稳定表达的水稻芽期耐冷QTL紧密连锁的分子标记及其应用

摘要

本发明公开了稳定表达的水稻芽期耐冷QTL紧密连锁的分子标记及其应用。属于水稻抗逆育种和分子遗传学技术领域。包括QTL位点：qCTBB 3a、qCTBB 3b和qCTBB 6；qCTBB 3a包括紧密连锁分子标记3ID1和3ID2；qCTBB 3b包括紧密连锁分子标记3ID3和3ID4；qCTBB 6包括紧密连锁分子标记6ID1、6ID2和6ID3；本发明通过检测与水稻芽期耐冷性基因座位连锁的分子标记，快速筛选出芽期耐冷性强的水稻品种，提高水稻芽期耐冷性筛选的可靠性、有效性；确定有无控制芽期耐冷性的基因导入到育种品系中，提高水稻芽期耐冷性状的选择效率，加快育种进程。

说明书

技术领域

本发明涉及水稻抗逆育种和分子遗传学技术领域，更具体的说是涉及稳定表达的水稻芽期耐冷QTL紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

水稻是世界上主要的粮食作物。低温胁迫是水稻稳定生产的主要限制因子之一。由于水稻直播这种耕作方式具有操作简便，劳动力成本低的特点，在中国的水稻主要生产区域被越来越广泛地采用(Jiang et al.,2006)。催芽之后的水稻品种被直接播种到水田里面，由于芽期经常会伴随无法预测的低温天气，这会影响芽的生长以及存活率，往往会导致秧苗长得不整齐，甚至出现烂芽死苗(Fujino and Matsuda,2010)。一些高产优质的水稻品种由于芽期耐冷性不好，而不能做直播稻。可见，培育芽期耐冷的品种不仅对于水稻品种适应当前中国的水稻耕作方式很重要，而且对于保障水稻的安全生产也非常重要。

培育芽期耐冷品种是水稻育种中的一个重要目标。传统育种方法费时、费力、表型鉴定困难、育种效率低，由于耐冷性是复杂的数量性状，耐冷反应涉及多个基因，且基因与环境间存在明显的互作效应，耐冷基因聚合更为困难。随着分子标记技术的发展，利用耐冷基因及与其紧密连锁的分子标记，开展分子标记辅助选择育种可以有效地解决这一问题。定位芽期耐冷QTL是开展耐冷性分子育种的基础。

但是芽期耐冷QTL定位比较困难，原因包括且不限于：

(1)芽期耐冷性的表型鉴定需要特定的极端温度条件，而且表型容易受到种子活力，环境等多因素影响，很难准确判定。

(2)在开展的芽期耐冷QTL的定位中，多数都是采用初级作图群体，由于双亲的遗传背景差异大，会出现QTL定位不准确等问题。

目前还没有芽期耐冷QTL聚合后显著提升芽期耐冷性的报道。这一方面是由于可在育种中应用的芽期耐冷QTL非常稀少；另一方面，优良的耐冷QTL往往存在于不同的水稻供体中，在开展聚合育种的时候，由于遗传背景的干扰，以及基因间的互作等因素，很难确定目标耐冷QTL聚合之后的效应。

因此，如何提供一种水稻芽期耐冷QTL，以及紧密连锁的分子标记是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了稳定表达的水稻芽期耐冷QTL紧密连锁的分子标记及其应用。本发明利用遗传背景一致的SSSL来开展芽期耐冷QTL的定位和聚合准确定位芽期耐冷QTL，开展分子聚合育种。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种水稻芽期耐冷QTL紧密连锁的分子标记，包括QTL位点：qCTBB 3a、qCTBB 3b和qCTBB 6；qCTBB 3a包括紧密连锁分子标记3ID1和3ID2；qCTBB3b包括紧密连锁分子标记3ID3和3ID4；qCTBB 6包括紧密连锁分子标记6ID1、6ID2和6ID3；

3ID1的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示；

3ID2的核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示；

3ID3的核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示；

3ID4的核苷酸序列为SEQ ID NO:10所示；

6ID1的核苷酸序列为SEQ ID NO:13所示；

6ID2的核苷酸序列为SEQ ID NO:16所示；

6ID3的核苷酸序列为SEQ ID NO:19所示。

优选的：3ID1的PCR扩增上游引物序列为5’-ATTCTATGCCGCCAACCAA-3’，如SEQ IDNO:2所示；

3ID1的PCR扩增下游引物序列为5’-GAATTGTCAACTTCAGCATCCC-3’，如SEQ ID NO:3所示；

3ID2的PCR扩增上游引物序列为5’-TACAGCCTCCTAATAGCATTGACC-3’，如SEQ IDNO:5所示；

3ID2的PCR扩增下游引物序列为5’-TCGAAGCTGCCGGTGTTG-3’，如SEQ ID NO:6所示；

3ID3的PCR扩增上游引物序列为5’-AGAACACCCGCTCCATCG-3’，如SEQ ID NO:8所示；

3ID3的PCR扩增下游引物序列为5’-AGCAGCACGCAGCCGCCTT-3’，如SEQ ID NO:9所示；

3ID4的PCR扩增上游引物序列为5’-GACGAGGAGGAGGAAGAGGA-3’，如SEQ ID NO:11所示；

3ID4的PCR扩增下游引物序列为5’-AGCAATCGGAGCAGCAAGAG-3’，如SEQ ID NO:12所示；

6ID1的PCR扩增上游引物序列为5’-ATGAGTGGAAGGCAAATACTTA-3’，如SEQ ID NO:14所示；

6ID1的PCR扩增下游引物序列为5’-CATTCGAACAAAACTCCCTAG-3’，如SEQ ID NO:15所示；

6ID2的PCR扩增上游引物序列为5’-CCCATCCGTCCACCACATA-3’，如SEQ ID NO:17所示；

6ID2的PCR扩增下游引物序列为5’-GCCGTATCAAATGAGTCAATAGC-3’，如SEQ ID NO:18所示；

6ID3的PCR扩增上游引物序列为5’-AACACGGCAGCTACCAAGA-3’，如SEQ ID NO:20所示。

6ID3的PCR扩增下游引物序列为5’-GTACGTTTACGTGTCATCTCGA-3’，如SEQ ID NO:21所示；

本发明还提供了一种水稻芽期耐冷QTL紧密连锁的分子标记的开发方法，包括以下步骤：

(1)以“南洋占”和“IR65598-112-2”为供体，“华粳籼74”为受体构建SSSL文库；

(2)采用回交和分子标记辅助选择相结合的方法，杂交和每次回交都以华粳籼74为受体；用分子标记进行全基因组的代换片段检测，直至筛选到纯合的SSSL单片段代换系；

(3)“南洋占”的单片段代换系经耐冷性鉴定，得到来源于“南洋占”第6染色体短臂区间的QTL区域信息；“IR65598-112-2”的单片段代换系经耐冷性鉴定得到来源于“IR65598-112-2”第3染色体长臂端区间的QTL区域信息；

(4)对“南洋占”的单片段代换系、“IR65598-112-2”的单片段代换系分别和受体“华粳籼74”进行基因组的重测序比较，并对“IR65598-112-2”的单片段代换系进行代换片段比较分析得到插入缺失的序列差异；

(5)根据缺失差异序列设计PCR引物，筛选获得“南洋占”第6染色体的耐冷QTL分子标记和“IR65598-112-2”第3染色体长臂端区间的QTL分子标记。

其中，步骤(2)用分子标记进行全基因组的代换片段检测为覆盖全基因组的分子标记，参考文献：曾瑞珍等,籼稻背景的单片段代换系群体的构建,2006,32(1):88～95,作物学报。

优选的：步骤(3)“南洋占”第6染色体短臂区间的QTL区域信息为第6染色体的0.05-0.75Mb区间；“IR65598-112-2”第3染色体长臂端区间的QTL区域信息为位于第3染色体的31.6～34.7Mb区间。

优选的：步骤(3)“IR65598-112-2”第3染色体长臂端区间的QTL区域信息包括位于31.7～32.9Mb区间的qCTBB 3a和位于32.9～34.6Mb区间的qCTBB 3b。

优选的：步骤(4)插入缺失的差异序列的位置为“IR65598-112-2”第3染色体的31.7Mb、32.2Mb、33.2Mb、34.6Mb处和“南洋占”第6染色体的0.383Mb、0.516Mb、0.668Mb处。

优选的：步骤(5)PCR的扩增体系：PCR的扩增体系包括：

扩增程序为：

94℃下预变性5min后；

94℃下变性30s；

55℃下退火30s；

72℃下延伸45s，35个循环；

最后72℃下延伸8min。

本发明还提供了一种基于上述的水稻芽期耐冷QTL分子标记或上述述的开发方法在水稻耐冷育种中的应用。

本发明还提供了一种基于上述的水稻芽期耐冷QTL分子标记在制备水稻耐冷基因检测试剂盒中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了稳定表达的水稻芽期耐冷QTL紧密连锁的分子标记及其应用，取得的技术效果在于：

通过检测与水稻芽期耐冷性基因座位连锁的分子标记，快速筛选出芽期耐冷性强的水稻品种，提高水稻芽期耐冷性筛选的可靠性、有效性；确定有无控制芽期耐冷性的基因导入到育种品系中，提高水稻芽期耐冷性状的选择效率，加快育种进程，经济高效。

本发明开发的分子标记首次从粳稻品种南洋占中在第6染色体的短臂上定位到控制芽期耐冷的QTL qCTBB 6,并获得了高度紧密连锁的INDEL标记6ID1、6ID2和6ID3。

本发明开发的分子标记首次从粳稻品系“IR65598-112-2”中在第3染色体的长臂端定位到控制2个芽期耐冷的QTL qCTBB 3a(紧密连锁分子标记为3ID1和3ID2)和qCTBB 3b(紧密连锁分子标记为3ID3和3ID4)。

利用上述芽期耐冷QTL连锁的分子标记能准确地判别是否带有耐冷QTL。

利用上述芽期耐冷QTL的聚合能显著地提升水稻芽期耐冷性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的单片段代换系与”华粳籼74”的表型差异示意图。

图2附图为本发明提供的SSSL的构建程序示意图。

图3附图为本发明提供的单片段代换系的区间位置示意图。

图4附图为本发明提供的QTL qCTBB 3a、qCTBB 3b的定位示意图，其中a和b表示在0.05水平上差异显著。

图5附图为本发明提供的利用连锁的分子标记创制聚合系，并进行表型(部分结果电泳)评价示意图，其中，1～27为在S6/S22的F2群体中单株的编号；A：华粳籼74；B：S6；C：S22。

图6附图为本发明提供的芽期耐冷性评价结果示意图，其中，亲本1为S6，亲本2为S22，a、b和c表示在0.05水平上差异显著。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了稳定表达的水稻芽期耐冷QTL紧密连锁的分子标记及其应用。

实施例1

芽期耐冷QTL的定位

水稻的芽期耐冷性很重要。准确定位控制芽期耐冷性的QTL可以提高水稻育种的选择效率。为了找到控制水稻芽期耐冷性的相关基因。对单片段代换系文库(参见Zhang G,Zeng R,Zhang Z,Ding X,Li W,Liu G,He F,Talukdar A,Huang C,Xi Z,Qin L,Shi J,Zhao F,Feng M,Shan Z,Chen L,Guo X,Zhu H,Lu Y(2004)The construction of alibrary of single segment substitution lines in rice(Oryza sativa L.).RiceGenetics Newsletter 21:85-87)的亲本进行了芽期耐冷性的鉴定。鉴定发现水稻品种“南洋占”和“IR65598-112-2”的芽期耐冷性明显比“华粳籼74”好。

其中，芽期耐冷鉴定的试验步骤：

(1)每个品系挑选400粒饱满的种子置恒温箱内，49℃处理96h打破休眠。

(2)用3％次氯酸钠消毒20min，蒸馏水洗干净，然后清水浸泡36h后，于32℃恒温箱催芽2-3d。

(3)挑选芽长5.0mm左右的种子，转置于3个垫湿润滤纸的直径9.0cm的培养皿里，每个培养皿80粒，在CONVIRON－PGV36型人工气候箱中5.0℃处理10d，12小时光照，湿度80％。然后调整温度到28℃，使水稻幼芽恢复正常生长。

(4)10d后调查存活率(存活率＝存活株数/处理株数×100％)，以此作为评价水稻芽期耐冷性的指标。

结果发现，冷处理再恢复常温10天后，南洋占的存活率为84.88±3.51％，IR65598-112-2的存活率为88.79±4.82％，华粳籼74的存活率为8.23±1.49％。

实施例2

选取以“南洋占”和“IR65598-112-2”为供体，“华粳籼74”为受体的单片段代换系群来进行芽期耐冷性的评价。本发明用到的单片段代换是指基因组的其他部分都与“华粳籼74”相同，只有导入供体染色体的区段与“华粳籼74”不同。

通过耐冷性的鉴定实验(参见图1)，可以确定来源于“南洋占”的单片段代换系(编号S6)带有芽期耐冷QTL，耐冷效应来源于“南洋占”第6染色体短臂区间；来源于“IR65598-112-2”的单片段代换系(编号S22)也带有芽期耐冷QTL，耐冷效应来源于“IR65598-112-2”第3染色体长臂端区间。

其中，单片段代换系的构建：

采用回交和分子标记辅助选择相结合的方法，杂交和每次回交都以华粳籼74为母本。SSSL的构建程序参见图2。从BC2F1代起用分子标记进行全基因组的代换片段检测，直至筛选到纯合的SSSL(原理参见：曾瑞珍等,籼稻背景的单片段代换系群体的构建,2006,32(1):88～95,作物学报)。

实施例3

对“南洋占”的单片段代换系、“IR65598-112-2”的单片段代换系分别和受体“华粳籼74”进行了基因组的重测序比较(参见图3)，确证芽期耐冷QTL qCTBB 3位于“IR65598-112-2”第3染色体的31.6～34.7Mb区间，qCTBB 6位于“南洋占”第6染色体的0.05～0.75Mb区间。

由于第3染色体的芽期耐冷QTL qCTBB 3效应稳定，为了进一步限定耐冷QTL的区间范围，通过代换片段比较分析，在qCTBB 3区间存在2个耐冷QTL(参见图4)。其中，qCTBB3a位于31.7～32.9Mb区间；qCTBB 3b位于32.9～34.6Mb区间。

实施例4

分子标记的开发及应用

参照“南洋占”的单片段代换系、“IR65598-112-2”的单片段代换系(S6和S22)分别和受体“华粳籼74”基因组的重测序信息，发现在QTL区间内存在一些插入缺失的序列差异，分别选取“IR65598-112-2”第3染色体的31.7Mb(3ID1)、32.2Mb(3ID2)、33.2Mb(3ID3)、34.6Mb(3ID4)处的序列差异；“南洋占”第6染色体的0.383Mb(6ID1)、0.516Mb(6ID1)、0.668Mb(6ID3)处的序列差异，设计了7对引物来进行目标QTL的筛选。

PCR的扩增体系包括：

10×PCR buffer(含25mmol/L Mg

扩增系统的扩增程序为：94℃下预变性5min后；94℃下变性30s；55℃下退火30s；72℃下延伸45s，35个循环；最后72℃下延伸8min。

分子标记的序列信息如下：

3ID1：

上游引物序列为5’-ATTCTATGCCGCCAACCAA-3’，如SEQ ID NO:2所示；

下游引物序列为5’-GAATTGTCAACTTCAGCATCCC-3’，如SEQ ID NO:3所示；

扩增特征：耐冷基因型182bp，敏感基因型195bp；

耐冷基因型的具体序列：

ATTCTATGCCGCCAACCAAGCAAACCCTTAATATTCTAGCCATCTAATATCAGATATAATATATCATAAGTACATATAGTATAGGTGTTTTAAATTTTCGGAGAGAGGGAGTAAGTGCTACCATGACCACCACGTCAATTCCTATAGCTAAAAGCAACGGGGGATGCTGAAGTTGACAATTC，如SEQ ID NO:1所示；

3ID2：

上游引物序列为5’-TACAGCCTCCTAATAGCATTGACC-3’，如SEQ ID NO:5所示；

下游引物序列为5’-TCGAAGCTGCCGGTGTTG-3’，如SEQ ID NO:6所示；

扩增特征：耐冷基因型202bp，敏感基因型222bp；

耐冷基因型的具体序列：

TACAGCCTCCTAATAGCATTGACCTCTAACTTGTGCACTTCTGACTGAAAAAAATGCAGGAGGTCTGGACCATCTGCAGAATCTTCAAGAGAAGCATCACCTACAGGAAGCAGCAGCAGCAGCAGGCCTGGAGGCCGCCGGCGACGGTGACCGTCAAGGCCCCACCGCCGGGGGACTCGAGCTCCAACACCGGCAGCTTCGA，如SEQ ID NO:4所示；

3ID3：

上游引物序列为5’-AGAACACCCGCTCCATCG-3’，如SEQ ID NO:8所示；

下游引物序列为5’-AGCAGCACGCAGCCGCCTT-3’，如SEQ ID NO:9所示；

扩增特征：耐冷基因型170bp，敏感基因型182bp；

耐冷基因型的具体序列：

AGAACACCCGCTCCATCGCGGAATCGGAATCCGCTCTCGCCGACGCGGATCGCGGGGCTACCCTCCGATGGATTCGCGAGGGGGGGATTCGAGGGTTTGATCGGAGAAAACCTCGCGCGAATTGCCGCTTGGAGAAGAGGAGAGGATTGGGAAGGCGGCTGCGTGCTGCT，如SEQ ID NO:7所示；

3ID4：

上游引物序列为5’-GACGAGGAGGAGGAAGAGGA-3’，如SEQ ID NO:11所示；

下游引物序列为5’-AGCAATCGGAGCAGCAAGAG-3’，如SEQ ID NO:12所示；

扩增特征：耐冷基因型290bp，敏感基因型306bp；

耐冷基因型的具体序列：

GACGAGGAGGAGGAAGAGGAGGGGTTTAGGATTCCACTCCCTTCGCGTAGTAGATTTTGGGGAGAGATTTTTCGTCGCGGGAGTGGATAGAGTCGGACTCCGAGAGGCGCGGGTGCGACGCGAGCGAGTCGGACTCGAGTTGGCTAAGCCTGACCAGCTTGGCCCTTCCACTTCTCTCTCTATCTCTCTCTCTTCTCTTTTTCCCCAATAGGCAACTGCACGCGCCGCCGCAGCCTCTCTCTCTCTCTCCGCCGCTCCGGCTTTCTCCTCCTCTTGCTGCTCCGATTGCT，如SEQID NO:10所示；

6ID1：

上游引物序列为5’-ATGAGTGGAAGGCAAATACTTA-3’，如SEQ ID NO:14所示；

下游引物序列为5’-CATTCGAACAAAACTCCCTAG-3’，如SEQ ID NO:15所示；

扩增特征：耐冷基因型241bp，敏感基因型228bp；

耐冷基因型的具体序列：

ATGAGTGGAAGGCAAATACTTATGTAGTTTTCTGCCCATGGATAAAAATCATGTTTCTTTTTGCACAAGGTCAGTGCAAATGAAAATTTGAACCAACGATTAATATTCATGAAATTTCAGGCCAAAGATTAATGCTAAGATGTTTTTGGGCCAAAGGGTAAAATTCAACACTTTTGGGGCCCAAGGTTATTACTCATGAAATTTTGGCCCAAAGGCTATACTAGGGAGTTTTGTTCGAATG，如SEQ ID NO:13所示；

6ID2：

上游引物序列为5’-CCCATCCGTCCACCACATA-3’，如SEQ ID NO:17所示；

下游引物序列为5’-GCCGTATCAAATGAGTCAATAGC-3’，如SEQ ID NO:18所示；

扩增特征：耐冷基因型202bp，敏感基因型185bp；

耐冷基因型的具体序列：

CCCATCCGTCCACCACATATGTATACATGTACGCATCAACATTTTCCTATATATATCGCGCGCCGTCGTCTTCAAACTAAAATTAACAAAATATTTGAAATTTCTATGGGTACCTAAACACTTTCTCATCCTAAAGCACTAAACTTTTGAACCCTTCGTTAAACTTTAAGTCCATGCATGCTATTGACTCATTTGATACGGC，如SEQ ID NO:16所示；

6ID3：

上游引物序列为5’-AACACGGCAGCTACCAAGA-3’，如SEQ ID NO:20所示

下游引物序列为5’-GTACGTTTACGTGTCATCTCGA-3’，如SEQ ID N O:21所示；

扩增特征：耐冷基因型171bp，敏感基因型159bp.

耐冷基因型的具体序列：

AACACGGCAGCTACCAAGAATTTGCCATTTTATTTGCCATTTTATTTATGATCAATTGATCTCAACAAGGCCAAGTTATAGGAGCATATATACTCCATGTTTAATTAACCAGCCAGCTGATTGCATGCAGCCTATCACAATTCAGAGGATCGAGATGACACGTAAACGTAC，如SEQ ID NO:19所示；

配置PCR反应体系，在PCR扩增结束后，在电压为105V的情况下，用垂直电泳系统进行8.0％的PAGE胶电泳，电泳时间1h 30min～2h 10min；电泳结束后，将PAGE胶放入纯水溶解的10

若出现目标大小的条带，则为携带目标QTL的单株。

实施例5

芽期耐冷QTL的应用

以带有qCTBB 3a、qCTBB 3b和带有qCTBB 6的单片段代换系进行杂交，利用与这3个耐冷QTL紧密连锁的7个分子标记在后代中跟踪筛选(部分结果参见图5)，获得了携带3个耐冷QTL的聚合系。

对聚合系和单片段代换系亲本以及对照“华粳籼74”进行芽期耐冷性评价，结果发现携带3个耐冷QTL的聚合系芽期耐冷性得到了显著的提升(参见图6)。

其中，获得聚合系的具体程序：

将亲本和杂交后代种植于实验农场，每个材料80株，单株种植，顺序排列，常规管理。利用目标片段上的标记进行单株检测，选用华粳籼74、S22为母本、S6为父本作为对照，与华粳籼一致的带型记为1，与目标基因型一致的带型记为3，杂合带型记为2。F1代进行真假杂种检测，从F2代起根据带型结果选择目标带型出现次数多的单株，在F3代，对纯合系进行分子标记验证，并从杂合株系中继续筛选纯合聚合系。根据标记结果对F4纯合株系进一步确证。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 广东省农业科学院水稻研究所

<120> 稳定表达的水稻芽期耐冷QTL紧密连锁的分子标记及其应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attctatgcc gccaaccaag caaaccctta atattctagc catctaatat cagatataat 60

atatcataag tacatatagt ataggtgttt taaattttcg gagagaggga gtaagtgcta 120

ccatgaccac cacgtcaatt cctatagcta aaagcaacgg gggatgctga agttgacaat 180

tc 182

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attctatgcc gccaaccaa 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaattgtcaa cttcagcatc cc 22

<210> 4

<211> 202

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tacagcctcc taatagcatt gacctctaac ttgtgcactt ctgactgaaa aaaatgcagg 60

aggtctggac catctgcaga atcttcaaga gaagcatcac ctacaggaag cagcagcagc 120

agcaggcctg gaggccgccg gcgacggtga ccgtcaaggc cccaccgccg ggggactcga 180

gctccaacac cggcagcttc ga 202

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tacagcctcc taatagcatt gacc 24

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgaagctgc cggtgttg 18

<210> 7

<211> 170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agaacacccg ctccatcgcg gaatcggaat ccgctctcgc cgacgcggat cgcggggcta 60

ccctccgatg gattcgcgag ggggggattc gagggtttga tcggagaaaa cctcgcgcga 120

attgccgctt ggagaagagg agaggattgg gaaggcggct gcgtgctgct 170

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agaacacccg ctccatcg 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agcagcacgc agccgcctt 19

<210> 10

<211> 290

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacgaggagg aggaagagga ggggtttagg attccactcc cttcgcgtag tagattttgg 60

ggagagattt ttcgtcgcgg gagtggatag agtcggactc cgagaggcgc gggtgcgacg 120

cgagcgagtc ggactcgagt tggctaagcc tgaccagctt ggcccttcca cttctctctc 180

tatctctctc tcttctcttt ttccccaata ggcaactgca cgcgccgccg cagcctctct 240

ctctctctcc gccgctccgg ctttctcctc ctcttgctgc tccgattgct 290

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gacgaggagg aggaagagga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agcaatcgga gcagcaagag 20

<210> 13

<211> 241

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgagtggaa ggcaaatact tatgtagttt tctgcccatg gataaaaatc atgtttcttt 60

ttgcacaagg tcagtgcaaa tgaaaatttg aaccaacgat taatattcat gaaatttcag 120

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<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgagtggaa ggcaaatact ta 22

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cattcgaaca aaactcccta g 21

<210> 16

<211> 202

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

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<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

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<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

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<210> 19

<211> 171

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aacacggcag ctaccaagaa tttgccattt tatttgccat tttatttatg atcaattgat 60

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<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

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<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtacgtttac gtgtcatctc ga 22