用于预防BPD的包含肺表面活性物质和类固醇的治疗组合

摘要

以低剂量施用肺表面活性物质和皮质类固醇可有效地用于预防早产新生儿的支气管肺发育异常(BPD)。

说明书

技术领域

本发明涉及用于预防早产(prematurity)疾病的组合物。本发明还涉及用于预防早产疾病的方法。

背景技术

人肺由大量小气囊组成，所述小气囊称为肺泡，其中气体在血液和肺的空气空间之间交换。在健康个体中，这种交换是由含蛋白质的表面活性物质(surfactant)复合物的存在介导的，该复合物防止肺在呼气结束时塌陷。

肺表面活性物质复合物主要由脂质组成，并含有少量的各种蛋白质。缺乏足够水平的这种复合物会导致肺功能障碍。该综合征称为呼吸窘迫综合征(RDS)，且通常影响早产新生儿(preterm neonate)。

RDS治疗的主要支持是采用从动物肺中提取的外源性肺表面活性物质制备物(preparations)(称为经修饰的天然表面活性物质)的替代疗法。例如，在临床实践中使用的经修饰的天然表面活性物质是源自猪肺的猪肺磷脂(poractant alfa)，并且以下述商标出售：固尔苏

目前，外源性肺表面活性物质通过气管内滴注作为盐水溶液中的悬浮液被施用至保持在用氧气的机械通气下插管的早产儿。

尽管所述治疗使产后存活率大大提高，但是从RDS存活的儿童发展支气管肺发育异常(bronchopulmonary dysplasia)(BPD)的风险很高，这是一种常见且严重的早产并发症，与显著的死亡率、发病率和医疗资源利用率相关。尽管产前和新生儿护理方面取得了进展，但病症的发病率仍在上升。BPD及其相关问题的管理仍然是新生儿学专家和儿科医生面临的主要挑战。已经提出多种干预(interventions)来预防和治疗BPD，但许多仍然没有基于证据。目前的治疗方法似乎降低了BPD的严重程度，但对其发病率几乎没有影响。BPD是不断发展的肺损伤过程，且其病理生理学在疾病的不同阶段有所不同。因此，它的管理不太可能是单一干预的形式，而是采用用于针对疾病的不同因素和/或阶段的不同策略的组合方法。

为此，在设计总体管理计划时，在三个后续阶段对BPD干预进行分类是有用的。这些是：i)预防BDP；ii)治疗进展性BPD；iii)已确诊的BPD的治疗(参见Bowen P等，Pediatrics and Child Health 2013,24:1,27-31)。

受RDS影响的新生儿的BPD预防通过产前或产后几小时全身施用皮质类固醇来控制。但是，产后皮质类固醇施用的有效性被可能的不良全身效应，例如高血压、高血糖、胃肠道并发症和神经发育残疾(neurodevelopmental disability)所抵消。

作为全身施用的替代方案，已提出通过吸入或气管内滴注递送皮质类固醇用于预防BDP。

例如，US 2010/0317636公开了通过向婴儿施用具有高局部至全身抗炎活性的皮质类固醇和肺表面活性物质的组合来预防患有呼吸窘迫综合征的婴儿中的BPD的方法。

Yeh等(Pediatrics 2008,121(5),e1310-e1318)提出气管内滴注布地奈德肺(使用表面活性物质

但是，通过这些方法，大量群体的早产新生儿将暴露于皮质类固醇，许多没有益处，若非如此他们不会发展BPD(参见Bancalari E.Am J Respir Crit Care Med 2016,193:1,12)。

产后的皮质类固醇可以在预防BPD中发现其在治疗中的位置，因为以这种方式它们将被施用给有此需要的患者。

但是，由于观察到的副作用或缺乏明确的疗效标志，目前不建议常规地进行地塞米松和氢化可的松的全身产后施用。

鉴于上述考虑，仍然需要开发更顺应的基于皮质类固醇的药物，用于预防早产新生儿中的BPD，从而减轻不利副作用的风险。

此外，提供可通过吸入或气管内滴注局部施用的药物将是有利的。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供用于预防早产疾病的新组合物。

本发明的另一个目的是提供用于预防早产疾病的新方法。

通过发明人的发现，即肺表面活性物质与布地奈德的组合施用可用于预防早产新生儿的支气管肺发育异常(BPD)，已经实现了在以下详细描述中将变得显而易见的这些和其它目的。

因此，本发明提供了肺表面活性物质与类固醇的组合，其用于预防早产新生儿的支气管肺发育异常。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及与约0.01至约0.1mg/kg体重的剂量的布地奈德组合的肺表面活性物质，其用于预防早产新生儿的支气管肺发育异常(BPD)。

有利地，从出生(在生命的第一天内)至生命的第四天施用所述组合。

本发明还涉及与约0.01至约0.1mg/kg体重的剂量的布地奈德组合的肺表面活性物质，其用于治疗早产新生儿的早产严重慢性肺功能不全。

本发明也涉及与约0.01至约0.1mg/kg体重的剂量的布地奈德组合的肺表面活性物质在药物制备中的用途，所述药物用于预防早产新生儿的支气管肺发育异常(BPD)。

有利地，从出生(在生命的第一天内)至生命的第四天施用所述组合。

本发明还涉及与约0.01至约0.1mg/kg体重的剂量的布地奈德组合的肺表面活性物质在药物制备中的用途，所述药物用于治疗早产新生儿的早产严重慢性肺功能不全。

本发明的药物可以同时、依次或分开施用，优选作为固定组合同时施用。

在一个具体实施方案中，所述药物是包含所述固定组合的用于吸入或气管内施用的药物组合物的形式。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于预防支气管肺发育异常或用于治疗早产严重慢性肺功能不全的方法，所述方法包括给需要这种预防的早产新生儿施用与约0.01至约0.1mg/kg体重的剂量的布地奈德组合的肺表面活性物质，其中从出生(在生命的第一天内)至生命的第四天施用所述组合。

在另一个实施方案中，本发明涉及改善早产新生儿的肺功能的方法，其包括施用本发明的组合物。

在另一个实施方案中，本发明涉及减轻经机械通气治疗的早产新生儿的肺部炎症的方法，该方法包括向所述早产新生儿施用本发明的组合物，其中所述施用发生在所述机械通气过程中、之前或之后。

附图说明

通过下面的详细描述和附图，本发明提供的优点将变得显而易见，其中：

图1显示了实施例5的结果。

图2显示了实施例6的平均气道压(MAP)和在40cmH

图3显示了实施例6的肺mRNA损伤评价的结果。

图4显示了实施例6的肝mRNA对机械通气的应答的结果。

发明详述

术语“支气管肺发育异常(BPD)”是指慢性肺障碍，也称为慢性肺病(CLD)，其是未解决或异常修复的肺损伤的结果。BDP也可以称作早产严重慢性肺功能不全。

BPD通常发生在持续肺损伤的超低出生体重(VLBW)的婴儿中，所述肺损伤是由于氧气毒性，并且在生命早期通过机械通气引起气压性损伤。自Northway等人在1961年最初描述BPD以来，BPD的定义和分类已经发生了变化。国家儿童健康与人类发展研究所(NICHD)在2001年的共识声明中定义了BPD。该定义使用补充氧需求达28天，然后确定3级严重程度，这取决于在36周矫正胎龄(postmenstrual age)(PMA)或在那些在妊娠<32周出生的人出院时或在妊娠>32周出生的那些人的生命第56天或出院时所需的呼吸支持。

在2001年，Jobe A等人(Am J Respir Crit Care Med；163(7)1723-1729)提出了新的定义，包括“轻度”、“中度”和“严重”BPD的具体标准。

轻度BDP定义为需要以下的疾病：补充氧气≥28天，以及在36周PMA或出院时(对于出生时<32周的婴儿)或在56天或出院时(对于出生时≥32周的婴儿)在室内空气中。

中度BDP定义为需要以下的疾病：补充氧气≥28天，并且需要在36周PMA/出院时(对于<32周)或在56天/出院时(对于≥32周的婴儿)需要补充氧气<30％。

严重的BPD定义为需要以下的疾病：补充氧气≥28天且在36周PMA/出院时(<32周)或在56天/出院时(≥32周)需要≥30％的氧气或需要鼻CPAP或机械通气。

术语“进展性BPD”，有时称为早期BPD，是指导致确定的BDP的慢性过程的初始阶段，并且表明以生命的第7天至第14天的氧气和/或呼吸机依赖性为特征的疾病(Walsh MC等人Pediatrics 2006,117，S52-S5)。最近，进展性BPD也已经被称作早产慢性肺功能不全(参见Steinhorn R等人J Peds 2017,8,15-21.)。

术语“经修饰的天然表面活性物质”是指切碎的哺乳动物肺的脂质提取物。由于在制造过程中使用的脂质提取过程，亲水性蛋白质SP-A和SP-D丢失。这些制备物具有可变量的两种疏水性表面活性物质相关蛋白SP-B和SP-C，并且取决于提取方法，可含有非表面活性物质脂质、蛋白质或其它组分。

术语“猪肺磷脂”是指从猪肺中提取的经修饰的天然表面活性物质，其基本上由极性脂质，主要是磷脂和蛋白质SP-B和SP-C组成。猪肺磷脂以商标固

术语“人工肺表面活性物质(artificial pulmonary surfactant)”是指合成化合物，主要是磷脂和其它脂质的混合物，所述合成化合物被配制以模拟天然肺表面活性物质的脂质组成和行为。它们没有肺表面活性蛋白。

术语“重构的肺表面活性物质”是指人工肺表面活性物质，其中已加入从动物分离的肺表面活性蛋白/肽或通过重组技术例如WO 95/32992中描述的那些制备的蛋白质/肽或肺表面活性蛋白类似物，例如如WO89/06657、WO 92/22315和WO 00/47623中所述的那些。

术语“非侵入性通气(NIV)操作(non-invasive ventilation procedure)”定义了一种通气模式，其支持呼吸而无需插管，例如鼻持续气道正压通气(鼻CPAP)。其它非侵入性通气操作是经鼻间歇正压通气(NIPPV)、高流量鼻套管(High Flow Nasal Cannula)(HFNC)和双水平气道正压通气(BiPAP)。

术语“呼吸支持”包括治疗呼吸系统疾病的任何干预，包括例如补充氧气、机械通气和鼻CPAP的施用。

术语“治疗”是指用于治愈患者的疾病或病症、患者的疾病或病症的症状缓解、患者的疾病或病症的症状减轻，所述疾病或病症例如BPD。

术语“预防”是指减慢患者的疾病或病症(例如，BPD)的进展，延迟其发作，和/或降低其感染(contracting)风险。

术语“早产新生儿”或早产儿包括胎龄24-35周的极低出生体重(ELBW)、超低出生体重(VLBW)和低出生体重(LBW)新生儿。

术语“固定组合”是指其中活性物质处于固定定量比的组合。

“药学上可接受的”是本文使用的术语，是指当施用婴儿时不产生过敏或类似的不良反应的介质。

将表面活性物质制备物的“表面活性物质活性”定义为降低表面张力的能力。

外源性表面活性物质制备物的体外功效通常通过使用合适的装置如威廉天平(Wilhelmy Balance)、搏动气泡表面活性测量仪(Pulsating Bubble Surfactometer)、气泡俘获表面活性测量仪(Captive Bubble Surfactometer)和毛细管表面活性测量计(Capillary Surfactometer)测量它们降低表面张力的能力来测试。

通过根据已知方法测量早产动物模型中的肺力学来测试外源性表面活性物质制备物的体内功效。

在本说明书的上下文中，术语“协同”是指肺表面活性物质加布地奈德的活性高于单独的表面活性物质或布地奈德的活性。

术语“猪肺磷脂的生物类似产品(biosimilar)”是指一种经修饰的天然肺表面活性物质，其具有相同的安全性谱，其在治疗上相当，其具有至少80％的定性-定量组成(特别是关于磷脂和表面活性蛋白SP-B和SP-C)的相似性，当将它悬浮在80/mg/ml浓度的水溶液中时，它在室温具有等于或小于15mPas(cP)的粘度。粘度可根据已知方法测定。

本发明部分地基于意外的发现，即约0.01mg/kg至约0.1mg/kg体重的剂量的布地奈德可与肺表面活性物质如猪肺磷脂组合以预防支气管肺发育异常(BPD)，而不改变表面活性物质的表面活性。

根据以下发现，将肺表面活性物质与要求保护剂量的布地奈德组合的优点将是显而易见的。

在暴露于高氧以模仿BPD的早产兔模型中的一项研究中已经确实出乎意料地发现，与例如Yeh等人,2008的剂量相比，与较低剂量的布地奈德组合的肺表面活性物质(诸如猪肺磷脂)产生了基本上相当的肺顺应性。由于布地奈德是一种高度亲脂性的皮质类固醇，这可能有利于其粘膜吸收和跨磷脂细胞膜的摄取，而全身吸收可忽略不计，使得该组合对于早产新生儿的治疗用途是安全的。

此外，在一项新生羔羊模型的研究中，与接受表面活性物质并组合布地奈德剂量(Yeh等人,2008所用)的动物相比，用与0.04和0.1mg/kg布地奈德组合的猪肺磷脂治疗的动物表现出在40cm H

由于布地奈德的ADME特性的潜在年龄差异，不可能预测较低的剂量仍然是有效的。

在40cm H

另一方面，肺表面活性物质可能有利于马兰戈尼效应(Marangoni effect)导致的皮质类固醇扩散，有利于其分布，因此有利于到达所有感兴趣的肺区域。

目前使用的任何肺表面活性物质，或随后开发用于呼吸窘迫系统和其它肺病的任何肺表面活性物质都适用于本发明。这些包括经修饰的天然，人工和重构的肺表面活性物质。

目前经修饰的天然肺表面活性物质包括、但不限于牛脂质肺表面活性物质(BLES

重构表面活性物质的例子包括在EP 2 152 288,WO 2008/011559,WO 2013/120058中公开的组合物，产品lucinactant(Surfaxin

1.5％的SP-C33(leu)乙酸盐(acetate)；

0.2％的Mini-B(leu)乙酸盐；和

50:50重量比的DPPC:POPG。

所述重构的表面活性物质在下文中称作CGF 5633。

选择用于本发明药物的肺表面活性物质可与用于RDS的肺表面活性物质相同或不同。在一个优选的实施方案中，使用相同的肺表面活性物质。

在一个优选的实施方案中，肺表面活性物质是经修饰的天然肺表面活性物质。

更优选地，肺表面活性物质是猪肺磷脂(固尔苏

在另一个实施方案中，肺表面活性物质是重构的表面活性物质，其具有WO2010/139442的实施例2的表2中公开的组合物。

待施用的肺表面活性物质的剂量将随早产新生儿的体重和胎龄以及新生儿病症的严重程度而变化。相关领域的技术人员将能够容易地确定这些因素并相应地调整剂量。

有利地，肺表面活性物质的剂量可以是约100至约200mg/kg体重。

在本发明的一个优选实施方案中，可以使用剂量为约100至约200mg/kg体重的猪肺磷脂。

在一个优选的实施方案中，剂量可以是约100mg/kg体重，而在另一个优选的实施方案中，剂量可以是约200mg/kg体重。

有利地，布地奈德的剂量为约0.01至约0.1mg/kg体重。布地奈德剂量的下限可以是约0.02mg/kg体重、约0.03mg/kg体重、约0.04mg/kg体重或约0.05mg/kg体重。布地奈德剂量的上限可以是约0.09mg/kg体重、约0.08mg/kg体重或约0.07mg/kg体重。

为了预防BPD，应在以下时间之间的任何时间向早产新生儿施用肺表面活性物质和布地奈德：(a)距出生或生命开始的最接近的可行时间，至(b)生命第四天的任何时间。在上述时间区间内，可以继续施用由医生或其它医学从业人员认为合适的时间段以达到所需的效果。

在另一个实施方案中，在生命的前三天中的任何时间将肺表面活性物质和布地奈德施用给早产新生儿。在另一个实施方案中，在生命的前两天中的任何时间将肺表面活性物质和布地奈德施用给早产新生儿。在另一个实施方案中，在生命的第一天中的任何时间将肺表面活性物质和布地奈德施用给早产新生儿。在另一个实施方案中，在生命的前8小时内的任何时间将肺表面活性物质和布地奈德施用给早产新生儿。在另一个实施方案中，在生命的前四个小时内的任何时间将肺表面活性物质和布地奈德施用给早产新生儿。

施用频率将随早产新生儿的大小和胎龄以及新生儿病症的严重程度和施用途径而变化。相关领域的技术人员将能够容易地确定它。例如，本发明的药物可以施用一次或两次。

施用频率将随早产新生儿的大小和胎龄以及新生儿病症的严重程度和施用途径而变化。例如，本发明的药物可以施用一次或两次。

为了预防BPD，将肺表面活性物质和布地奈德施用给胎龄为26至35周，优选胎龄为28至32周的早产新生儿。

优选的是，将本发明的组合施用早产新生儿，所述早产新生儿保持在非侵入性通气操作下，更优选保持在鼻CPAP下，甚至更优选用鼻装置，在1至12cm水的压力下。

要求保护的剂量的肺表面活性物质和布地奈德的组合的活性物质可以依次，分开或一起施用。有利地，当两种活性物质一起施用时，它们作为固定组合施用。

因此，本发明也提供了本发明组合作为固定组合在制备用于预防BPD的药物中的用途。药物可以是药物组合物的形式。

所述制剂可以以溶液、分散体、悬浮液或干粉的形式施用。优选的是，所述组合物包含悬浮在合适的生理学上可耐受的溶剂中的要求保护的组合。

更优选的是，制剂包含水溶液，优选无菌的，其还可以包含pH缓冲剂和其它药学上可接受的赋形剂，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或脱水山梨糖醇单月桂酸酯作为润湿剂和氯化钠作为等渗剂。

制剂可以分布在单元剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，或者可以在冷冻或冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用前立即加入无菌液体载体。

优选的是，将制剂提供为一次性小瓶中在缓冲生理盐水(0.9％w/v氯化钠)水溶液中的无菌悬浮液。

要求保护的制剂的施用可以根据已知方法进行，例如，通过气管内滴注、喷雾施用或喷射超声波雾化或市场上通常可以获得的网状振动雾化器(mesh-vibratingnebuliser)。

当通过气管内滴注施用制剂时，取决于呼吸窘迫综合征的严重程度，可以采用不同的方法。例如，要求保护的制剂可以通过气管内管施用保持在机械通气下的早产新生儿。

或者，可以通过使用置于气管中的细导管施用制剂，并且根据称为鼻持续气道正压通气(nCPAP)的方法，根据在WO2008/148469中描述的方法，通过特殊设计的鼻装置(例如面罩、尖头或管)支持新生儿呼吸。

后一种方法只能使用外源性表面活性物质，例如具有低粘度的猪肺磷脂，因为高粘度会使表面活性物质通过细导管更加困难。

悬浮两种组合活性物质的水溶液的体积取决于所需的浓度。

有利地，制剂的体积应不超过约5.0ml，优选约4.5至约2.0ml，更优选约3.5至约2.5ml。

在其它实施方案中，当肺表面活性物质和布地奈德分开施用时，可以单独配制各个活性物质。在这种情况下，两种单独的活性物质不必无条件地同时服用。

在分开施用的情况下，两种单独活性物质的制剂可以在合适的容器中同时包装以提供试剂盒。

因此，本发明还涉及用于预防支气管肺发育异常的试剂盒，所述试剂盒包括：a)在第一单元剂型中的剂量为约100至约200mg/kg的肺表面活性物质和药学上可接受的载体或稀释剂；b)在第二单元剂型中的剂量为约0.01至约0.1mg/kg体重的布地奈德和药学上可接受的载体或稀释剂；和c)容纳所述第一和第二剂型的容器装置。

借助于本发明的组合，可以预防可能影响早产新生儿的任何形式的轻度、中度、严重BDP。

需要本发明药物的早产新生儿可能或可能不表现出呼吸窘迫综合征(RDS)。在一个实施方案中，在用肺表面活性物质或通过其它方式(例如通气)或其组合治疗这种综合征后，在表现出RDS的新生儿中开始施用本发明的药物。

在某些实施方案中，用本发明的药物治疗的新生儿需要呼吸支持但不一定表现出呼吸窘迫综合征。这些婴儿要么没有被诊断为患有RDS，要么没有用肺表面活性物质治疗RDS。

所有早产新生儿都适于接受本发明药物的施用，包括24-35周胎龄的极低出生体重(ELBW)、超低出生体重(VLBW)和低出生体重(LBW)新生儿。优选的是，将药物施用具有严重RDS的VLBW新生儿，其具有较高的BPD发病率。

一般而言，由于BPD的管理不太可能是单一干预的形式，而是组合方法，医生应评估早产新生儿是否也需要伴随的呼吸支持和/或其它合适的药物，如维生素A和抗生素。

考虑到上面讨论的肺表面活性物质和布地奈德的剂量以及要施用的制剂的体积，以及接受施用的早产新生儿的典型体重，该溶液或悬浮液制剂通常含有浓度为约0.005至约0.05mg/ml、优选约0.01至约0.05mg/ml的布地奈德和浓度为约20至约100mg/ml、优选约40至约80mg/ml的肺表面活性物质。

在以下为了举例说明本发明而给出的示例性实施方案的描述过程中，本发明的其它特征将变得显而易见。

实施例

实施例1.通过毛细管表面活性测量仪在布地奈德存在下对猪肺磷脂表面活性的体外评价

通过可从Calmia Medical，Inc.，USA商购获得的毛细管表面活性测量仪，与单独的猪肺磷脂比较，评价了猪肺磷脂(在布地奈德存在下，2ml，1.0mg)的表面活性。

制备两个样品：一个来自一小瓶的猪肺磷脂(1.5ml，80mg/ml)，将其用盐水稀释至浓度为1mg/ml的磷脂，另一个来自一小瓶的猪肺磷脂(1.5ml，80mg/ml)，将其与一小瓶布地奈德(2ml，1.0mg)混合并用盐水稀释至相同浓度(1mg/ml磷脂)。然后在毛细管表面活性测量仪中评估0.5ml两种溶液的样品。

毛细管表面活性测量仪的原理是模拟终端人体气道(terminal human airway)。将样品引入玻璃毛细管的狭窄部分，其中内径为0.25mm，类似于终端人气道的内径。在一端，毛细管连接到风箱和压力传感器。当缓慢压缩风箱时，压力升高并被记录下来。压力增加导致样品从毛细管的狭窄部分挤出。当空气通过时，压力突然降低。如果样品含有功能良好的肺表面活性物质，样品液体将不会返回狭窄部分。通过风箱的连续压缩获得的稳定气流不会遇到阻力，并且记录的压力为零。另一方面，如果样品中不含有功能良好的肺表面活性物质，样品液将反复返回。

在布地奈德存在下的猪肺磷脂的行为证实在统计学上与单独的猪肺磷脂无差异，表明布地奈德不影响表面活性物质的表面活性。

实施例2.根据本发明的水性悬浮液形式的制剂

实施例3.根据本发明的水性悬浮液形式的制剂

实施例4.根据本发明的水性悬浮液形式的制剂

实施例5.在兔模型中的体内效果

在该实验中采用暴露于高氧的支气管肺发育异常(BPD)早产兔模型。该模型已在其它地方进行了详细描述(参见Richter J,等人(2014)Functional assessment ofhyperoxia-induced lung injury after preterm birth in the rabbit.Am J PhysiolLung Cell Mol Physiol 306:L277–283；Jimenez J,等人(2016)Progressive vascularfunctional and structural damage in a bronchopulmonary dysplasia model inpreterm rabbits exposed to hyperoxia.Int J Mol Sci 17:E1776；和Salaets T,等人,(2015).Transcriptome analysis of the preterm rabbit lung after seven days ofhyperoxic exposure.PLoS One 10:e0136569)。简而言之，早产兔在妊娠的28天(囊肺发育早期)(足月＝31天)通过剖宫产术分娩。分娩后立即将幼崽置于恒温箱(32℃)中并随机分为三组，每组5-6只动物(见下文)。将早产兔保持在高氧(95％的氧气)中四天，每天通过口胃管喂两次配方奶，并接受预防性的抗生素和维生素K。在第3天，每只动物接受一次以下物质的气管内注射：仅表面活性物质100mg/kg体重(组1)，或表面活性物质100mg/kg+布地奈德0.05mg/kg体重(组2)，或表面活性物质100mg/kg+布地奈德0.25mg/kg体重(组3)。Yeh等人(2008年)报告称最佳剂量为0.25mg/kg。

24小时后，在出生后第4天，将早产兔深度麻醉，将插管放在每只动物的气管中，并使用如前面描述的Flexivent系统(FlexiVent 5.2；SCIREQ)进行侵入性肺功能测试((参见Richter J,等人(2014)Functional assessment of hyperoxia-induced lung injuryafter preterm birth in the rabbit.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 306:L277–283；Jimenez J,等人.(2016)Progressive vascular functional and structuraldamage in a bronchopulmonary dysplasia model in preterm rabbits exposed tohyperoxia.Int J Mol Sci 17:E1776；和Salaets T.等人，(2015).Transcriptomeanalysis of the preterm rabbit lung after seven days of hyperoxicexposure.PLoS One 10:e0136569)。使用压力体积扰动(pressure volume perturbation)(PVr-V)测量静态顺应性(给定肺体积下肺的弹性回缩压(elastic recoil pressure))。每只幼崽获得三个测量值(决定系数>0.95)。通过体重将这三个测量值的平均值归一化并用于分析。此后，对幼崽实施安乐死。

在暴露于高氧4天后和在表面活性物质±布地奈德气管内施用后24小时，对动物进行深度麻醉。如方法中所述测量肺静态顺应性。结果显示在表1和图1中。将平均值±标准偏差绘制在图1中并显示在表1中(黑圈接受单独表面活性物质100mg/kg；黑方块接受表面活性物质100mg/kg+布地奈德0.05mg/kg；黑三角接受表面活性物质100mg/kg+布地奈德0.25mg/kg)。使用单因素方差分析和Turkey氏多重比较检验来分析数据(#p＝0.0004；*p＝0.03,当将单独表面活性物质组与表面活性物质+布地奈德组进行比较时)。

表1.

从表1可以看出，与Yeh等人,(2008)使用的布地奈德剂量相比，达到了基本类似的效果。

实施例6.在羔羊模型中的体内效应

本研究的目的是，使用羔羊模型来检验以下假设：在猪肺磷脂中的低剂量的布地奈德同样有效地改善生理学和炎症指标，而全身作用较小。

实验操作

母羊在妊娠约50天时与妊娠核实日期吻合。在胎儿的手术分娩前不对母羊进行操作。用静脉内氯胺酮镇静母羊并进行脊髓麻醉。暴露胎儿的头部和颈部，给胎儿施用IM-10mg/kg估计胎儿体重的氯胺酮作为补充镇静剂和经气管的皮肤的利多卡因渗透。将一根4.5mm气管内的管固定在气管中，然后用50ml注射器和轻轻抽吸通过ET管抽吸胎儿肺液。羔羊分娩，表面干燥，称重并置于机械通风中，身体处于初始期位置，以帮助表面活性物质/布地奈德在肺中的均匀分布。

将新生羔羊随机分配至2种治疗：

200mg/kg(2.5ml/kg)的固尔苏+0.1mg/kg(0.5ml/kg)的布地奈德

200mg/kg(2.5ml/kg)的固尔苏+0.04mg/kg(0.5ml/kg)的布地奈德

为了比较目的，使用了200mg/kg的固尔苏+0.25mg/kg的布地奈德。

将表面活性物质(7.5ml，基于3kg的估计重量)抽入10ml注射器中，然后用布地奈德或盐水加至总计9ml。手动将混合物旋转多次以使各组分混合。在施用前再次旋转表面活性物质和治疗药物的组合。在即将开始机械通气以帮助分配表面活性物质之前，通过气管滴注法治疗小羊，并进行胸部定位。

将每只羔羊放在婴儿加温床上。使用Fabian婴儿呼吸机进行通气，所述呼吸机设定成递送40％的加热和加湿氧气，初始峰值吸气压力为30cmH

在6小时用静脉内戊巴比妥对羔羊实施安乐死，用于组织采样。

使用了布地奈德的高灵敏度LC-MS测定和用于分析布地奈德酯的水解操作。将来自对照羔羊的其它器官的组织用于基线mRNA分析。对于布地奈德的血浆水平，对2018动物组如下采血：15min、30min、1h、2h、4h和6h。对于在6小时进行组织采样的动物，在左肺的肺泡灌洗液中测量布地奈德，并在左肺中测量残留的布地奈德。如果有指示，也在其它器官中测量布地奈德。我们以前仅在血浆、肺和BALF上测量了布地奈德水平。

如下从绵羊血浆中提取血浆样品和倍他米松标准品：在10mL玻璃试管中，将20μL样品或标准品加入50μL内部标准品(布地奈德-d8,50ng/mL)中。将试管密封，涡旋10秒，然后在室温温育5分钟。然后将1mL乙酸乙酯添加到每个样品中。将样品涡旋2分钟，然后离心(5min,3000rpm,24摄氏度)。将700μL上清液转移至1.5mL玻璃自动采样瓶，并在真空下干燥(30分钟,3000rpm,37摄氏度)。然后将样品重新悬浮于70μL的1:1甲醇和水溶液中，然后在50℃在轻轻摇动下温育10分钟。

如下从暴露于布地奈德的肺样品中提取：将50μL内部标准品(布地奈德-d8,50ng/mL)添加到在2mL组织浸渍管中添加的100mg样品中。然后将1mL乙酸乙酯加入到每个样品中。使用两个6,500rpm x 2分钟的循环浸渍样品。然后将样品在50摄氏度温育1小时，离心(5min,3000rpm,24摄氏度)并过滤。将700μL的澄清上清液转移至1.5mL玻璃自动取样瓶，并在真空下干燥(30分钟,3000rpm,37摄氏度)。然后将样品重新悬浮于70μL的1:1甲醇和水溶液中，然后在轻轻摇动下温育(10min，在50摄氏度)。使用相同的方法提取用于肺分析的标准品，唯一的例外是将50μL内部标准品和20μL血浆标准品添加到100mg从未使用(naive)布地奈德的动物收集的胎儿肺组织中。在提取前，在0.0125mg/ml的10mM牛磺胆酸盐的浓度，用溶解在0.1M K

使用Agilent Technologies 1290Infinity泵和6400系列三重四极LC/MS系统进行分析，并采用正离子模式的电喷射电离源。将20μL样品注入MS中，并使用AgilentPoroshell 2.1x 50mm C18,2.6μM柱和Phenomenex Biphenyl 3x 150mm,2.6μM柱色谱分离分析物。双溶剂梯度洗脱的流动相包括：(Al)水+0.1％甲酸，然后(B1)甲醇+0.1％甲酸，以0.5mL/min的流速递送，梯度为在10分钟内从50％B至98％，然后重新平衡2min，随后注射。将MS设置为检测质量分别为431.5和323.0的前体和产物布地奈德离子(采集时间3.9分钟)，以及质量分别为439.5和421.5的布地奈德-d8离子(采集时间3.83分钟)。使用10:1的信噪比作为截止，可以可靠地测量低至0.01ng/mL浓度的布地奈德浓度。

关于静态肺顺应性，测量肺的压强-体积曲线。将左肺用于肺泡冲洗和用于残留布地奈德的测量。

将右上叶用福尔马林膨胀固定以用于组织病理学，并采样右中叶进行mRNA分析。选择性地收集脑、肠和肝组织，用于通过mRNA-Seq分析mRNA表达，以关于细胞分裂、细胞死亡、炎症和早期损伤标志物测试布地奈德是否改变了蛋白质的表达。该方案比测量组织中的布地奈德水平更灵敏和确定。将动物组用于分析肺部炎症和用于评估布地奈德对其它器官的作用。

该研究评价了较低剂量的布地奈德对机械通气诱发的肺和全身性损伤的影响。基于先前的结果，为了布地奈德对损伤的标志物和生理学效应的最大作用，选择6小时的时间点。在动物中使用有害和非有害的通风。将先前于2017年完成的动物组用于与一些重叠组的对比。在各组和前几年之间对比生理学变量和损伤标志物。将结果显示为平均值±SEM，并报告为相对于对照的增加倍数，对照值设定为1。计算通气效率指数(VEI)[3800/(PIP X速率X PaCO

此外，使用TRIzol(Invitrogen)从右中叶的周围肺组织和肝脏中提取信使RNA(mRNA)。使用Verso cDNA试剂盒(Thermoscientific)从1μg mRNA产生cDNA。使用用于上皮钠通道(ENaC)、表皮调节素(EREG)、白介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、血清淀粉样蛋白A3(SAA3)、表面活性蛋白B(SFTPB)和TNF-α的羊序列的定制Taqman基因引物(Life Technologies)。在CFX Connect机器和软件(Bio-Rad)上使用iTaqUniversal混合物(Bio-Rad)在15μL反应中进行定量RT-PCR。18S引物(Life Technologies)用作内部加载对照。

结果

将平均气道压(MAP)和在40cmH

支气管肺发育异常(BPD)的发病机制的核心是，由出生后机械通气和氧毒性引起的大量肺部炎症应答的诱导。前24小时的肺表现和通气管理确实可以标志出促炎反应的程度以及进一步的肺泡生长和血管生成的紊乱。

在这点上，来自在6小时时压强-体积曲线的在40cm H

结果表明，布地奈德0.1mg/kg和0.04mg/kg的V40/kg明显高于仅表面活性物质的动物。

此外，接受0.25mg/kg或0.1mg/kg的动物具有降低的平均气道压需求。但是，尽管有积极的趋势，但对于接受0.04mg/kg的组，所述值未达到显著性变化。

肺mRNA损伤评价的结果报告在图3中。

与非伤害性通气相比，伤害性机械通气导致促炎细胞因子IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA更大增加(图6)。布地奈德0.25mg/kg降低了IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA。布地奈德0.1mg/kg降低了IL-6mRNA并显示出降低MCP-1的强烈趋势(p＝0.06)。尽管存在应答的较大差异，但对于0.04mg/kg剂量也观察到轻微的下降趋势。

对于所有剂量的布地奈德，ENaC mRNA比仅表面活性物质进一步增加，其随机械通气而增加。在任何剂量与仅表面活性物质的动物相比，SFTPB或SAA3均无变化。

肝mRNA对机械通气的应答的结果报告在图4中。

机械通气增加了肝脏中的SAA3、MCP-1和IL-6mRNA。在非伤害性机械通气和伤害性机械通气的情况下，发现肝脏中mRNA增加的大差异(图7)。布地奈德0.1mg/kg降低了肝SAA3mRNA。在无伤害通气的情况下，布地奈德0.25mg/kg和0.1mg/kg降低了肝MCP-1mRNA，而在损伤下仅0.25mg/kg降低了MCP-1(由于受伤动物的大差异)。

当参考数值限制或范围时，端点以及落入所述范围内的所有值和子范围均被明确地包括和公开。

本文中使用的词语“一个”和“一种”应解释为是指“一个/种或多个/种”。

所有引用的现有技术文献通过引用全文并入本文。