)将所述步骤2)中得到所述生物标志物的表达量与所述步骤1)中对应的参考值范围进行对比，其中，对比方式为，将相同身体质量指数范围的患者测得的生物标志物表达量和正常表达量的参考值范围进行对比；

当所述生物标志物的表达量在所述参考值范围内时，则判断该患者的子宫内膜容受性良好；当所述生物标志物的表达量在所述参考值范围之外时，则判断该患者的子宫内膜容受性差。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。