一种苯海拉明胶体金检测试纸条及其试剂盒

摘要

本发明公开了一种苯海拉明胶体金检测试纸条，包含底板，底板上依次铺设的样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜及吸水纸、卡壳；所述硝酸纤维素膜上标记有检测线及质控线，所述结合垫上设有苯海拉明的胶体金标记抗体，所述胶体金标记抗体由胶体金及苯海拉明单克隆抗体偶联而成。本发明的试纸条快速、准确、灵活机动，适合现场监督检测苯海拉明，可在短时间内快速准确地检测出样品是否含有苯海拉明，以确定苯海拉明是否非法添加。适用于凉茶及饮料/化妆液/中成药等生产企业用于质控检测或政府检测机构用于上述消费品的监督检查。本发明与现有技术相比，具有检测灵敏度高、检测准确度高、操作方便快捷、检测成本低廉等特点。

说明书

技术领域

本发明属于胶体金检测技术领域，具体涉及一种苯海拉明胶体金检测试纸条及其试剂盒。

背景技术

苯海拉明是一种乙醇类抗组胺药，其主要具有抗过敏、镇吐、镇咳、镇静等功效。因此苯海拉明可能会添加在功能性化妆品中用于祛痘、抗过敏、治疗蚊虫叮咬等，及添加在功能性饮料或感冒类的中成药中用以止咳平喘，其作为药品用于防治或治疗疾病时的儿童口服起效剂量为12.5mg/次，成人口服起效剂量为25mg/次。苯海拉明作为第一代抗组胺药物，其本身在治疗疾病的时候也会产生很多副作用，如中枢神经抑制、恶心、食欲不振、胸闷、过敏性休克、痉挛等。消费者在不知情情况下接触(口服或皮肤涂抹)苯海拉明会对身心造成不利影响，甚至危害消费者的生命。我国化妆品卫生规范(2015版)已将苯海拉明列为禁用物质，在食品或药品中非法添加苯海拉明更是一种违法行为。因此为了加强对凉茶及饮料/化妆液/中成药(胶囊制剂)中这种药物的监控，建立一种准确、便捷的苯海拉明非法添加快速检测方法很有必要。苯海拉明快速检测试剂盒是针对凉茶及饮料/化妆液/中成药(胶囊制剂)等中非法添加的苯海拉明进行检测，整个检测过程只需要10～15分钟，适用于现场及实验室快速检测。

现有实验室检测技术具有灵敏度低、耗时长及不够机动等技术缺陷。常用实验室检测苯海拉明非法添加的方法为液相色谱法或液质联用色谱法，两种方法均存在样品前处理及检测时间长，且均不方便用于现场监督检测。液相色谱法同时存在检测灵敏度低的不足之处，液质联用检测方法虽然灵敏度高，但是对样品前处理方法要求也高，否则易造成质谱污染影响检测结果或直接对质谱仪器造成损害。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供一种试纸条。

本发明的第二个目的在于，提供一种试剂盒。

本发明的第三个目的在于，提供上述试纸条的制备方法。

本发明的第四个目的在于，提供上述试纸条在检测苯海拉明中的应用。

本发明的第五个目的在于，提供上述试剂盒在检测苯海拉明中的应用。

本发明的第六个目的在于，提供一种检测苯海拉明的方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种试纸条，包含底板和卡壳，底板上依次铺设的样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜及吸水纸；所述硝酸纤维素膜上标记有检测线及质控线，所述结合垫上设有苯海拉明的胶体金标记抗体，所述胶体金标记抗体由胶体金及苯海拉明单克隆抗体偶联而成。

根据本发明的第一个方面，所述检测线上为能与苯海拉明单克隆抗体结合的苯海拉明偶联抗原。

根据本发明的第一个方面，所述检测线上为能与苯海拉明单克隆抗体结合的兔抗鼠二抗。

本发明的第二个方面，提供一种试剂盒，包含本发明第一个方面所述试纸条。

根据本发明的第二个方面，所述试剂盒还包含稀释液、干燥剂和滴管。

根据本发明的第二个方面，所述稀释液为PBST缓冲液。

本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述试纸条的制备方法，包含以下步骤：

S1：胶体金标记单克隆抗体的制备：调节胶体金溶液pH值至7～9，搅拌后逐滴加入苯海拉明的单克隆抗体，0.5～1.5h后加入抗体质量相当的BSA溶液，充分反应20～40min后继续搅拌20～40min。离心获得均一性金标抗体沉淀，再加稀释液重悬备用；

S2：在底板上，沿同一方向依次将样品垫、结合垫，喷涂有苯海拉明-BSA的检测线和兔抗鼠二抗的质控线的硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接粘连；结合垫里涂满了胶体金标记苯海拉明单克隆抗体，干燥，切条，装入塑料卡壳的底盖，然后盖上上盖。

根据本发明的第三个方面，所述胶体金的制备方法为：取0.5～1.5％氯金酸溶液0.5～2mL，加90～100mL超纯水成终浓度0.01～0.03％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1～3％柠檬酸三钠1～2.5mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热20～40min，室温冷却，补充失水至原体积。

根据本发明的第三个方面，步骤S1中所述离心的转速为8000～10000g，离心时间为20～40min。

优选地，根据本发明的第三个方面，步骤S1中所述离心的转速为9000g，离心时间为30min。

根据本发明的第三个方面，所述BSA溶液是将0.5～1.5g BSA均匀溶解在9.5～8.5g超纯水中配制而成。

根据本发明的第三个方面，所述0.1～0.15mol/L PBST溶液是由50～75mL0.2mol/L的PB溶液、0.1mL吐温-20及0.82g NaCl混匀溶解后，用超纯水定容到100mL配制而成。

根据本发明的第三个方面，步骤S2中所述检测线是由能与苯海拉明单克隆抗体结合的苯海拉明偶联抗原在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样制得。

根据本发明的第三个方面，步骤S2中所述质控线是由能与苯海拉明单克隆抗体结合的兔抗鼠抗体进行线性点样制得。

本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述试纸条在检测苯海拉明中的应用。其原理为当胶体金标记的抗苯海拉明单抗过量时，多余的单抗泳动到检测线，与苯海拉明偶联抗原结合并显色；而与检测物结合的胶体金标记的抗苯海拉明多抗，其T区结合位点被检测物质占据，只能跨越检测线泳动到质控线以C区位点与兔抗鼠IgG抗体非特异性结合，同检测线进行比色而得到检测结果。其中T线显色比C线深或一样深，表明样品中苯海拉明浓度低于检测限量值或无苯海拉明残留。T线显色比C线浅，表明样品中苯海拉明浓度高于检测限量值；T线比C线越浅，表明样品中苯海拉明浓度越高。无效：质控区未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的检测卡重新测试。

本发明的第五个方面，提供本发明第二个方面所述试剂盒在检测苯海拉明中的应用。通过T线和C线的显色来判定苯海拉明含量，其中检测T线显色比质控C线深或一样深，表明样品中苯海拉明浓度低于检测限量值或无苯海拉明残留；检测T线显色比质控C线浅，表明样品中苯海拉明浓度高于检测限量值；检测T线比质控C线越浅，表明样品中苯海拉明浓度越高；质控区未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏，应重新测试。

本发明的第六个方面，提供一种检测苯海拉明的方法，包括以下步骤：

使用本发明第一个方面所述试纸条或本发明第二个方面所述试剂盒进行样本检测，具体为吸取100μL(3～4滴)待测样本逐滴加到加样孔中，5～8min内进行结果判读；检测T线显色比质控C线深或一样深，表明样品中苯海拉明浓度低于检测限量值或无苯海拉明残留；检测T线显色比质控C线浅，表明样品中苯海拉明浓度高于检测限量值；检测T线比质控C线越浅，表明样品中苯海拉明浓度越高；质控区未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏，应重新测试。

本发明的有益效果是：

本发明可提供一种快速、准确、灵活机动，适合现场监督检测苯海拉明的苯海拉明快速检测试纸条及包含该试纸条的试剂盒，应用层析式免疫胶体金原理，通过试纸中检测线与质控线比色来检测样品中的苯海拉明，可在短时间内快速准确地检测出样品是否含有苯海拉明，以确定苯海拉明是否非法添加。

本发明在凉茶及饮料/化妆液/中成药(胶囊制剂)的检测中假阳性率和假阴性率为0％，说明检测结果可靠，可以为凉茶及饮料/化妆液/中成药(胶囊制剂)等生产企业用于质控检测或政府检测机构用于上述消费品的监督检查。本发明中试纸条的灵敏度可达5mg/kg，CV值小于15％。对苯海拉明的特异性较好，对不同类型氨基醚类化合物的交叉反应少，在1年时间内产品品质无明显变化，与现有技术相比，具有检测灵敏度高、检测准确度高、操作方便快捷、检测成本低廉等特点。

附图说明

图1为本发明苯海拉明胶体金检测试纸条的检测结果判断图。

图2为本发明苯海拉明胶体金检测试纸条的结构示意图。

图3为以凉茶为样本检测实施例1中苯海拉明胶体金检测试纸条假阳性率的结果图。

图4为以化妆液为样本检测实施例1中苯海拉明胶体金检测试纸条假阴性率的结果图。

图5为以中成药(胶囊制剂)为样本检测实施例1中苯海拉明胶体金检测试纸条假阴性率的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例与附图进一步说明本发明的技术方案。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的试剂原料。除非特别说明，下述实施例中使用的系统为本领域常规使用的设备。

本发明检测原理是利用样品垫形成的毛细管虹吸效应，使被检测物质首先与胶体金标记的抗苯海拉明单抗发生竞争形式的结合，其后果是，当胶体金标记的抗苯海拉明单抗过量时，多余的单抗泳动到检测线，与苯海拉明偶联抗原结合并显色；而与检测物结合的胶体金标记的抗苯海拉明多抗，其T区结合位点被检测物质占据，只能跨越检测线泳动到质控线以C区位点与兔抗鼠IgG抗体非特异性结合，同检测线进行比色而得到检测结果。

具体检测结果判定如图1所示。

结果判定规则：

阴性(一)：T线(检测线，靠近加样孔一端)显色比C线(对照线)深或一样深，表明样品中苯海拉明浓度低于检测限量值或无苯海拉明残留。

阳性(+)：T线显色比C线浅，表明样品中苯海拉明浓度高于检测限量值；T线比C线越浅，表明样品中苯海拉明浓度越高。

无效：质控区(C)未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的检测卡重新测试。

实施例1苯海拉明胶体金检测试纸条的制备

1.胶体金的制备

取1％氯金酸溶液2mL，加98mL超纯水成终浓度0.02％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取2％柠檬酸三钠1.2mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热30min，室温冷却，补充失水至原体积。

2.胶体金标记单克隆抗体的制备

胶体金标记单克隆抗体的制备，调节胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌10min，10min后逐滴加入苯海拉明的单克隆抗体，1h后加入抗体质量10倍的10％BSA，充分反应30min，继续搅拌30min。在10000g下离心30min获得均一性金标抗体沉淀，再加0.1mol/LPBST重悬备用。

3.苯海拉明快速检测试纸条的制备

在底板上，沿同一方向依次将样品垫、结合垫，喷涂有苯海拉明-BSA(检测线)和兔抗鼠IgG(质控线)的硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接粘连；结合垫里涂满了胶体金标记苯海拉明单克隆抗体，干燥；切条，装入塑料卡壳的底盖，然后盖上上盖，试纸条的结构如图2所示。

实施例2苯海拉明胶体金检测试剂盒的制备

将实施例1中的试纸条进一步组装成试剂盒，其中试剂盒还包含稀释液、干燥剂和滴管。其中稀释液为PBST缓冲液。

实施例3检测苯海拉明胶体金检测试纸假阳性率

假阳性率是考察胶体金试纸条检测准确度非常重要的指标之一，假阳性率越低表明胶体金试纸条检测结果越可靠。本实施例以凉茶为样本来检测苯海拉明胶体金检测试纸条假阳性率。

通过30批阴性凉茶样品的检测对实施例1中制备的苯海拉明胶体金试纸条检测结果的准确性进行考察。

凉茶样品均为市面店铺购买获得，包括特效感冒茶、风寒化痰止咳茶、凉茶王、咽喉消痛茶、泻火排毒茶、感冒茶、喉痛茶、止咳茶、清热解毒茶、寒咳茶、外感茶、咽喉肿痛差、清热茶、感冒茶王、牙痛茶等。所有样品均通过标准检验方法《凉茶中马来酸氯苯那敏等6种化学成分的检测方法》进行检测并确定均不含有苯海拉明化学成分非法添加。

30批凉茶阴性样品，每批取样品0.5g，用10mL稀释液上下颠倒混匀，形成A液；取100μL A液与900μL稀释液混匀，形成待测液B液。用一次性滴管吸取100μL(3～4滴)B液逐滴加到加样孔中，5～8min内进行结果判读，其他时间结果判读无效。

样品检测结果见图3，可以看出样品经苯海拉明试纸条测试后均显示阴性，假阳性率为0。说明实施例1中制备的试纸条的检测结果可靠。

实施例4检测苯海拉明胶体金检测试纸假阴性率

假阴性率是考察胶体金试剂盒检测准确度非常重要的指标之一，假阴性率越低表明胶体金试剂盒检测结果越可靠。本实施例分别通过30批阴性化妆液和30批阴性中成药(胶囊制剂)的加标阳性样品的检测对苯海拉明胶体金试剂盒检测结果的准确性进行考察。

1)以化妆液为样本检测苯海拉明胶体金检测试纸条假阴性率

通过30批阴性化妆液加标阳性样品的检测对实施例1中制备的苯海拉明胶体金试纸条检测结果的准确性进行考察。

阴性化妆液样品均为网络购物平台购买获得，包括泊泉雅清透皙润水光素颜爽肤水、曼秀雷敦乐肤洁抗痘护理爽肤液、润皇清痘净肤收敛水、泊舒紫苏清颜修护水、露兰姬娜茶树油清痘润肤祛痘水、杰威尔男士绿茶多酚抗痘爽肤水、漫野马鞭草酮迷迭香纯露、芳丹薄罗迷迭香清肌纯露、修正抗痘植萃调理水、DR PLANT绿茶祛痘净透爽肤水、BEDOOK祛痘爽肤水等。所有样品均通过标准检验方法《凉茶中马来酸氯苯那敏等6种化学成分的检测方法》进行检测并确定均不含有苯海拉明化学成分非法添加。

30批阴性化妆液加标阳性样品(加标量1g/kg)，每批取样品0.5g，用10mL稀释液上下颠倒混匀，形成A液；取100μLA液与900μL稀释液混匀，形成待测液B液。用一次性滴管吸取100μL(3～4滴)B液逐滴加到加样孔中，5～8min内进行结果判读，其他时间结果判读无效。

样品检测结果见图4，可以看出样品经苯海拉明试纸条测试后均显示阳性，假阴性率为0。

2)以中成药(胶囊制剂)为样品检测苯海拉明胶体金检测试纸条假阴性率

通过30批阴性中成药(胶囊制剂)加标阳性样品的检测对实施例1中制备的苯海拉明胶体金试纸条检测结果的准确性进行考察。

阴性中成药(胶囊制剂)样品均为网络购物平台购买获得，包括神丹枇杷止咳胶囊、葵花川贝雪梨胶囊、桂龙咳喘宁胶囊、修正橘红枇杷胶囊、三金蛤蚧定喘胶囊、雪丹咳灵胶囊、方心上医清肺意火胶囊、好医生桑姜感冒胶囊、济药苓桂咳喘宁胶囊、制克牛黄蛇胆川贝胶囊等。所有样品均通过标准检验方法《凉茶中马来酸氯苯那敏等6种化学成分的检测方法》进行检测并确定均不含有苯海拉明化学成分非法添加。

30批阴性中成药(胶囊制剂)加标阳性样品(加标量4g/kg)，每批取样品0.5g，用10mL稀释液上下颠倒混匀，形成A液；取100μL A液与900μL稀释液混匀，形成待测液B液。用一次性滴管吸取100μL(3～4滴)B液逐滴加到加样孔中，5～8min内进行结果判读，其他时间结果判读无效。

样品检测结果见图5，可以看出样品经苯海拉明试纸条测试后均显示阳性，假阴性率为0。

说明实施例1中制备的试纸条的检测结果可靠。

实施例5苯海拉明快速检测试纸条的灵敏度

经检测实施例1中苯海拉明快速检测试纸条的灵敏度可达5mg/kg，CV值小于15％。

实施例6苯海拉明快速检测试纸条的特异性实验

在阴性的凉茶及饮料/化妆液/中成药(胶囊制剂)0.5g样品中，分别加入苯海拉明50ppb，司他斯汀500ppb，氯马斯汀500ppb。实验结果发现苯海拉明能够检出，而加入司他斯汀和氯马斯汀的样品无法检出，说明本检测装置对苯海拉明的特异性较好，对不同类型氨基醚类化合物的交叉反应少，说明实施例1中制备的试纸条特异性好。

实施例7苯海拉明快速检测试纸条的保质期实验

用三批常规生产的产品分别做保质期实验，放置于室内室温环境，每隔1个月取12个装置，用质控样本检测，分别做阴性，5μg/g，10μg/g和15μg/g样品，重复三次，观察数据变化，考察保质期时间。阴性显色从13个月开始下降，在1年时间内产品品质无明显变化，因此确定保质期为1年。说明实施例1中制备的试纸条稳定性好。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。