一种调控蛋白降解诱导基因协同致死的菌株及应用和方法

摘要

本发明涉及一种调控蛋白降解诱导基因协同致死的菌株构建方法，步骤如下：构建KanMX‑GPD‑Degron‑RAD51表达框，使用醋酸锂化学转化法将表达框转化到已敲除RAD27基因的酿酒酵母细胞中，构建由Degron控制RAD51表达的突变菌株。温度升高至37℃时，菌株中RAD51表达的蛋白被瞬时降解，使菌株协同致死。本发明利用简单快捷的方式构建协同致死基因菌株，在敲除一个协同基因的基础上，利用可诱导的蛋白降解控制另一个协同基因，瞬时降解必需蛋白，从而研究潜在的基因协同及互补关系。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是一种调控蛋白降解诱导基因协同致死的菌株及应用和方法，是一种通过温度、光或化学因子调控蛋白降解，来诱导基因协同致死，以及研究基因间相互作用的技术。

背景技术

如果两个基因功能具有互补性，单个基因缺失对细胞生长影响不大，而同时缺失(或突变)时则会导致细胞死亡，此称为协同致死(synthetic lethal)。研究基因间协同致死的分子机制不仅具有重要的生物学基础理论意义，更是药物开发的热点领域。例如，基于众多癌细胞的DNA修复缺陷，研究DNA修复途径间互补关系，利用特定蛋白抑制剂来阻断对癌细胞必需而正常细胞可耐受的DNA修复途径，即可特异性杀死癌细胞，这是临床放疗和化疗的基础，并被广泛用于开发肿瘤靶向药物，以及探索新的精准医疗策略。

在医药研发领域，协同致死的实现，最常用的是通过蛋白抑制剂。这是一类小分子化合物，可与蛋白分子活性中心上的一些基团结合，使蛋白活力下降，甚至消失。一个广为人知的例子是PARP抑制剂–它是一种靶向聚ADP核糖聚合酶(PARP)，抑制其活性的药物。这是第一种成功利用协同致死原理并获得批准在临床使用的抗癌药物。自2014年以来，已先后被美国FDA和欧洲EMA批准用于治疗携带BRCA基因突变的乳腺癌、卵巢癌和前列腺患者，数种药物目前也已在中国获批。

协同致死亦可通过RNA干扰的方式来实现。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的mRNA高效特异性降解的现象。通过DNA修饰以及染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录，或者通过启动细胞质内靶向mRNA序列的特异性的降解机制，来干扰基因转录水平，从而影响蛋白的表达，间接达到基因协同致死的目的。

然而，进行基因间互补关系和合成致死的基础研究，使用蛋白抑制剂或RNAi均面临一些困难：

1、研究基因间的互补关系，需要筛选大量相关基因，而特异性蛋白抑制剂种类很少，研发困难，远远不能进行全基因覆盖。

2、RNA干扰不能确保目的基因表达被完全抑制；会出现非特异性基因沉默；同时，因产生抑制所需的时间较长，细胞会激活替代通路，产生适应及耐受性等问题。

本发明提供了一种利用degron诱导蛋白降解来研究基因协同致死的方法。Degron译称‘降解决定子’，最初在植物中发现的，是激素控制的降解蛋白质的一种机制，通过E3泛素化机制完成。鉴于泛素化蛋白降解机制广泛存在于各种生物体中，利用其可建立一种通过温度、光或化学因子调控的、诱导蛋白快速降解的方法，称为Degron系统。尽管Degron系统在研究单个基因/蛋白功能方面有很多应用，但将其应用于基因的协同致死，特别是肿瘤治疗，尚未见报道。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种调控蛋白降解诱导基因协同致死的菌株及应用和方法，该菌株在构建时利用已有的蛋白降解技术，通过基因改造构建通用酵母菌株(或人体细胞)，来实现可潜在用于肿瘤治疗的基因协同致死及筛查功能互补的细胞信号通路。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种调控蛋白降解诱导基因协同致死的菌株，构建步骤如下：

首先，分别扩增筛选标记基因KanMX、启动子GPD、已报道的温控Degron工作元件、目的基因RAD51，利用重叠延伸PCR技术将四个目的片段连接成一个完整表达框；

然后，使用醋酸锂化学转化法将表达框转化到已敲除RAD27基因的酿酒酵母细胞中，利用其自身同源重组使表达框整合到酵母染色体特定位点，成功构建由Degron控制RAD51表达的突变菌株。

而且，所述重叠延伸PCR设计引物时，引物互补重叠部分大于15bp。

而且，所述筛选标记基因KanMX的引物为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，所述启动子GPD的引物为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，所述Degron工作元件的引物为SEQ ID NO.5、SEQID NO.6，所述目的基因RAD51的引物为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。

而且，所述重叠延伸PCR时分为两部分进行，第一步将之前纯化所得PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu酶进行PCR，退火温度为50-54℃，进行PCR5-10轮即可；

第二步取PCR产物做为模板，加入引物F及R进行PCR，退火温度为54-58℃，扩增出完整的表达框基因。

而且，所述构建的由Degron控制RAD51表达的突变菌株在正常培养条件下能够存活，当温度升高至37℃时，菌株中RAD51表达的蛋白被瞬时降解，从而使两个协同致死基因同时失去作用，使菌株发生了协同致死。

而且，所述构建的由Degron控制RAD51表达的突变菌株，由于RAD51基因与RAD27基因同时失去作用时，菌株无法存活，所以在不启动Degron时，只有RAD27基因缺失，但是RAD51正常表达，菌株能够正常存活。

如上所述的调控蛋白降解诱导基因协同致死的菌株在研究基因协同作用方面中的应用。

如上所述的调控蛋白降解诱导基因协同致死的菌株在协同致死基因靶点筛查方面中的应用。

利用如上所述的调控蛋白降解诱导基因协同致死的菌株研究基因协同作用的方法，其特征在于：步骤如下：

接种突变菌株于YPDA培养基，28℃摇床培养，根据实验要求进行处理细胞，在需要研究基因协同作用时，提高温度至37℃时，瞬时降解RAD51蛋白，从而达到协同基因同时缺失，而细胞存活的条件，进而提供肿瘤治疗相关基因靶点的筛查实验条件。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明使用Degron技术构建通用型菌株，来进行与肿瘤治疗相关的协同致死基因靶点筛查。在不影响菌株(细胞)正常功能的情况下，瞬时降解任何必需及非必需蛋白。从而有效解决了对于没有蛋白抑制剂的基因的筛查，避免了使用RNAi等方法时产生的非特异性和功能适应替补等问题。

2、本发明菌株构建简单快捷，成本低。未进行诱导时，菌株生长不受影响。通过温度、光或化学试剂控制突变菌株，实现快速可逆的蛋白降解，因而可方便研究潜在基因协同及互补关系。

3、本发明利用简单快捷的方式构建协同致死基因菌株，在敲除一个协同基因的基础上，利用可诱导的蛋白降解控制另一个协同基因，瞬时降解必需蛋白，从而研究潜在的基因协同及互补关系。

附图说明

图1为本发明中Degron表达框的构建图；

图2为本发明中突变菌株的构建图；其中，WT：阴性对照，1,3-5：构建成功菌株，2,6-10：阴性菌株；

图3为本发明中不同温度下调控蛋白降解诱导基因协同致死的敏感性实验图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。

一种调控蛋白降解诱导基因协同致死的菌株构建方法，以参与DNA重组的基因RAD51和DNA支链内切酶RAD27(FEN1)为例，筛查基因间协同致死的酵母菌株，步骤如下：

首先，分别扩增筛选标记基因KanMX、启动子GPD、温控Degron工作元件、目的基因RAD51序列。利用重叠延伸PCR技术将四个目的片段连接成一个完整表达框，如图1所示，①-④为普通PCR扩增的四个目的片段，首先①和②连接，③和④连接，最后重叠延伸连接成一个完整表达框。

具体地，首先使用普通PCR将四个表达元件分别扩增纯化，然后使用重叠延伸PCR将四个元件连接成一个完整的表达框，重叠延伸PCR设计引物时，需要注意引物互补重叠部分大于15bp以上，用pfu酶进行扩增。PCR时分为两部分进行，第一步将之前纯化所得PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu酶进行PCR，退火温度为50-54℃，进行PCR约5-10轮即可。第二步取PCR产物做为模板，加入引物F及R进行PCR，退火温度为54-58℃，扩增出完整的表达框基因。PCR引物见表1。

表1：PCR引物

然后，使用醋酸锂化学转化法将表达框转化到酿酒酵母细胞(已敲除RAD27基因的酵母菌株)中，利用其自身同源重组使表达框整合到酵母染色体特定位点，通过G418(遗传霉素)平板筛选，PCR验证单克隆菌落，成功构建由Degron控制RAD51表达的突变菌株，通过PCR验证如图2所示，突变株与野生菌对照发现，1,3,4,5号突变株为阳性菌株，成功转入了Degron-RAD51表达框，而其他菌株均为假阳性菌株。

获得突变菌株之后，通过协同致死机制进一步验证蛋白降解工作效率，分别接种野生酿酒酵母(WT)、敲除RAD27菌株(△rad27)、敲除RAD51菌株(△rad51)、敲除RAD27同时Degron控制RAD51菌株(△rad27+Degron-RAD51)于YPDA培养基中，28℃、220rpm摇床过夜培养，第二天早上转接活化，继续培养3-4小时，收取菌体，通过血球计数板计算菌液密度，取适量无菌超纯水稀释菌液至10

本发明可以通过构建已报道或者新发现的温控、药控或光控Degron系统，研究基因的“协同致死”机制，揭示细胞内DNA修复途径的选择及修复途径间的互补机制。构建Degron控制目的基因的突变菌株，目前Degron系统有温度、药物或者光照控制，以温度控制为例，在低温(低于30℃)培养条件下，Degron系统不工作，目的蛋白不会被降解，正常表达，而在高温(高于30℃)培养条件下，目的蛋白被泛素化降解。在从高温恢复到低温时，目的蛋白又可以重新正常表达。此时，可以进行后续的DNA修复途径间互补关系的基础研究。所以本发明可用于与肿瘤治疗相关的协同致死基因靶点筛查，研究潜在基因协同及互补关系。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学，齐鲁理工学院

<120> 一种调控蛋白降解诱导基因协同致死的菌株及应用和方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> KanMX-F(Unknown)

<400> 1

aaggggaata gtggggactg 20

<210> 2

<211> 37

<212> DNA/RNA

<213> KanMX-R(Unknown)

<400> 2

taaactcgaa gagctccagc cggtgtcggt ctcgtag 37

<210> 3

<211> 37

<212> DNA/RNA

<213> GPD-F(Unknown)

<400> 3

ctacgagacc gacaccggct ggagctcttc gagttta 37

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> GPD-R(Unknown)

<400> 4

ggatccacta gttctagaat 20

<210> 5

<211> 47

<212> DNA/RNA

<213> Degron-F(Unknown)

<400> 5

cgacggattc tagaactagt ggatccatgc agatcttcgt caagacg 47

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Degron-R(Unknown)

<400> 6

agcaccagca ccagcgtaat c 21

<210> 7

<211> 43

<212> DNA/RNA

<213> RAD51-F(Unknown)

<400> 7

gattacgctg gtgctggtgc tatgtctcaa gttcaagaac aac 43

<210> 8

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> RAD51-R(Unknown)

<400> 8

cggaacgcaa cctaagaaaa 20