用ICOS结合蛋白和精氨酸甲基转移酶抑制剂的组合疗法

摘要

本公开提供了治疗有此需要的人中的癌症的方法，该方法包括向人施用治疗有效量的I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂，并且向人施用治疗有效量的ICOS(CD278，诱导型T细胞共刺激物)结合蛋白或其抗原结合片段。

说明书

发明领域

本发明涉及治疗哺乳动物中的癌症的方法，以及可用于此类治疗中的组合。特别地，本发明涉及I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和抗ICOS抗体的组合。

发明背景

过度增殖性病症包括癌症的有效治疗是肿瘤学领域中的持续目标。一般地，癌症起因于控制细胞分裂、分化和凋亡性细胞死亡的正常过程的失调，并且特征在于恶性细胞的增殖，所述恶性细胞具有无限制生长、局部扩张和全身转移的潜力。正常过程的失调包括信号转导途径中的异常，以及对不同于正常细胞中发现的因子的应答。

精氨酸甲基化是对参与各种范围的细胞过程的蛋白质的重要翻译后修饰，所述细胞过程例如基因调控、RNA加工、DNA损伤应答和信号转导。含有甲基化精氨酸的蛋白质存在于核和胞质级分两者中，提示了在这些亚细胞区室各处也存在催化甲基转移至精氨酸上的酶(在以下中进行综述：Yang，Y. & Bedford，M. T. Protein argininemethyltransferases and cancer.

精氨酸甲基化在很大程度上在富含甘氨酸、精氨酸(GAR)的基序的背景下，通过蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)家族的活性而发生，所述PRMT家族将甲基从S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)转移到底物精氨酸侧链，产生S-腺苷-高半胱氨酸(SAH)和甲基化的精氨酸。该蛋白质家族由10个成员组成，其中9个已显示具有酶促活性(Bedford，M. T. & Clarke，S. G.Protein arginine methylation in mammals：who，what，and why.

PRMT1的错误调控和过表达已与许多实体癌和造血癌症相关(Yang，Y. &Bedford，M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer.

免疫疗法是治疗过度增殖性病症的另一种方法。增强抗肿瘤T细胞功能并诱导T细胞增殖是强大而新颖的癌症治疗方法。目前上市了三种免疫肿瘤学抗体(例如，免疫调节剂)。抗CTLA-4(YERVOY®/伊匹木单抗)被认为在T细胞引发的节点加强免疫应答，而抗PD-1抗体(OPDIVO®/纳武单抗和KEYTRUDA®/帕博利珠单抗)，被认为通过缓解已经引发且激活的肿瘤特异性T细胞中的抑制性检查点，在局部肿瘤微环境中起作用。

ICOS是与CD28/CTLA-4-Ig超家族具有结构和功能关系的共刺激性T细胞受体(Hutloff等人，"ICOS is an inducible T-cell co-stimulator structurally andfunctionally related to CD28"，Nature，397：263-266(1999))。ICOS的激活通过ICOS-L(B7RP-1/B7-H2)结合而发生。B7-1和B7-2(CD28和CTLA4的配体)两者均不结合或激活ICOS。然而，ICOS-L已显示与CD28和CTLA-4两者弱结合(Yao S等人，“B7-H2 is a costimulatoryligand for CD28 in human”，Immunity，34(5)；729-40(2011))。ICOS的表达似乎仅限于T细胞。ICOS表达水平在不同的T细胞亚群之间以及在T细胞激活状态上不同。ICOS表达已在静息TH17细胞、T滤泡辅助(TFH)细胞和调节性T(Treg)细胞上显示；然而，与CD28不同；它在幼稚的T

越来越多的文献支持以下观点：激活CD4+和CD8+效应T细胞上的ICOS具有抗肿瘤潜力。在具有SA-1(肉瘤)、Meth A(纤维肉瘤)、EMT6(乳腺癌)和P815(肥大细胞瘤)和EL-4(浆细胞瘤)同基因肿瘤的小鼠中，ICOS-L-Fc融合蛋白引起肿瘤生长延迟和完全根除肿瘤，而在已知为弱免疫原性的B16-F10(黑色素瘤)肿瘤模型中，并未观察到活性(Ara G等人，“Potent activity of soluble B7RP-1-Fc in therapy of murine tumors insyngeneic hosts”，Int. J Cancer，103(4)；501-7(2003))。ICOS-L-Fc的抗肿瘤活性依赖于完整的免疫应答，因为该活性在裸鼠中生长的肿瘤中完全丧失。来自ICOS-L-Fc处理的小鼠的肿瘤分析证实，对处理有响应的肿瘤中的CD4+和CD8+ T细胞浸润中的显著增加，支持了ICOS-L-Fc在这些模型中的免疫刺激效应。

使用ICOS

来自用抗CTLA4抗体治疗的患者的新出现的数据也指出，ICOS+效应T细胞在介导抗肿瘤免疫应答中的积极作用。与在其中观察到很少增加或没有增加的患者相比，在伊匹木单抗治疗后具有循环和肿瘤浸润性CD4

尽管在癌症治疗中存在许多最近进展，但仍然存在对于遭受癌症影响的个体的更有效和/或增强治疗的需要。

附图简述

图1：精氨酸残基上的甲基化的类型。来自Yang，Y. & Bedford，M. T. Proteinarginine methyltransferases and cancer. Nat Rev Cancer 13，37-50，doi：10.1038/nrc3409(2013)。

图2：癌症相关的PRMT1底物的功能类别。PRMT1的已知底物及其与癌症相关生物学的关联(Yang，Y. & Bedford，M. T. Protein arginine methyltransferases andcancer. Nat Rev Cancer 13，37-50，doi：10.1038/nrc3409(2013)；Shia，W. J.等人PRMT1interacts with AML1-ETO to promote its transcriptional activation andprogenitor cell proliferative potential. Blood 119，4953-4962，doi：10.1182/blood-2011-04-347476(2012)；Wei，H.，Mundade，R.，Lange，K. C. & Lu，T. Proteinarginine methylation of non-histone proteins and its role in diseases. CellCycle 13，32-41，doi：10.4161/cc.27353(2014)；Boisvert，F. M.，Rhie，A.，Richard，S. &Doherty，A. J. The GAR motif of 53BP1 is arginine methylated by PRMT1 and isnecessary for 53BP1 DNA binding activity. Cell Cycle 4，1834-1841，doi：10.4161/cc.4.12.2250(2005)；Boisvert，F. M.，Dery，U.，Masson，J. Y. & Richard，S. Argininemethylation of MRE11 by PRMT1 is required for DNA damage checkpoint control.Genes Dev 19，671-676，doi：10.1101/gad.1279805(2005)；Zhang，L.等人Cross-talkbetween PRMT1-mediated methylation and ubiquitylation on RBM15 controls RNAsplicing. Elife 4，doi：10.7554/eLife.07938(2015)；Snijders，A. P.等人Argininemethylation and citrullination of splicing factor proline- and glutamine-rich(SFPQ/PSF)regulates its association with mRNA. RNA 21，347-359，doi：10.1261/rna.045138.114(2015)；Liao，H. W.等人PRMT1-mediated methylation of the EGFreceptor regulates signaling and cetuximab response. J Clin Invest 125，4529-4543，doi：10.1172/JCI82826(2015)；Ng，R. K.等人Epigenetic dysregulation ofleukaemic HOX code in MLL-rearranged leukaemia mouse model. J Pathol 232，65-74，doi：10.1002/path.4279(2014)；Bressan，G. C.等人Arginine methylation analysisof the splicing-associated SR protein SFRS9/SRP30C. Cell Mol Biol Lett 14，657-669，doi：10.2478/s11658-009-0024-2(2009))。

图3：用化合物D处理的细胞系的甲基扫描评估。具有甲基化变化(不依赖于变化的方向性)的蛋白质百分比按如所示的官能团进行分类。

图4：通过化合物A针对PRMT1的抑制模式。在18分钟PRMT1反应之后，并且将数据对3参数剂量应答方程拟合，来确定IC

图5：化合物A针对PRMT1的效力。使用测量从SAM到H4 1-21肽的

图6：关于与化合物A(橙色)和SAH(紫色)复合的PRMT1，在2.48Å下解析的晶体结构。插图揭示了该化合物在肽结合袋中结合，并且与PRMT1侧链进行关键相互作用。

图7：通过化合物A的PRMT1直系同源物抑制。使用测量从SAM到H4 1-21肽的

图8：化合物A针对PRMT家族成员的效力。在60分钟PRMT：SAM：化合物A预温育之后，使用在平衡条件下(以K

图9：MMA细胞内蛋白质分析(in-cell-western)。RKO细胞用化合物A-三HCl、化合物A-单HCl、化合物A-游离碱和化合物A-二-HCl处理72小时。将细胞固定，用检测MMA的抗Rme1GG以及使信号标准化的抗微管蛋白进行染色，并且使用Odyssey成像系统进行成像。使用双相曲线拟合方程，针对化合物浓度标绘相对于微管蛋白的MMA，以在GraphPad中生成曲线拟合(A)。EC

图10：在肿瘤中的PRMT1表达。mRNA表达水平得自用于癌症基因组学的cBioPortal。显示了ACTB水平和TYR，以分别指示对应于遍在表达的基因相对于具有限制表达的基因的表达水平。

图11：化合物A在细胞培养物中的抗增殖活性。在6天生长测定中，评估了196个人癌细胞系对化合物A的敏感性。关于每个细胞系的gIC

图12：化合物A对培养细胞中的精氨酸甲基化标记的作用的时间过程。(A)在用化合物A处理的Toledo DLBCL细胞中的ADMA、SDMA和MMA中的变化。显示了相对于微管蛋白标准化的甲基化中的变化

图13：化合物A对精氨酸甲基化的剂量应答。(A)来自U2932细胞系中的化合物A剂量应答的MMA和ADMA的代表性Western印迹图像。关于(B)定量的区域由凝胶左侧上的黑条表示。(B)在暴露72小时后，在5个淋巴瘤细胞系中，关于MMA的最大诱导的50%或ADMA的50%最大减少所需的最小有效化合物A浓度

图14：在淋巴瘤细胞中响应化合物A的精氨酸甲基化标记的持久性。(A)在用化合物A培养的Toledo DLBCL细胞系中的ADMA、SDMA和MMA变化的稳定性。显示了相对于微管蛋白标准化的甲基化中的变化

图15：淋巴瘤细胞系的增殖时间过程。在Toledo(A)和Daudi(B)细胞系中，经过10天的时间过程评价了细胞生长(n=2/细胞系)。显示了关于单次生物学重复的代表性数据。

图16：在6和10天时，化合物A在淋巴瘤细胞系中的抗增殖效应。(A)来自淋巴瘤细胞系中的第6天(浅蓝色)和第10天(深蓝色)增殖测定的平均gIC

图17：如按亚型分类的化合物A在淋巴瘤细胞系中的抗增殖效应。(A)关于每个细胞系的gIC

图18：人淋巴瘤细胞系中的细胞周期的碘化丙啶FACS分析。3个淋巴瘤细胞系Toledo (A)、U2932(B)和OCI-Ly1(C)用0、1、10、100、1000和10,000 nM化合物A处理10天，并且在处理后的第3、5、7、10天时获取样品。数据代表生物学重复的平均值

图19：用化合物A处理的淋巴瘤细胞系中的半胱天冬酶-3/7激活。在Toledo(A)和Daudi(B)细胞系中，经过10天的时间过程评价了凋亡。半胱天冬酶3/7激活显示为相对于DMSO处理的细胞的诱导倍数。对于每个细胞系执行两次独立的重复。对于各自显示了代表性数据。

图20：化合物A在荷有Toledo异种移植物的小鼠中的功效。经过28(A)或24(B)天的时期，用化合物A经口QD (37.5、75、150、300、450或600 mg/kg) 或用75 mg/kg (B) BID来处理小鼠，并且每周两次测量肿瘤体积。

图21：在6和10天时，化合物A在AML细胞系中的效应。(A)来自AML细胞系中的第6天(浅蓝色)和第10天(深蓝色)增殖测定的平均gIC

图22：用化合物A的ccRCC系的体外增殖时间过程。(A)关于2个ccRCC细胞系，相对于对照(DMSO)的生长。显示了来自单次重复的代表性曲线。(B)在时间过程期间，关于ccRCC细胞系的gIC

图23：化合物A在ACHN异种移植物中的功效。经过28天的时期，每天用化合物A经口处理小鼠，并且每周两次测量肿瘤体积。

图24：化合物A在乳腺癌细胞系中的抗增殖效应。在6天增殖测定中，对于化合物A标绘了关于乳腺癌细胞系的gIC

图25：在7和12天时，化合物A在乳腺癌细胞系中的效应。来自乳腺癌细胞系中的第7天(浅蓝色)和10天(深蓝色)增殖测定的平均生长抑制(%)值，和相应的gIC

图26：在同基因肿瘤模型中，抗小鼠ICOS激动剂抗体与化合物D组合的协同活性。用单独和组合的5mg/kg抗ICOS(Icos17G9-GSK)和300mg/kg化合物D，处理荷有CT26 (结肠)或EMT6(乳腺)的皮下同种异体移植物的免疫活性小鼠。关于CT26(A)和EMT6(B)的存活曲线：化合物D和抗ICOS的组合在本研究中具有超过任一种单一试剂的显著存活益处(Grehan-Breslow-Wilcoxon检验)。(C)来自比较媒介物、抗ICOS、化合物D和抗ICOS/化合物D组合的两项功效研究的各个肿瘤生长曲线。

发明概述

在一个方面，本发明提供了治疗有此需要的人中的癌症的方法，该方法包括向人施用治疗有效量的I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂，并且向人施用治疗有效量的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分。

在一个方面，本发明提供了I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和ICOS结合蛋白或其抗原结合片段，其用于治疗有此需要的人中的癌症。

在一个方面，本发明提供了I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和ICOS结合蛋白或其抗原结合片段，用于制造治疗癌症的药剂的用途。

在一个方面，本发明提供了I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和ICOS结合蛋白或其抗原结合片段，用于治疗癌症的用途。

发明详述

定义

如本文使用的，“I型蛋白质精氨酸甲基转移酶抑制剂”或“I型PRMT抑制剂”，意指抑制下述中的任何一种或多种的试剂：蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)抑制剂、以及蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)。在一些实施方案中，I型PRMT抑制剂是小分子化合物。在一些实施方案中，I型PRMT抑制剂选择性抑制下述中的任何一种或多种：蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)抑制剂、以及蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)。在一些实施方案中，I型PRMT抑制剂是PRMT1、PRMT3、PRMT4、PRMT6和PRMT8的选择性抑制剂。

鉴于其在各种生物过程的调控中的作用，精氨酸甲基转移酶是有吸引力的调节靶。目前已发现，本文所述的化合物及其药学上可接受的盐和组合物，作为精氨酸甲基转移酶的抑制剂是有效的。

特异性官能团和化学术语的定义在下文更详细地描述。化学元素根据元素周期表(CAS版本，Handbook of Chemistry and Physics，第75版，封二)进行鉴定，并且特异性官能团一般如其中所述的进行定义。另外，有机化学的一般原理、以及特异性功能部分和反应性在以下中描述：Thomas Sorrell，Organic Chemistry，University Science Books，Sausalito，1999；Smith和March，March's Advanced Organic Chemistry，第5版，JohnWiley & Sons，Inc.，New York，2001；Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers，Inc.，New York，1989；以及Carruthers，Some Modern Methods ofOrganic Synthesis，第3版，Cambridge University Press，Cambridge，1987。

本文所述的化合物可以包含一个或多个不对称中心，并且因此可以以各种异构体形式存在，例如对映异构体和/或非对映异构体。例如，本文所述的化合物可以是个别对映异构体、非对映异构体或几何异构体的形式，或者可以是立体异构体的混合物的形式，包括外消旋混合物和富含一种或多种立体异构体的混合物。可以通过本领域技术人员已知的方法，包括手性高压液相层析(HPLC)以及手性盐的形成和结晶，从混合物中分离异构体；或者可以通过不对称合成来制备优选的异构体。参见例如，Jacques等人，Enantiomers，Racemates and Resolutions(Wiley Interscience，New York，1981)；Wilen等人，Tetrahedron 33：2725(1977)；Eliel，Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill，NY，1962)；以及Wilen，Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions第268页(E.L. Eliel，编辑，Univ. of Notre Dame Press，Notre Dame，IN 1972)。本公开内容另外涵盖了本文描述的化合物，其作为基本上不含其它异构体的个别异构体、以及可替代地作为各种异构体的混合物。

应理解，本发明的化合物可以描述为不同的互变异构体。还应当理解，当化合物具有互变异构形式时，所有互变异构形式都预期包括在本发明的范围内，并且本文所述的任何化合物的命名都不排除任何互变异构形式。

除非另有说明，否则本文所述的结构还意欲包括仅在一个或多个同位素富集的原子的存在下不同的化合物。例如，除了用氘或氚替换氢，用

当列出值的范围时，它预期涵盖在该范围内的每个值和子范围。例如，“C

“基”指特定基团上的附着点。基包括特定基团的二价基。

“烷基”指具有1至20个碳原子的直链或支链饱和烃基的基(“C

在一些实施方案中，烷基由一个或多个卤素取代。“全卤代烷基”是如本文定义的取代的烷基，其中所有氢原子都独立地替换为卤素，例如氟、溴、氯或碘。在一些实施方案中，烷基部分具有1至8个碳原子(“C

“烯基”指具有2至20个碳原子和一个或多个碳-碳双键(例如1、2、3或4个双键)，以及任选地一个或多个三键(例如1、2、3或4个三键)的直链或支链烃基的基(“C

“炔基”指具有2至20个碳原子和一个或多个碳-碳三键(例如1、2、3或4个三键)，以及任选地一个或多个双键(例如1、2、3或4个双键)的直链或支链烃基的基(“C

“稠合的”或“邻位稠合的”在本文中可互换使用，并且指具有两个原子和一个共同键的两个环，例如，

“桥连的”指含有以下的环系统：(1)连接同一环的两个或更多个不相邻位置的桥头原子或一组原子；或(2)连接环系统的不同环的两个或更多个位置，并且从而不形成邻位稠合环的桥头原子或一组原子，例如，

“螺”或“螺稠合的”指这样的一组原子，其连接至碳环或杂环系统的同一原子(偕附着)，从而形成环，例如，

还考虑了在桥头原子处的螺稠合。

“碳环基”或“碳环的”指在非芳环系统中具有3至14个环碳原子、以及零个杂原子的非芳环状烃基的基(“C

在一些实施方案中，“碳环基”是具有3至14个环碳原子的单环、饱和碳环基(“C

“杂环基”或“杂环的”指具有环碳原子和1至4个环杂原子的3至14元非芳环系统的基，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“3-14元杂环基”)。在某些实施方案中，杂环基或杂环的指具有环碳原子和1-4个环杂原子的3-10元非芳环系统的基，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“3-10元杂环基”)。当化合价允许时，在含有一个或多个氮原子的杂环基中，附着点可以是碳或氮原子。杂环基可以是单环的(“单环杂环基”)，或者稠合、桥接或螺稠合的环系统例如双环系统(“双环杂环基”)，并且可以是饱和的或可以是部分不饱和的。杂环基双环系统可以包括在一个或两个环中的一个或多个杂原子。“杂环基”还包括其中如上文定义的杂环基环与一个或多个碳环基稠合的环系统，其中附着点在碳环基或杂环基环上，或者其中如上文定义的杂环基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合的环系统，其中附着点在杂环基环上，并且在这种情况下，环成员数目继续指定杂环基环系统中的环成员数目。在某些实施方案中，杂环基的每个实例独立地是任选取代的，例如未取代的(“未取代的杂环基”)或者由一个或多个取代基取代的(“取代的杂环基”)。在某些实施方案中，杂环基是未取代的3-10元杂环基。在某些实施方案中，杂环基是取代的3-10元杂环基。

在一些实施方案中，杂环基是具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-10元非芳环系统(“5-10元杂环基”)，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。在一些实施方案中，杂环基是具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-8元非芳环系统(“5-8元杂环基”)，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。在一些实施方案中，杂环基是具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-6元非芳环系统(“5-6元杂环基”)，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。在一些实施方案中，5-6元杂环基具有独立地选自氮、氧和硫的1-3个环杂原子。在一些实施方案中，5-6元杂环基具有独立地选自氮、氧和硫的1-2个环杂原子。在一些实施方案中，5-6元杂环基具有选自氮、氧和硫的一个环杂原子。

含有一个杂原子的示例性的3元杂环基包括但不限于氮杂环丙烷基、氧杂环丙烷基和硫杂环丙烷基。含有一个杂原子的示例性的4元杂环基包括但不限于氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基和硫杂环丁烷基。含有一个杂原子的示例性的5元杂环基包括但不限于四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、吡咯烷基、二氢吡咯基和吡咯基-2,5-二酮。含有两个杂原子的示例性的5元杂环基包括但不限于二氧戊环基、氧硫杂环戊烷基、二硫杂环戊烷基和噁唑烷-2-酮。含有三个杂原子的示例性的5元杂环基包括但不限于三唑啉基、噁二唑啉基和噻二唑啉基。含有一个杂原子的示例性的6元杂环基包括但不限于哌啶基、四氢吡喃基、二氢吡啶基和硫杂环己烷基。含有两个杂原子的示例性的6元杂环基包括但不限于哌嗪基、吗啉基、二硫杂环己烷基和二噁烷基。含有三个杂原子的示例性的6元杂环基包括但不限于三嗪烷基。含有一个杂原子的示例性的7元杂环基包括但不限于氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基和硫杂环庚烷基。含有一个杂原子的示例性的8元杂环基包括但不限于氮杂环辛基、氧杂环辛基和硫杂环辛基。与C

“芳基”指单环或多环(例如，双环或三环)4n+2芳环系统(例如，具有在环状阵列中共享的6、10或14个π电子)的基(“C

“杂芳基”指5-14元单环或多环(例如，双环或三环)4n+2芳环系统(例如，具有在环状阵列中共享的6或10个π电子)的基(“5-14元杂芳基”)，其具有在芳环系统中提供的环碳原子和1-4个环杂原子，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。在某些实施方案中，杂芳基指5-10元单环或双环4n+2芳环系统的基(“5-10元杂芳基”)，其具有在芳环系统中提供的环碳原子和1-4个环杂原子，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。当化合价允许时，在含有一个或多个氮原子的杂芳基中，附着点可以是碳或氮原子。杂芳基双环系统可以包括在一个或两个环中的一个或多个杂原子。“杂芳基”包括其中如上文定义的杂芳基环与一个或多个碳环基或杂环基稠合的环系统，其中附着点在杂芳基环上，并且在这种情况下，环成员数目继续指定杂芳基环系统中的环成员数目。“杂芳基”还包括其中如上文定义的杂芳基环与一个或多个芳基稠合的环系统，其中附着点在芳基或杂芳基环上，并且在这种情况下，环成员数目指定稠合的(芳基/杂芳基)环系统中的环成员数目。其中一个环不含有杂原子的双环杂芳基(例如吲哚基、喹啉基、咔唑基等等)，附着点可以在任一环上，例如带有杂原子的环(例如2-吲哚基)或不含有杂原子的环(例如5-吲哚基)。

在一些实施方案中，杂芳基是具有在芳环系统中提供的环碳原子和1-4个环杂原子的5-14元芳环系统(“5-14元杂芳基”)，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。在一些实施方案中，杂芳基是具有在芳环系统中提供的环碳原子和1-4个环杂原子的5-10元芳环系统(“5-10元杂芳基”)，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。在一些实施方案中，杂芳基是具有在芳环系统中提供的环碳原子和1-4个环杂原子的5-8元芳环系统(“5-8元杂芳基”)，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。在一些实施方案中，杂芳基是具有在芳环系统中提供的环碳原子和1-4个环杂原子的5-6元芳环系统(“5-6元杂芳基”)，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。在一些实施方案中，5-6元杂芳基具有独立地选自氮、氧和硫的1-3个环杂原子。在一些实施方案中，5-6元杂芳基具有独立地选自氮、氧和硫的1-2个环杂原子。在一些实施方案中，5-6元杂芳基具有选自氮、氧和硫的1个环杂原子。在某些实施方案中，杂芳基的每个实例独立地是任选取代的，例如未取代的(“未取代的杂芳基”)或者由一个或多个取代基取代的(“取代的杂芳基”)。在某些实施方案中，杂芳基是未取代的5-14元杂芳基。在某些在实施方案中，杂芳基是取代的5-14元杂芳基。

含有一个杂原子的示例性的5元杂芳基包括但不限于吡咯基、呋喃基和噻吩基。含有两个杂原子的示例性的5元杂芳基包括但不限于咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基和异噻唑基。含有三个杂原子的示例性的5元杂芳基包括但不限于三唑基、噁二唑基和噻二唑基。含有四个杂原子的示例性的5元杂芳基包括但不限于四唑基。含有一个杂原子的示例性的6元杂芳基包括但不限于吡啶基。含有两个杂原子的示例性的6元杂芳基包括但不限于哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。含有三个或四个杂原子的示例性的6元杂芳基分别包括但不限于三嗪基和四嗪基。含有一个杂原子的示例性的7元杂芳基包括但不限于氮杂环庚三烯基、氧杂环庚三烯基和硫杂环庚三烯基。示例性的6,6-双环杂芳基包括但不限于萘啶基、蝶啶基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基、酞嗪基和喹唑啉基。示例性的5,6-双环杂芳基包括但不限于下式中的任何一个：

当化合价允许时，在任何单环或双环杂芳基中，附着点可以是任何碳或氮原子。

“部分不饱和的”指包括至少一个双键或三键的基团。术语“部分不饱和的”预期涵盖具有多重不饱和位点的环，但并不预期包括如本文定义的芳族基团(例如，芳基或杂芳基)。同样地，“饱和的”指不含有双键或三键，即，全部含有单键的基团。

在一些实施方案中，如本文定义的烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基是任选取代的(例如，“取代的”或“未取代的”脂族、“取代的”或“未取代的”烷基、“取代的”或“未取代的”烯基、“取代的”或“未取代的”炔基、“取代的”或“未取代的”碳环基、“取代的”或“未取代的”杂环基、“取代的”或“未取代的”芳基、或者“取代的”或“未取代的”杂芳基)。一般而言，术语“取代的”，无论之前是否为术语“任选地”，意指基团(例如碳或氮原子)上存在的至少一个氢由允许的取代基替换，所述允许的取代基例如在取代后导致稳定化合物的取代基，所述稳定化合物例如不会自发地经历例如通过重排、环化、消除或其它反应的转化的化合物。除非另有说明，否则“取代的”基团在该基团的一个或多个可取代位置处具有取代基，并且当任何给定结构中的多于一个位置被取代时，取代基在每个位置处是相同的或不同的。考虑术语“取代的”包括由有机化合物的所有允许的取代基的取代，包括导致稳定化合物形成的本文所述的任何取代基。本公开内容考虑了任何和所有此类组合，以便得到稳定化合物。为了本公开内容的目的，杂原子如氮可以具有氢取代基和/或如本文所述的任何合适的取代基，其满足杂原子的化合价并导致稳定部分的形成。

示例性的碳原子取代基包括但不限于卤素、-CN、-NO

或者碳原子上的两个偕氢由以下替换：基团=O、=S、=NN(R

R

R

R

R

R

R

“抗衡离子”或“阴离子抗衡离子”是与阳离子季氨基结合的带负电荷的基团，以便维持电子中性。示例性的抗衡离子包括卤素离子(例如F

“卤代”或“卤素”指氟(氟代，-F)，氯(氯代，-Cl)，溴(溴代，-Br)或碘(碘代，-I)。

当化合价允许时，氮原子可以是取代的或未取代的，并且包括伯、仲、叔和季氮原子。示例性的氮原子取代基包括但不限于氢、-OH、-OR

在某些实施方案中，存在于氮原子上的取代基是氮保护基团(也称为氨基保护基团)。氮保护基团包括但不限于-OH、-OR

酰胺氮保护基团(例如-C(=O)R

氨基甲酸酯氮保护基团(例如-C(=O)OR

磺酰胺氮保护基团(例如-S(=O)

其它氮保护基团包括但不限于吩噻嗪基-(10)-酰基衍生物、

在某些实施方案中，存在于氧原子上的取代基是氧保护基团(也称为羟基保护基团)。氧保护基团包括但不限于-R

示例性的氧保护基团包括但不限于甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲硫基甲基(MTM)、叔丁基硫甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苄氧基甲基(BOM)、对甲氧基苄氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(

在某些实施方案中，存在于硫原子上的取代基是硫保护基团(也称为硫醇保护基团)。硫保护基团包括但不限于-R

“药学上可接受的盐”指这样的盐，其在合理的医学判断的范围内，适用于与人和其它动物的组织接触，而无过度毒性、刺激、变应性应答等等，并且与合理的利益/风险比相称。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，Berge等人在J. PharmaceuticalSciences(1977)66：1-19中详细描述了药学上可接受的盐。本文描述的化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和碱的那些。药学上可接受的、无毒的酸加成盐的实例是由无机酸(例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的氨基盐，或者通过使用本领域中使用的其它方法例如离子交换形成的氨基盐。其它药学上可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等等。衍生自适当碱的盐包括碱金属、碱土金属、铵和N

本发明提供了I型PRMT抑制剂。在一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是式(I)的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中

X是N，Z是NR

X是NR

X是CR

X是CR

R

L

每个R

每个R

R

R

R

Cy是任选取代的C

R

在一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是式(I)的化合物，其中-L

在一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是式(V)的化合物

或其药学上可接受的盐，其中环A是任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。在一个方面，环A是任选取代的碳环基。在一个方面，R

在一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是式(VI)的化合物

或其药学上可接受的盐。在一个方面，环A是任选取代的碳环基。在一个方面，R

在一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是式(II)的化合物：

或其药学上可接受的盐。在一个方面，-L

在一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是化合物A：

或其药学上可接受的盐。化合物A和制备化合物A的方法公开于PCT/US2014/029710的至少第171页(化合物158)，以及第266页的第[00331]段中。

在一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是化合物A-三HCl，化合物A的三HCl形式。在另一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是化合物A-单HCl，化合物A的单HCl盐形式。在又一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是化合物A-游离碱，化合物A的游离碱形式。在再一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是化合物A-二HCl，化合物A的-二HCl盐形式。

在一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是化合物D：

或其药学上可接受的盐。

I型PRMT抑制剂进一步公开于PCT/US2014/029710中，其引入本文作为参考。示例性的I型PRMT抑制剂公开于PCT/US2014/029710的表1A和表1B中，并且制备I型PRMT抑制剂的方法至少在PCT/US2014/029710的第226页第[00274]段至第328页第[00050]段中进行描述。

“抗原结合蛋白(ABP)”意指结合抗原的蛋白，包括以与抗体相似的方式起作用的抗体或改造分子。此类替代抗体形式包括三抗体、四抗体、微型抗体和微体。还包括的是替代支架，其中根据本公开内容的任何分子的一个或多个CDR可以排列到合适的非免疫球蛋白蛋白支架或骨架上，例如亲和体、SpA支架、LDL受体A类结构域、avimer(参见例如，美国专利申请公开号2005/0053973、2005/0089932、2005/0164301)或EGF结构域。ABP还包括此类抗体或其它分子的抗原结合片段。进一步地，ABP可以包含本发明的VH区，当与适当的轻链配对时，所述VH区格式化为全长抗体、(Fab')2片段、Fab片段、双特异性或双互补位分子或其等同物(例如scFV，双-三-或四体，Tandab等)。ABP可以包含其为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgM；IgA、IgE或IgD或其修饰的变体的抗体。抗体重链的恒定结构域可以相应地加以选择。轻链恒定结构域可以是κ或λ恒定结构域。ABP也可以是WO86/01533中所述类型的嵌合抗体，其包含抗原结合区和非免疫球蛋白区。术语“ABP”、“抗原结合蛋白”和“结合蛋白”在本文可互换使用。

如本文使用的，“ICOS”意指任何诱导型T细胞共刺激蛋白。ICOS(诱导型T细胞共刺激物)的别名包括AILIM；CD278；CVID1、JTT-1或JTT-2、MGC39850或8F4。ICOS是在激活的T细胞上表达的CD28超家族共刺激分子。由该基因编码的蛋白质属于CD28和CTLA-4细胞表面受体家族。它形成同型二聚体，并且在细胞间信号传导、免疫应答和细胞增殖的调控中起重要作用。人ICOS(同种型2)的氨基酸序列(登录号：UniProtKB -Q9Y6W8-2)在下文显示为SEQID NO：9。

人ICOS(同种型1)的氨基酸序列(登录号：UniProtKB -Q9Y6W8-1)在下文显示为SEQ ID NO：10。

ICOS的激活通过经由ICOS-L(B7RP-1/B7-H2)结合而发生。B7-1和B7-2(CD28和CTLA4的配体)两者均不结合或激活ICOS。然而，ICOS-L已显示与CD28和CTLA-4两者弱结合(Yao S等人，“B7-H2 is a costimulatory ligand for CD28 in human”，Immunity，34(5)；729-40(2011))。ICOS的表达似乎仅限于T细胞。ICOS表达水平在不同的T细胞亚群之间以及在T细胞激活状态上不同。ICOS表达已在静息TH17细胞、T滤泡辅助(TFH)细胞和调节性T(Treg)细胞上显示；然而，与CD28不同；它在幼稚的T

37A10S713重链可变区：

37A10S713轻链可变区：

“针对ICOS的试剂”意指能够结合ICOS的任何化学化合物或生物分子。在一些实施方案中，针对ICOS的试剂是ICOS结合蛋白。在一些其它实施方案中，针对ICOS的试剂是ICOS激动剂。

如本文使用的，术语“ICOS结合蛋白”指能够与ICOS结合的抗体和其它蛋白质构建体，例如结构域。在一些情况下，ICOS是人ICOS。术语“ICOS结合蛋白”可以与“ ICOS抗原结合蛋白”互换使用。因此，如本领域理解的，抗ICOS抗体和/或ICOS抗原结合蛋白被视为ICOS结合蛋白。如本文使用的，“抗原结合蛋白”是与抗原例如ICOS结合的任何蛋白质，包括但不限于本文所述的抗体、结构域和其它构建体。如本文使用的，ICOS结合蛋白的“抗原结合部分”将包括能够与ICOS结合的ICOS结合蛋白的任何部分，包括但不限于抗原结合抗体片段。

在一个实施方案中，本发明的ICOS抗体包含下述CDR的任何一种或组合：

在一些实施方案中，本发明的抗ICOS抗体包含与SEQ ID NO：7具有至少90%序列同一性的重链可变区。适当地，本发明的ICOS结合蛋白可以包含与SEQ ID NO：7具有约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变区。

人源化重链(V

在本发明的一个实施方案中，ICOS抗体包含在具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的轻链可变区中的CDRL1(SEQ ID NO：4)、CDRL2(SEQ ID NO：5)和CDRL3(SEQ ID NO：6)。包含SEQ ID NO：8中所示的人源化轻链可变区的本发明的ICOS结合蛋白被指名为“L5”。因此，包含SEQ ID NO：7的重链可变区和SEQ ID NO：8的轻链可变区的本发明的ICOS结合蛋白，在本文中可以被指名为H2L5。

在一些实施方案中，本发明的ICOS结合蛋白包含与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的轻链可变区。适当地，本发明的ICOS结合蛋白可以包含与SEQ ID NO：8具有约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变区。

人源化轻链(V

CDR或最小结合单位可以通过至少一个氨基酸取代、缺失或添加进行修饰，其中所述变体抗原结合蛋白基本上保留未修饰蛋白，例如包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的抗体的生物学特性。

应了解，CDR H1、H2、H3、L1、L2、L3各自可以单独进行修饰，或者以任何排列或组合与任何其它CDR组合进行修饰。在一个实施方案中，通过至多3个氨基酸，例如1或2个氨基酸，例如1个氨基酸的取代、缺失或添加来修饰CDR。通常，修饰是取代，特别是保守取代，例如如下表1中所示。

表1

抗体的亚类部分决定了次级效应物功能，例如补体激活或Fc受体(FcR)结合、以及抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)(Huber等人，Nature 229(5284)：419-20(1971)；Brunhouse等人，Mol Immunol 16(11)：907-17(1979))。在鉴定用于特定应用的最佳抗体类型时，可以将抗体的效应物功能考虑进去。例如，hIgG1抗体具有相对长的半衰期，在固定补体方面非常有效，并且它们与FcγRI和FcγRII两者结合。相比之下，人IgG4抗体具有较短的半衰期，并不固定补体，并且对于FcR具有较低的亲和力。在IgG4的Fc区中用脯氨酸替换丝氨酸228(S228P)减少了用hIgG4观察到的异质性，并且延长了血清半衰期(Kabat等人，“Sequences of proteins of immunological interest” 5.sup.th Edition(1991)；Angal等人，Mol Immunol 30(1)：105-8(1993))。用谷氨酸替换亮氨酸235(L235E)的第二种突变消除了残留的FcR结合和补体结合活性(Alegre等人，J Immunol 148(11)：3461-8(1992))。具有两种突变的所得到的抗体被称为IgG4PE。hIgG4氨基酸的编号衍生自EU编号参考：Edelman，G.M.等人，Proc. Natl. Acad. USA，63，78-85(1969). PMID：5257969。在本发明的一个实施方案中，ICOS抗体是IgG4同种型。在一个实施方案中，包括包含替换S228P和L235E的IgG4 Fc区的ICOS抗体可以具有指名IgG4PE。

如本文使用的，“ICOS-L”和“ICOS配体”可互换使用，并且指人ICOS的膜结合的天然配体。ICOS配体是在人中由

如本文使用的，“免疫调节剂”或“免疫调节试剂”指影响免疫系统的任何物质包括单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫调节剂或免疫调节试剂上调免疫系统。免疫调节剂可以用作用于癌症治疗的抗肿瘤剂。例如，免疫调节剂包括但不限于抗PD-1抗体(Opdivo/纳武单抗和Keytruda/帕博利珠单抗)、抗CTLA-4抗体例如伊匹木单抗(YERVOY)和抗ICOS抗体。

如本文使用的，术语“激动剂”指抗原结合蛋白包括但不限于抗体，其在与共信号传导受体接触时引起下述中的一种或多种：(1)刺激或激活受体，(2)增强、增加或促进、诱导或延长受体的活性、功能或存在，和/或(3)增强、增加、促进或诱导受体的表达。激动剂活性可以通过本领域已知的各种测定在体外进行测量，例如但不限于细胞信号传导、细胞增殖、免疫细胞激活标记物、细胞因子产生的测量。激动剂活性还可以通过测量替代终点的各种测定在体内进行测量，例如但不限于T细胞增殖或细胞因子产生的测量。

如本文使用的，术语“拮抗剂”指抗原结合蛋白包括但不限于抗体，其在与共信号传导受体接触时引起下述中的一种或多种：(1)使受体减弱、阻断或失活和/或阻断受体通过其天然配体的激活，(2)减少、降低或缩短受体的活性、功能或存在，和/或(3)减少、降低、取消受体的表达。拮抗剂活性可以通过本领域已知的各种测定在体外进行测量，例如但不限于细胞信号传导、细胞增殖、免疫细胞激活标记物、细胞因子产生中的增加或减少的测量。拮抗剂活性还可以通过测量替代终点的各种测定在体内进行测量，例如但不限于T细胞增殖或细胞因子产生的测量。

术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，以指具有免疫球蛋白样结构域的分子(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)，并且包括单克隆、重组、多克隆、嵌合、人、人源化、多特异性抗体，包括双特异性抗体和异源缀合物抗体；单个可变结构域(例如V

替代抗体形式包括替代支架，其中抗原结合蛋白的一个或多个CDR可以排列到合适的非免疫球蛋白蛋白支架或骨架上，例如亲和体、SpA支架、LDL受体A类结构域、avimer(参见例如，美国专利申请公开号2005/0053973、2005/0089932、2005/0164301)或EGF结构域。

术语“结构域”指折叠的蛋白质结构，其不依赖于蛋白质的剩余部分而保留其三级结构。一般地，结构域负责蛋白质的离散功能特性，并且在许多情况下，可以添加、去除或转移至其它蛋白质，而无蛋白质的其余部分和/或结构域的功能丧失。

术语“单个可变结构域”指包含抗体可变结构域特征性序列的折叠的多肽结构域。因此，它包括完整的抗体可变结构域，例如V

可以借助于在非抗体蛋白支架上排列一个或多个CDR来提供抗原结合片段。如本文使用的，“蛋白质支架”包括但不限于免疫球蛋白(Ig)支架，例如IgG支架，其可以是四链或双链抗体，或者可以仅包含抗体的Fc区，或者可以包含来自抗体的一个或多个恒定区，所述恒定区可以具有人或灵长类动物起源，或者可以是人和灵长类动物恒定区的人工嵌合体。

蛋白质支架可以是Ig支架，例如IgG或IgA支架。IgG支架可以包含抗体的一些或全部结构域(即，CH1、CH2、CH3、V

亲和力(affinity)是一种分子例如本发明的抗原结合蛋白，与另一种分子例如其靶抗原在单个结合位点处的结合强度。抗原结合蛋白与其靶的结合亲和力可以通过平衡方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射性免疫测定(RIA))，或动力学(例如BIACORE

亲合力(avidity)是两种分子在多重位点处彼此结合的结合强度的总和，例如考虑到相互作用的化合价。

“分离的”意指将分子例如抗原结合蛋白或核酸，从它可能在自然界中在其中发现的环境中取出。例如，分子可以纯化掉它在自然界中通常与其一起存在的物质。例如，样品中的分子质量可以是总质量的95%。

如本文使用的，术语“表达载体”意指分离的核酸，其可以用于将目的核酸引入细胞如真核细胞或原核细胞、或者无细胞表达系统内，其中目的核酸序列作为肽链如蛋白质进行表达。此类表达载体可以是例如包含目的核酸的粘粒、质粒、病毒序列、转座子和线性核酸。一旦将表达载体引入细胞或无细胞表达系统(例如网织红细胞裂解产物)内，就通过转录/翻译机制产生由目的核酸编码的蛋白质。在本公开内容的范围内的表达载体可以提供用于真核或原核表达的必要元件，并且包括病毒启动子驱动的载体，例如CMV启动子驱动的载体，例如pcDNA3.1、pCEP4及其衍生物，杆状病毒表达载体，果蝇(

如本文使用的，术语“重组宿主细胞”意指包含目的核酸序列的细胞，所述目的核酸序列在其引入细胞内之前是分离的。例如，目的核酸序列可以在表达载体中，而细胞可以是原核或真核的。示例性的真核细胞是哺乳动物细胞，例如但不限于COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、653、SP2/0、NS0、293、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤细胞或其任何衍生物。最优选地，真核细胞是HEK293、NS0、SP2/0或CHO细胞。大肠杆菌(

“嵌合抗体”指一类改造抗体，其含有与衍生自受体抗体的轻链和重链恒定区结合的、衍生自供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)。

“人源化抗体”指其CDR衍生自非人供体免疫球蛋白的一类改造抗体，所述分子的剩余免疫球蛋白衍生的部分衍生自一种或多种人免疫球蛋白。另外，可以改变构架支持残基，以保存结合亲和力(参见例如，Queen等人Proc. Natl Acad Sci USA，86：10029-10032(1989)，Hodgson等人，

术语“全人抗体”包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在的话)的抗体。本发明的人序列抗体可以包括未由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。全人抗体包含仅由最终具有人起源的多核苷酸编码的氨基酸序列，或与此类序列等同的氨基酸序列。如本文意指的，由插入转基因小鼠中产生的小鼠基因组内的编码人免疫球蛋白的DNA编码的抗体是全人抗体，因为它们由最终具有人起源的DNA编码。在这种情形下，编码人免疫球蛋白的DNA可以在小鼠内重排(以编码抗体)，并且也可能发生体细胞突变。在小鼠中已经历此类改变的由最初人DNA编码的抗体是如本文意指的全人抗体。此类转基因小鼠的使用使得能够选择针对人抗原的全人抗体。如本领域理解的，可以使用噬菌体展示技术来制备全人抗体，其中将人DNA文库插入噬菌体中，用于生成包含人种系DNA序列的抗体。

术语“供体抗体”指将其可变区、CDR或其它功能片段或其类似物的氨基酸序列贡献给第一免疫球蛋白配偶体的抗体。因此，供体提供了改变的免疫球蛋白编码区，并且所得到的表达的改变的抗体具有供体抗体的抗原特异性和中和活性特征。

术语“受体抗体”指与供体抗体异源的抗体，其将编码其重链和/或轻链构架区和/或其重链和/或轻链恒定区的氨基酸序列的全部(或任何部分)，贡献给第一免疫球蛋白配偶体。人抗体可以是受体抗体。

术语“V

“CDR”定义为抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列。这些是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，如本文使用的，“CDR”指所有三个重链CDR、所有三个轻链CDR、所有重链和轻链CDR、或至少两个CDR。

在本说明书全文，可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基根据Kabat编号约定进行编号。类似地，实施例中使用的术语“CDR”、“CDRL1”、“CDRL2”、“CDRL3”、“CDRH1”、“CDRH2”、“CDRH3”遵循Kabat编号约定。关于进一步信息，参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department ofHealth and Human Services，National Institutes of Health(1991)。

对于本领域技术人员显而易见的是，对于可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基、存在替代的编号约定。对于CDR序列也存在其它的编号约定，例如Chothia等人(1989)Nature 342：877-883中阐述的那些。抗体的结构和蛋白质折叠可能意味着其它残基被视为CDR序列的部分，并且由技术人员理解为如此。

关于技术人员可获得的CDR序列的其它编号约定包括“AbM”(University ofBath)和“接触”(University College London)方法。可以使用Kabat、Chothia、AbM和接触方法中的至少两种来确定最小重叠区域，以提供“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的子部分。

在一个方面，提供了I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和ICOS结合蛋白或其抗原结合片段，其用于治疗有此需要的人中的癌症。

在另一个方面，提供了治疗有此需要的人中的癌症的方法，该方法包括向人施用治疗有效量的I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂，并且向人施用治疗有效量的ICOS结合蛋白或其抗原结合部分。

在仍另一个方面，提供了I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和ICOS结合蛋白或其抗原结合片段，用于制造治疗癌症的药剂的用途。

在另一个方面，提供了I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和ICOS结合蛋白或其抗原结合片段，用于治疗癌症的用途。

在一个方面，本发明提供了包含治疗有效量的I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂的药物组合物、以及包含治疗有效量的ICOS结合蛋白或其抗原结合片段的第二药物组合物。

在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含治疗有效量的I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和ICOS结合蛋白或其抗原结合片段。

在仍另一个方面，本发明提供了I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和ICOS结合蛋白或其抗原结合片段的组合。

在另一个方面，提供了作为组合制剂的含有I型PRMT抑制剂和抗ICOS抗体或其抗原结合片段的产物，其用于治疗人受试者中的癌症。

在一个实施方案中，ICOS结合蛋白或其抗原结合片段是抗ICOS抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，ICOS结合蛋白或其抗原结合片段是ICOS激动剂。在一个实施方案中，ICOS结合蛋白或其抗原结合片段包含以下中的一种或多种：如SEQ ID NO：1中所示的CDRH1；如SEQ ID NO：2中所示的CDRH2；如SEQ ID NO：3中所示的CDRH3；如SEQ ID NO：4中所示的CDRL1；如SEQ ID NO：5中所示的CDRL2，和/或如SEQ ID NO：6中所示的CDRL3或每个CDR的直接等同物，其中直接等同物具有在所述CDR中的不多于两个氨基酸取代。在另一个实施方案中，ICOS结合蛋白或其抗原结合部分包含V

在一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)抑制剂、或蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)抑制剂。在一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是式I、II、V或VI的化合物。在一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是化合物A。在另一个实施方案中，I型PRMT抑制剂是化合物D。

在一个方面，本发明提供了I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和ICOS结合蛋白或其抗原结合片段，其用于治疗有此需要的人中的癌症，其中所述I型PRMT抑制剂是化合物A或其药学上可接受的盐，并且所述ICOS结合片段或其抗原结合片段包含以下中的一种或多种：如SEQ ID NO：1中所示的CDRH1；如SEQ ID NO：2中所示的CDRH2；如SEQ IDNO：3中所示的CDRH3；如SEQ ID NO：4中所示的CDRL1；如SEQ ID NO：5中所示的CDRL2，和/或如SEQ ID NO：6中所示的CDRL3或每个CDR的直接等同物，其中直接等同物具有在所述CDR中的不多于两个氨基酸取代。

在另一个方面，本发明提供了I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和ICOS结合蛋白或其抗原结合片段，其用于治疗有此需要的人中的癌症，其中所述I型PRMT抑制剂是化合物A或其药学上可接受的盐，并且所述ICOS结合蛋白或其抗原结合部分包含V

在一个方面，提供了治疗有此需要的人中的癌症的方法，该方法包括向人施用治疗有效量的I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂，并且向人施用治疗有效量的ICOS结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述I型PRMT抑制剂是化合物A或其药学上可接受的盐，并且所述ICOS结合片段或其抗原结合片段包含以下中的一种或多种：如SEQ ID NO：1中所示的CDRH1；如SEQ ID NO：2中所示的CDRH2；如SEQ ID NO：3中所示的CDRH3；如SEQ IDNO：4中所示的CDRL1；如SEQ ID NO：5中所示的CDRL2，和/或如SEQ ID NO：6中所示的CDRL3或每个CDR的直接等同物，其中直接等同物具有在所述CDR中的不多于两个氨基酸取代。

在另一个方面，提供了治疗有此需要的人中的癌症的方法，该方法包括向人施用治疗有效量的I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂，并且向人施用治疗有效量的ICOS结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述I型PRMT抑制剂是化合物A或其药学上可接受的盐，并且所述ICOS结合蛋白或其抗原结合部分包含V

在一个实施方案中，癌症是实体瘤或血液学癌症。在一个实施方案中，癌症是黑色素瘤、淋巴瘤或结肠癌。

在一个实施方案中，癌症选自头颈癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos病、炎症性乳腺癌、肾母细胞瘤、尤文氏肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、肾癌、肝癌、黑色素瘤、胰腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨巨细胞瘤、甲状腺癌、成淋巴细胞性T细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、AML、慢性嗜中性粒细胞性白血病、急性成淋巴细胞性T细胞白血病、浆细胞瘤、免疫母细胞性大细胞白血病、套细胞白血病、多发性骨髓瘤、巨核母细胞性白血病、多发性骨髓瘤、急性巨核细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、红白血病、恶性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成淋巴细胞性T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、外阴癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、间皮瘤、食道癌、唾液腺癌、肝细胞癌、胃癌、鼻咽癌、口腔癌、口癌、GIST(胃肠道间质瘤)和睾丸癌。

在一个实施方案中，人患有实体瘤。在一个实施方案中，肿瘤选自头颈癌、胃癌、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、食道癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌和胰腺癌。在另一个实施方案中，人患有液体肿瘤，例如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、多发性骨髓瘤、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、急性髓样白血病和慢性粒细胞性白血病。

本公开内容还涉及用于治疗或减轻选自以下的癌症的严重性的方法：脑(神经胶质瘤)、胶质母细胞瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos病、乳腺、炎症性乳腺癌、肾母细胞瘤、尤文氏肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、结肠、头与颈、肾、肺、肝、黑色素瘤、卵巢、胰腺、前列腺、肉瘤、骨肉瘤、骨巨细胞瘤、甲状腺、成淋巴细胞性T细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性嗜中性粒细胞性白血病、急性成淋巴细胞性T细胞白血病、浆细胞瘤、免疫母细胞性大细胞白血病、套细胞白血病、多发性骨髓瘤、巨核母细胞性白血病、多发性骨髓瘤、急性巨核细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、红白血病、恶性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成淋巴细胞性T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、外阴癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、间皮瘤、食道癌、唾液腺癌、肝细胞癌、胃癌、鼻咽癌、口腔癌、口癌、GIST(胃肠道间质瘤)和睾丸癌。

如本文使用的，术语“治疗”及其语法变化意指治疗性疗法。在提及特定状况时，治疗意指：(1)改善状况的一种或多种生物学表现的状况，(2)干扰(a)导致或负责状况的生物学级联中的一个或多个点、或(b)状况的一种或多种生物学表现，(3)减轻与状况或其治疗相关的一种或多种症状、效应或副作用，或(4)减缓状况或者状况的一种或多种生物学表现的进展。由此也考虑了预防性疗法。技术人员应了解，“预防”不是绝对术语。在医学中，“预防”应理解为指药物的预防性施用，以基本上减小状况或其生物学表现的可能性或严重性、或者延迟此类状况或其生物学表现的发作。例如，当受试者被视为处于发展癌症的高风险时，例如当受试者具有强癌症家族史或受试者已暴露于致癌物时，预防性疗法是适当的。

如本文使用的，术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”可互换使用，并且以单数或复数形式，指已经历使其对宿主生物病理性的恶性转化的细胞。通过充分建立的技术，特别是组织学检查，可以容易地将原发性癌细胞与非癌性细胞区分开。如本文使用的，癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，还包括衍生自癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞，以及衍生自癌细胞的体外培养物和细胞系。当提及通常表现为实体瘤的癌症类型时，“临床可检测的”肿瘤是基于肿瘤块可检测的肿瘤；例如，通过程序如在物理检查时的计算机断层摄影(CT)扫描、磁共振成像(MRI)、X射线、超声或触诊，和/或由于在可得自患者的样品中的一种或多种癌症特异性抗原的表达而可检测的肿瘤。肿瘤可以是造血的(或血液、血液学或血液相关的)癌症，例如衍生自血细胞或免疫细胞的癌症，其可以被称为“液体肿瘤”。基于血液肿瘤的临床状况的具体实例包括白血病，例如慢性髓性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病；浆细胞恶性肿瘤，例如多发性骨髓瘤、MGUS和华氏巨球蛋白血症；淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤；等等。

癌症可以是其中存在异常数目的胚细胞或不需要的细胞增殖、或者被诊断为血液学癌症的任何癌症，所述血液学癌症包括淋巴样和髓样恶性肿瘤两者。髓样恶性肿瘤包括但不限于急性髓样(或髓性或粒细胞性或成髓细胞性)白血病(未分化或分化型)、急性前髓样白血病(或早幼粒细胞性或前骨髓细胞性或前成髓细胞性)白血病、急性骨髓单核细胞性(或粒单核细胞性)白血病、急性单核细胞性(或单核母细胞性)白血病、红白血病和巨核细胞性(或巨核母细胞性)白血病。这些白血病可以统称为急性髓样(或髓性或粒细胞性)白血病(AML)。髓样恶性肿瘤还包括骨髓增殖性病症(MPD)，其包括但不限于慢性粒细胞性(或髓样)白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、原发性血小板增多症(或血小板增多)和真性红细胞增多症(PCV)。髓样恶性肿瘤还包括骨髓增生异常(或骨髓增生异常综合症或MDS)，其可以被称为难治性贫血(RA)、难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)、以及转化中的难治性贫血伴原始细胞增多(RAEBT)；以及伴有或不伴有原因不明性髓样化生的骨髓纤维化(MFS)。

造血系统癌症还包括淋巴样恶性肿瘤，其可能影响淋巴结、脾、骨髓、外周血和/或结节外部位。淋巴样癌症包括B细胞恶性肿瘤，其包括但不限于B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)。B-NHL可能是惰性的(或低分级的)、中等分级的(或侵袭性的)或高分级的(高度侵袭性的)。惰性B细胞淋巴瘤包括滤泡性淋巴瘤(FL)；小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)；边缘区淋巴瘤(MZL)，包括淋巴结MZL、结节外MZL、脾MZL和伴有绒毛淋巴细胞的脾MZL；淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)；和粘膜相关淋巴样组织(MALT或结节外边缘区)淋巴瘤。中等分级B-NHL包括伴有或不伴有白血病牵涉的套细胞淋巴瘤(MCL)，弥漫性大细胞淋巴瘤(DLBCL)，滤泡性大细胞(或3级或3B级)淋巴瘤和原发性纵隔淋巴瘤(PML)。高分级B-NHL包括伯基特淋巴瘤(BL)，伯基特样淋巴瘤，小无裂细胞淋巴瘤(SNCCL)和淋巴母细胞淋巴瘤。其它B-NHL包括免疫母细胞性淋巴瘤(或免疫细胞瘤)，原发性渗出性淋巴瘤，HIV相关(或AIDS相关)淋巴瘤、以及移植后淋巴增殖性病症(PTLD)或淋巴瘤。B细胞恶性肿瘤还包括但不限于慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，幼淋巴细胞性白血病(PLL)，华氏巨球蛋白血症(WM)，毛细胞白血病(HCL)，大颗粒淋巴细胞(LGL)白血病，急性淋巴样(或淋巴细胞性或成淋巴细胞性)白血病和Castleman病。NHL还可以包括T细胞非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)，其包括但不限于非特指型T细胞非霍奇金淋巴瘤(NOS)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、血管免疫母细胞淋巴样病症(AILD)、鼻天然杀伤(NK)细胞/T细胞淋巴瘤、γ/δ淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿和塞扎里综合症。

造血系统癌症还包括霍奇金淋巴瘤(或疾病)，其包括经典霍奇金淋巴瘤、结节性硬化性霍奇金淋巴瘤、混合细胞性霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞为主型(LP)霍奇金淋巴瘤、结节性LP霍奇金淋巴瘤和淋巴细胞消减型霍奇金淋巴瘤。造血系统癌症还包括浆细胞疾病或癌症，例如多发性骨髓瘤(MM)包括冒烟型MM、意义未明(或未知或不确定)的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、浆细胞瘤(骨、髓外)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)、华氏巨球蛋白血症、浆细胞白血病和原发性淀粉样变性(AL)。造血系统癌症还可以包括另外的造血细胞的其它癌症，所述另外的造血细胞包括多形核白细胞(或嗜中性粒细胞)、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、血小板、红细胞和天然杀伤细胞。在本文中称为“造血细胞组织”的包括造血细胞的组织包括骨髓；外周血；胸腺；以及外周淋巴样组织，例如脾、淋巴结、与粘膜相关的淋巴样组织(例如与肠相关的淋巴样组织)、扁桃体、派尔集合淋巴结和阑尾、以及与其它粘膜相关的淋巴样组织例如支气管衬里。

在一个实施方案中，本发明的组合的一种或多种组分静脉内施用。在一个实施方案中，本发明的组合的一种或多种组分经口施用。在另一个实施方案中，本发明的组合的一种或多种组分瘤内施用。在另一个实施方案中，本发明的组合的一种或多种组分全身例如静脉内施用，并且本发明的组合的一种或多种其它组分瘤内施用。在任何实施方案中，例如在本段中，本发明的组分作为一种或多种药物组合物施用。

在一个实施方案中，I型PRMT抑制剂或者ICOS结合蛋白或其抗原结合片段以选自以下的途径施用于患者：同时、序贯、以任何次序、全身、经口、静脉内和瘤内。在一个实施方案中，I型PRMT抑制剂经口施用。在另一个实施方案中，ICOS结合蛋白或其抗原结合片段静脉内施用。

在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括向所述人施用至少一种肿瘤剂。本发明的方法也可以与癌症治疗的其它治疗方法一起采用。

通常，相对于待治疗的易感肿瘤具有活性的任何抗肿瘤剂可以在本发明的癌症治疗中共施用。此类试剂的实例可以在通过V.T. Devita，T.S. Lawrence和S.A. Rosenberg(编辑)的Cancer Principles and Practice of Oncology，第10版(2014年12月5日)，Lippincott Williams & Wilkins Publishers中找到。基于药物的特定特征和所涉及的癌症，本领域普通技术人员能够辨别哪种试剂组合将是有用的。可用于本发明的典型抗肿瘤剂包括但不限于抗微管剂或抗有丝分裂剂，例如二萜类和长春花生物碱；铂配合络合物；烷化剂，例如氮芥、氧氮杂膦、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯；抗生素，例如放线菌素、蒽环素和博来霉素；拓扑异构酶I抑制剂，例如喜树碱；拓扑异构酶II抑制剂，例如表鬼臼毒素；抗代谢物，例如嘌呤和嘧啶类似物以及抗叶酸化合物；激素和激素类似物；信号转导途径抑制剂；非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂；免疫治疗剂；促凋亡剂；细胞周期信号传导抑制剂；蛋白酶体抑制剂；热休克蛋白抑制剂；癌症代谢抑制剂；和癌症基因疗法试剂，例如遗传修饰的T细胞。

用于与本方法或组合以组合使用或共施用的进一步的一种或多种活性成分的实例是抗肿瘤剂。抗肿瘤剂的实例包括但不限于化学治疗剂；免疫调节试剂；免疫调节剂；和免疫刺激性佐剂。

实施例

下述实施例示出了本发明的各种非限制性方面。

实施例1

精氨酸甲基化和PRMT

精氨酸甲基化是对涉及各种范围的细胞过程的蛋白质的重要翻译后修饰，所述细胞过程例如基因调控、RNA加工、DNA损伤应答和信号转导。含有甲基化精氨酸的蛋白质存在于核和胞质级分两者中，提示了在这些亚细胞区室各处也存在催化甲基转移至精氨酸上的酶(在以下中进行综述：Yang，Y. & Bedford，M. T. Protein argininemethyltransferases and cancer.

精氨酸甲基化在很大程度上在富含甘氨酸、精氨酸(GAR)的基序的背景下，通过蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)家族的活性而发生，所述酶家族将甲基从S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)转移到底物精氨酸侧链，产生S-腺苷-高半胱氨酸(SAH)和甲基化的精氨酸(图1)。该蛋白质家族由10个成员组成，其中9个已显示具有酶促活性(Bedford，M. T. & Clarke，S. G. Protein arginine methylation in mammals：who，what，and why.

PRMT1是主要的1型酶，其能够催化众多细胞底物上的MMA和ADMA形成(Bedford，M.T. & Clarke，S. G. Protein arginine methylation in mammals：who，what，and why.

小鼠中的

PRMT1和癌症

PRMT1的错误调控和过表达已与许多实体癌和造血癌症相关(Yang，Y. &Bedford，M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer.

几项研究已将PRMT1与血液学肿瘤和实体瘤的发展相联系。PRMT1通过关键驱动因素(例如MLL和AML1-ETO融合物)的甲基化与白血病发展相关，导致致癌途径的激活(Shia，W. J.等人PRMT1 interacts with AML1-ETO to promote its transcriptionalactivation and progenitor cell proliferative potential.

RNA结合蛋白和剪接机制是PRMT1底物的主要类别，并且已通过其生物学功能以及白血病中的复发突变而牵涉癌症生物学(Bressan，G. C.等人Arginine methylationanalysis of the splicing-associated SR protein SFRS9/SRP30C.

总之，PRMT1对癌症相关途径的影响提示了抑制可能导致抗肿瘤活性，对于AML、淋巴瘤和实体瘤适应症的治疗提供了新型治疗机制。如新出现的文献中所述的，几种机制支持在血液学肿瘤和实体瘤中使用PRMT1抑制剂的理论基础，所述机制包括：抑制白血病中AML-ETO驱动的肿瘤发生、抑制乳腺癌中促进生长的信号转导、以及通过RNA结合蛋白的甲基化和剪接体机制来调节剪接。I型PRMT包括PRMT1的抑制代表了压制异常癌细胞增殖和存活的易驾驭策略。

生物化学

用化合物A进行了详细的体外生物化学研究，以表征针对I型PRMT的效力和抑制机制。

通过底物竞争实验探索了化合物A对于PRMT1的抑制机制。通过根据底物浓度除以其

在不同的SAM：PRMT1：化合物A预温育时间和20分钟反应之后，通过测量IC

关于时间依赖性抑制的两种解释是缓慢结合可逆抑制和不可逆抑制。为了区分这两种机制，亲和力选择质谱法(ASMS)用于检查化合物A与PRMT1的结合。ASMS首先将结合的配体与未结合的配体分开，然后通过MS检测可逆结合的配体。PRMT1：SAM与化合物A的2小时预温育，用于确保基于图5A中所示的曲线，完全形成时间依赖性复合物(ESI *)，其中在预温育20分钟后观察到最大效力。在这些条件下，化合物A使用ASMS是可检测的。这提示了主要机制本质上是可逆的，因为ASMS不能检测不可逆结合的化合物A。确定性可逆性研究包括解离速率分析尚未执行，并且将进一步验证该机制。

为了确定抑制剂结合模式，测定了与PRMT1和SAH结合的化合物A的共晶体结构(2.48 Å分辨率)(图6)。SAH是通过PRMT1从SAM中去除甲基后形成的产物；因此，SAH和SAM应该类似地占据PRMT1的同一袋。该抑制剂在与SAH袋直接相邻的通常由底物肽占据的裂隙中结合，并且其二胺侧链占据假定的精氨酸底物位点。末端甲胺与Glu162侧链残基形成氢键，所述Glu162侧链残基与SAH的硫醚相距3.6 Å，并且SAH结合袋通过Tyr57和Met66桥接至化合物A。化合物A通过在化合物A的吡唑氮的质子与Glu65的酸性侧链之间的氢键形成而结合PRMT1；二乙氧基支化的环己基部分沿着溶剂的暴露表面，位于由Tyr57、Ile62、Tyr166和Tyr170形成的疏水沟槽中。SAH和抑制剂结合之间的空间分离、以及与残基例如Tyr57的相互作用，可以支持酶研究中揭示的SAM反竞争性机制。化合物A在底物肽袋中结合，并且二胺侧链可以模拟底物精氨酸残基的胺的发现，暗示了抑制剂模式可能是与肽竞争。抑制研究的生物化学模式支持化合物A是关于肽的混合抑制剂(图4B)。化合物A的时间依赖性行为、以及肽裂隙外部的底物肽的异位点结合的可能性，两者均可以导致与肽非竞争的抑制模式，解释了通过结构和生物化学研究提示的模式中的差异。

为了促进毒理学研究的解释，针对PRMT1的大鼠和犬直系同源物评估了化合物A的效力。与人PRMT1一样，化合物A显示针对大鼠和犬PRMT1的时间依赖性抑制，其IC

跨越PRMT家族成员的实验对象组评价了化合物A的选择性。在60分钟SAM：酶：化合物A预温育之后，针对代表性的I型(PRMT3、PRMT4、PRMT6和PRMT8)和II型(PRMT5/MEP50和PRMT9)家族成员确定IC

为了进一步表征化合物A的选择性，在单一浓度的化合物A(10 μM，ReactionBiology)下，评估了21种甲基转移酶的抑制。观察到针对PRDM9的最高抑制程度，18%。总体而言，化合物A显示了测试的甲基转移酶的最小抑制，提示了它是I型PRMT的选择性抑制剂(表2)。另外的选择性测定在安全性节段中进行描述。

表2就通过化合物A的抑制测试的甲基转移酶。不依赖于SAM Km值，在SAM的固定浓度(1 μM)下测定酶。

总之，化合物A是I型PRMT家族成员的有力、可逆、选择性抑制剂，显示了针对PRMT1、PRMT6和PRMT8等价的生物化学效力，具有范围为3-5 nM的IC

生物学

预测PRMT1的抑制导致细胞PRMT1底物(包括组蛋白H4的精氨酸3(H4R3me2a))上的ADMA降低，具有MMA和SDMA中的伴随增加(Dhar，S.等人Loss of the major Type Iarginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs.

来自从通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas)(TCGA)的> 100项癌症研究中收集的多重肿瘤类型的基因表达数据的分析、以及cBioPortal中代表的其它原发性肿瘤数据库，指示了PRMT1在癌症中是高度表达的，相对于其它实体和血液学恶性肿瘤，在淋巴瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤，DLBCL)中具有最高水平(图10)。还调查了ACTB(常见的管家基因)和TYR(在皮肤中选择性表达的基因)的表达，以分别表征与高遍在表达或组织限制性表达相关的范围。在其它癌症中，在淋巴瘤中的高表达提供了另外的信心，即化合物A抑制的靶存在于原发性肿瘤中，所述原发性肿瘤对应于临床前研究中评估的细胞系。PRMT 3、4和6也跨越一系列肿瘤类型表达，而鉴于其组织特异性表达，PRMT8表达似乎如预测的更受限制(Lee，J.，Sayegh，J.，Daniel，J.，Clarke，S. & Bedford，M. T. PRMT8，a newmembrane-bound tissue-specific member of the protein argininemethyltransferase family.

使用定量作为细胞数目替代物的ATP的Cell Titer Glo(Promega)，在6天生长-死亡测定中，分析了化合物A抑制培养的肿瘤细胞系生长的能力。跨越广泛范围的接种密度，随着时间过去评估所有细胞系的生长，以鉴定在整个6天测定自始至终允许增殖的条件。将细胞以最佳接种密度铺平板，并且在过夜温育后，加入20点2倍滴定的化合物，并且使平板温育6天。在化合物添加时收获细胞的重复平板，以定量细胞的起始数目(T

化合物A在大多数细胞系中诱导了接近或完全的生长抑制，其子集显示了细胞毒性应答，如通过负Y

表3 化合物A的6天增殖概括。基于在大鼠14天MTD中达到的浓度(150 mg/kg，C

化合物A的抗增殖效应的评估指示，PRMT1的抑制导致跨越细胞系的有力的抗肿瘤活性，所述细胞系代表一系列实体和血液学恶性肿瘤。总之，这些数据提示了在实体和血液学恶性肿瘤中的临床开发是有正当理由的。优先适应症包括：

● 淋巴瘤：54%的细胞系中的细胞毒性

● AML：50%的细胞系中的细胞毒性

● 肾细胞癌：60%的细胞系中的gIC

● 黑色素瘤：71%的细胞系中的gIC

● 乳腺癌包括TNBC：41%的细胞系中的gIC

淋巴瘤生物学

为了评估化合物A对淋巴瘤中的精氨酸甲基化的作用，人DLBCL细胞系(Toledo)用0.4 μM化合物A或媒介物处理至多120小时，这之后通过使用关于各种精氨酸甲基化状态的抗体的蛋白质分析，来评估蛋白质裂解产物。如预测的，在化合物暴露时，ADMA甲基化降低而MMA增加(图12)。还观察到SDMA水平中的增加，提示了MMA中的增加可能已导致PRMT5(SDMA形成的主要催化剂)的潜在底物池中的累积。鉴于具有变化动力学的众多底物的检测、以及在DMSO处理的样品中ADMA水平的可变性，整个泳道和突出的45kDa条带两者均进行表征，以评价ADMA。MMA中的增加到24小时是显而易见的，并且到48小时接近最大，而45 kDaADMA条带中的降低需要72-96小时来达到最大效应。在化合物暴露48小时后，SDMA中的增加是显而易见的，并且持续增加直到120小时，这与MMA通过I型PRMT转换为ADMA通过II型PRMT转换为SDMA的潜在转变相一致(图12)。

在淋巴瘤细胞系的实验对象组中，确定了与化合物A对精氨酸甲基化(MMA、ADMA、SDMA)的作用相关的剂量应答(图13)。跨越整个泳道和单个45 kDa条带(其跨越所有评估的细胞系中降低至无法检测的水平)测量了ADMA降低。总体而言，达到最大效应的50%所需的浓度跨越细胞系是相似的，并且并不对应于6天生长死亡测定中的gIC

为了确定响应化合物A的精氨酸甲基化中的总体变化的持久性，在化合物洗出后，在用化合物A处理的细胞中评价了ADMA、SDMA和MMA水平(图14)。将Toledo细胞用0.4 µM化合物A培养72小时，以建立对精氨酸甲基化标记的稳固作用。然后将细胞洗涤，在无化合物A的培养基中进行培养，每天收集样品直到120小时，并且通过蛋白质分析检查精氨酸甲基化水平。MMA水平快速降低，到化合物A洗出后24小时恢复至基线，而ADMA和SDMA分别到24小时和96小时恢复至基线。值得注意的是，相对于ADMA的Western印迹中的大多数其它种类，45kDa ADMA条带的恢复似乎是延迟的，提示了通过化合物A的精氨酸甲基化变化的持久性可能因底物而异。即使在洗出6小时后，SDMA似乎仍继续增加。这与以下相一致：直到120小时观察到的持续增加，而无明显平台期(图12)，加上MMA中的持久增加，其在洗出后仍未恢复至基线。每种修饰的持久性一般反映了由化合物A造成的精氨酸甲基化变化的动力学，其中MMA是最快速的。

为了评价与通过化合物A的生长抑制相关的时间过程，在淋巴瘤细胞系的子集中，执行了延长持续时间的生长-死亡测定。与先前描述的6天增殖测定相似，优化了接种密度，以确保在测定的持续时间自始至终的生长，并且在从第3-10天开始的选定时间点，通过CTG评价了细胞数目。在Toledo和Daudi淋巴瘤细胞系中，早在6天就观察到生长抑制，并且到8天达到最大(图15)。

在第6天和第10天时，评估了更大的细胞系集合，以测量对化合物A的延长暴露的效应，并且确定在6天测定中展示细胞抑制性应答的细胞系，是否可能在以后的时间点经历细胞毒性。对化合物A的延长时间暴露跨越评估的淋巴瘤细胞系，对效力(gIC

考虑到生长抑制在第6天时是显而易见的，并且延长暴露对效力或抑制百分比具有最低限度的影响，因此代表霍奇金和非霍奇金亚型的淋巴瘤细胞系的广泛实验对象组，以6天生长-死亡测定形式进行评估(图17)。所有亚型在这种形式中似乎同等敏感，并且不依赖于分类，许多细胞系经历了细胞毒性(如通过负Y

增殖测定结果提示，PRMT1的抑制在淋巴瘤细胞系的子集中诱导显而易见的细胞毒性。为了进一步阐明这种效应，使用碘化丙锭染色，随后为流式细胞术，评估用化合物A处理的淋巴瘤细胞系中的细胞周期分布。在6天增殖测定中显示一系列Y

为了确认细胞周期的FACS分析，在10天的时间过程期间执行了半胱天冬酶切割的评估，作为凋亡的另外量度。优化接种密度，以确保在测定的持续时间自始至终的一致生长，并且使用发光Caspase-Glo 3/7测定(Promega)评价半胱天冬酶激活。Caspase-Glo 3/7信号针对细胞数目(通过CTG评价的)进行标准化，并且显示为相对于对照(DMSO处理的)细胞的诱导倍数。在DLBCL细胞系中，经过10天的时间过程，监测半胱天冬酶3/7活性，显示了对化合物A的细胞毒性(Toledo)和细胞抑制性(Daudi)应答(图19)。与生长-死亡测定中观察到的概况一致，Toledo细胞系在所有时间点显示了稳固的半胱天冬酶激活，同时伴随细胞数目中的降低，而Daudi细胞系中的半胱天冬酶活性诱导较不明显，并且限于化合物A的最高浓度。

这些数据连同细胞周期概况一起指示，化合物A在Toledo DLBCL细胞系中诱导半胱天冬酶介导的凋亡，提示了在其它淋巴瘤细胞系中观察到的细胞毒性可能反映了通过化合物A的凋亡途径激活。

在Toledo(人DLBCL)异种移植模型中，评价了化合物A对肿瘤生长的作用。将荷有皮下Toledo肿瘤的雌性SCID小鼠称重，用测径器测量肿瘤，并且根据肿瘤大小，将小鼠随机区块分组到各10只小鼠的处理组内。小鼠用赋形剂或化合物A(150 mg/kg- 600 mg/kg)进行经口给药，每天一次，共28天。在研究自始至终，将小鼠称重，并且每周两次进行肿瘤测量。在所有剂量下都观察到显著的肿瘤生长抑制(TGI)，并且在

鉴于在所有评估的剂量下都观察到完全TGI，执行第二项研究以测试以较低剂量的化合物A的抗肿瘤效应，以及比较每天两次(BID)相对于每天一次(QD)的给药。在该第二项研究中，小鼠用媒介物或化合物A(37.5 mg/kg- 150 mg/kg)进行经口给药，共24天QD或75 mg/kg BID。在该研究中，75 mg/kg的BID施用导致与150 mg/kg相同的TGI(分别为95%和96%)，而

另外的肿瘤类型

除淋巴瘤细胞系之外，在6天增殖测定中检查的AML细胞系子集中，化合物A具有有力的细胞毒性活性(表3)。10个细胞系中的8个具有< 2μM的gIC

表4 AML细胞系中的化合物A活性概括

与淋巴瘤中的研究相似，在第6天和第10天时评估了细胞系集合，以测量对化合物A的延长暴露的效应，并且确定在6天测定中展示细胞抑制性应答的AML细胞系，是否可能在以后的时间点经历细胞毒性。与淋巴瘤结果一致，对化合物A的延长时间暴露跨越评估的AML细胞系，对效力(gIC

与其它实体瘤类型相比，肾细胞癌细胞系具有最低的中值gIC

表5 在肾细胞癌细胞中的化合物A抗增殖效应的概括

为了评价通过化合物A在肾癌细胞系中的生长抑制的时间进程，在第3、4、5和6天，在4个ccRCC细胞系的实验对象组中，通过CTG评价了细胞生长(图22)。活性中的最大转变在第3天和第4天之间发生，其中所有细胞系都显示了降低的gIC

在增殖时间过程期间评估了半胱天冬酶激活，并且与如通过Y

在荷有人肾细胞癌异种移植物(ACHN)的小鼠中，评价了化合物A对肿瘤生长的作用。将荷有皮下ACHN细胞系肿瘤的雌性SCID小鼠称重，并且通过测径器测量肿瘤，并且根据肿瘤大小，随机区块分组到各10只小鼠的处理组内。小鼠用赋形剂或化合物A(150 mg/kg -600 mg/kg)进行经口给药，每天一次，直到59天。在研究自始至终，将小鼠称重，并且每周两次进行肿瘤测量。在所有剂量下都观察到显著的肿瘤生长抑制，并且在

表6 化合物A的体内功效

总之，这些数据提示，在人实体和血液学肿瘤的皮下异种移植物中，可以以相似的剂量达到100% TGI。

乳腺癌细胞系展示对化合物A的一系列敏感性，并且在许多情况下，在6天增殖测定中显示了部分生长抑制(图24)。与非TNBC细胞系相比，代表三阴性乳腺癌(TNBC)的细胞系具有略微更低的中值gIC

在实体瘤类型中，化合物A在黑色素瘤细胞系中具有最有力的抗增殖效应(图11)。评价的7个系中的6个具有小于2 μM的gIC

表7 黑色素瘤细胞系中的化合物A活性的概括

实施例2

在同基因癌症模型中，ICOS激动与I型PRMT抑制组合的协同活性

我们探索了通过化合物D的I型PRMT抑制的组合，是否可以增加抗ICOS抗体在免疫活性的肿瘤模型中的功效。化合物D单独给药，以及与抗ICOS激动剂抗体(Icos17G9-GSK)组合给药。在CT26和EMT6肿瘤模型两者中，该组合提供了超过任一单一试剂的显著存活益处(图26A、图26B)。在3周给药期过程中，在两个模型中的组合组中观察到个别肿瘤生长的延迟(图26C)。

使用下述材料和方法获得了实施例2中描述的结果：

小鼠、肿瘤攻击和处理

7周龄的雌性BALB/c小鼠(BALB/cAnNCrl，Charles River)用于遵守USDA实验室动物福利法(Laboratory Animal Welfare Act)，在完全认可的AAALAC设施(Charles RiverLaboratories)中的体内研究。将3 x 10

序列表

<110> GlaxoSmithKline Intellectual Propety Development Limited

<120> 组合疗法

<130> PU66518

<150> 62/678536

<151> 2018-05-31

<160> 18

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(homo sapien)

<400> 1

Cys Asp Arg His Asp Tyr Ala Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Leu Ile Ser Ile Tyr Ser Asp His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Asn Asn Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Ser Ile Tyr Ser Asp His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg Asn Asn Tyr Gly Asn Tyr Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人ICOS同种型2的氨基酸序列

<400> 9

Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys

1 5 10 15

Val Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile

20 25 30

Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val

35 40 45

Gln Gln Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp

50 55 60

Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu

65 70 75 80

Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu

85 90 95

Tyr Asn Leu Asp His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser

100 105 110

Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu

115 120 125

His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp Leu Pro

130 135 140

Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu

145 150 155 160

Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Met

165

<210> 10

<211> 199

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人ICOS同种型1的氨基酸序列

<400> 10

Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys

1 5 10 15

Val Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile

20 25 30

Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val

35 40 45

Gln Gln Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp

50 55 60

Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu

65 70 75 80

Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu

85 90 95

Tyr Asn Leu Asp His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser

100 105 110

Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu

115 120 125

His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp Leu Pro

130 135 140

Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu

145 150 155 160

Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro

165 170 175

Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser

180 185 190

Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu

195

<210> 11

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 37A10S713的氨基酸序列

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp

20 25 30

Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val Ser

35 40 45

Asn Ile Asp Glu Asp Gly Ser Ile Thr Glu Tyr Ser Pro Phe Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Arg Trp Gly Arg Phe Gly Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 37A10S713的氨基酸序列

<400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Gly

20 25 30

Ser Phe Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Phe Tyr Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His His His Tyr

85 90 95

Asn Ala Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105 110

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 37A10S713的氨基酸序列

<400> 13

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Asp

1 5 10

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 37A10S713的氨基酸序列

<400> 14

Asn Ile Asp Glu Asp Gly Ser Ile Thr Glu Tyr Ser Pro Phe Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 37A10S713的氨基酸序列

<400> 15

Trp Gly Arg Phe Gly Phe Asp Ser

1 5

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 37A10S713的氨基酸序列

<400> 16

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Gly Ser Phe Asn Tyr Leu Thr

1 5 10 15

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 37A10S713的氨基酸序列

<400> 17

Tyr Ala Ser Thr Arg His Thr

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 37A10S713的氨基酸序列

<400> 18

His His His Tyr Asn Ala Pro Pro Thr

1 5