多酶型生物传感器和多酶型生物传感器在室温下的稳定化

摘要

本文公开了在环境温度下稳定的多种酶的生物传感器，及其制造方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年4月5日提交的美国临时申请no.62/830,191的优先权和权益，并且出于所有意图和目的将其全部内容并入本文。

技术领域

本发明涉及多种酶的生物传感器(比如肌酸和肌酸酐生物传感器)及其制造方法，其具有在室温下的酶稳定性和延长的保存寿命以及使用寿命。

背景技术

酶生物传感器用于检测患者体液样品(比如血液)中的多种分析物，比如肌酸酐、肌酸、葡萄糖、脲和乳酸盐/酯。同样地，酶生物传感器在协助患者疾病的定点照护(point-of-care)诊断中是特别重要的。

然而，酶生物传感器的缺点之一(特别是在定点照护应用中)是其在连续使用中和其在环境温度下的保存寿命(典型地小于15天)中的酶活性的损失。因此，保存寿命短是限制酶生物传感器(比如肌酸和肌酸酐生物传感器)的实际应用的关键因素。

保存寿命特别成问题的酶生物传感器是肌酸酐生物传感器。测量肌酸酐例如在患者中确定肾功能不良是有帮助的。

肌酸酐传感器是独特的，至少是因为其是含有不仅一种，而是三种酶的酶型生物传感器。这三种酶通过交联试剂(例如戊二醛)，或通过物理吸附、用水凝胶滞留(entrapment)而固定在电极的表面上，或例如通过与导电单体电聚合而涂覆在电极上。在肌酸酐生物传感器中的肌酸酐检测是基于如下的三种酶的级联反应：

三种酶的级联反应之后产生的产物是过氧化氢(H

对于上述肌酸酐和肌酸生物传感器在长时间(意味着5个月至一年或更长)准确测量生物样品中的商业化和实际应用，必须要克服的主要挑战是生物传感器在15-25℃、优选18-24℃、更优选20-24℃以及24℃的范围内的环境温度下的储存期间酶的长期稳定性(保存寿命)。

从设计原理来看，测量底物肌酸酐的传感器灵敏度(斜率)与生物传感器的电极上的固定的酶混合物的剩余酶活性直接相关。所述三种酶，肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶，是非常脆弱的(delicate)并且在环境温度下是不稳定的。肌酸酐生物传感器灵敏度(斜率)因蛋白质变性导致的快速衰减是其不稳定性和非常有限的使用寿命或保存寿命的基础。

由于临床样品、水性质量控制试剂、校准试剂中存在肌酸，所以需要额外的用于肌酸测量的传感器以修正肌酸酐传感器的肌酸响应。肌酸传感器含有两种酶并且涉及以上所示的酶级联反应的第二和第三步。

全血液分析仪，例如GEM

现有技术中具有类似通用设计的大多数市售肌酸酐传感器通过冷藏生物传感器的关键部件来解决肌酸酐传感器使用寿命和保存寿命短的问题，以延长其寿命。然而，该方法为例如医院的定点照护位置处的现场操作员的仪器操作添加了复杂性。对于

已知的是，处于游离形式的干态(stage)单一酶或溶液中的单一酶的活性可用单糖或多糖来延长。然而，为了有益的保存寿命而延长干储存和环境温度下三种或两种酶的生物传感器系统的活性引入了在延长单一酶的生物传感器系统的活性中没有遇到的挑战。以下描述的本发明识别出并且解决了延长多种酶的生物传感器(比如肌酸和肌酸酐生物传感器)的活性、保存寿命和使用寿命的问题。

保持酶型生物传感器中的酶活性对于保存寿命和使用寿命是关键的。据推测在水的存在下，糖中含有的多羟基基团与水复合。在糖-水复合物与酶相互作用时，糖-水复合物透入酶结构中，即便当酶是交联的时也是如此。不受理论约束，据信与水复合的糖减少了酶结构的展开，这有助于保持酶活性。

然而，与保持单一酶的传感器的稳定性相比，由于多种酶化学结构之间的复杂的相互作用，肌酸酐传感器中具有三种酶在一起对保持酶稳定性具有更多挑战。这些复杂的相互作用在制备传感器期间或在货架储存期间引起一种或多种酶的不稳定性。这些相互作用导致低于预期的生物传感器性能。本文公开的发明的目的是解决生物传感器(比如肌酸酐和肌酸多种酶的传感器)的有益的保存寿命和缺乏稳定性，这是因为酶的交叉相互作用引起传感器在15-25℃的范围内的环境温度下的保存寿命和使用寿命的不期望的降低。

发明内容

本发明涉及在室温下稳定的多种酶的生物传感器，制造所述稳定的多种酶的生物传感器的方法，和容纳所述稳定的多种酶的生物传感器的盒。术语传感器和生物传感器在全文中可互换使用。

在一个方面中，本发明涉及制造多种酶的生物传感器的方法，所述生物传感器具有至少5个月的在环境温度下的保存寿命以及额外三周的使用寿命的稳定性。所述方法包括：提供电极，在所述电极的表面上流延在溶液中的多种酶，即酶混合物，以形成酶层，在酶层的表面上施加扩散阻隔物，向电极施加多糖溶液，和干燥电极以形成稳定的多种酶的生物传感器。

例如，生物传感器的电极选自：铂、金、钯，铂、金和钯的合金，碳，石墨和碳纳米管。

所述多种酶选自但不限于肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶。在本发明的一个实施方式中，通过化学交联将酶固定在电极上，例如，用戊二醛、1,4-二异氰酸根丁烷、1,2,7,8-二环氧辛烷和1,2,9,10-二环氧癸烷或其组合。生物传感器能够测量体液样品(比如血液、血浆或血清)中的肌酸和/或肌酸酐。

在多个实施方式中向电极施加多糖溶液的步骤包括施加一种或多种多糖，比如但不限于二糖，蔗糖、海藻糖和乳糖醇，三糖，棉子糖，和其他多糖。在用酶混合物对电极进行溶剂流延之前将多糖添加至酶混合物，或者，在施加扩散阻隔物之后在溶液中将多糖添加至电极，或作为以上步骤的组合。电极可沉浸在多糖溶液中，干燥，并且再次沉浸在多糖溶液多次，每次沉浸之后都干燥。在溶液中多糖的浓度范围为大于0％至约25％并且多糖处理的持续时间为三十分钟或更长。

在本发明的一个实施方式中，选自聚乙烯亚胺、聚(N-乙烯基咪唑)、聚丙烯亚胺、聚烯丙基胺、聚乙烯基吡啶、聚乙烯基吡咯烷酮、多聚赖氨酸、鱼精蛋白以及聚离子化合物的衍生物的聚离子化合物可被添加至酶混合物。

施用所述扩散阻隔物包括向电极施加聚合化合物，其选自聚氨酯、聚(四氟乙烯)离聚物(全氟磺酸盐离聚物，

根据本发明的方法的稳定的多种酶的生物传感器在环境温度下储存至少5个月和使用21天之后保持大于400pA/mg/dl的稳定的肌酸酐性能。

在另一方面，本发明涉及多种酶的生物传感器，其包含：电极，作为酶层的固定在所述电极上的多种酶，酶层的表面上的扩散阻隔物，和多糖。电极、酶、交联剂、多糖、扩散阻隔物和多种酶的生物传感器的稳定性在上文中描述。

在又一方面，本发明涉及在传感器阵列中容纳至少一个多种酶的传感器的盒，所述至少一个多种酶的传感器包含：具有包含多种酶的酶层的电极，临近体液样品流动室的电极的酶层的表面上的扩散阻隔物，和多糖。包含电极、酶、交联剂、多糖、扩散阻隔物的多种酶的传感器和多种酶的生物传感器的稳定性在上文中描述。在根据本发明的一个实施方式中，除了具有其中包括根据本发明的酶生物传感器的传感器阵列的卡之外，所述盒还在传感器阵列中容纳至少一个上述多种酶的传感器，并且额外地包括：参比溶液，流体通道，校准试剂，冲洗液和用于与临床分析仪操作性地对接的电子组件，和其他关键组件。

附图说明

图1示出了根据本发明的一个实施方式的酶传感器的横截面图。

图2A是10个盒的组中的肌酸酐传感器活性的图示说明，各盒的肌酸酐传感器的活性(在5个月室温储存之后在三周使用时间期间)作为斜率绘出，单位为相对于盒的寿命(age，年龄)(小时)的皮安/毫克/分升(pA/mg/dL)，例如，在22°-25℃下。各盒装入了未接受蔗糖处理的肌酸酐传感器。测试在一周后中止，因为斜率下降到400皮安/毫克/分升(400pA/mg/dL)的临界(cut-off)值以下。建立该临界(值)以确保盒到盒(传感器到传感器)之间的分析性能一致性；

图2B是5个盒的另一组中的肌酸酐传感器活性的图示说明。各盒的肌酸酐传感器的活性(在5个月室温储存之后在三周使用时间期间)作为相对于盒的寿命(小时)的斜率(pA/mg/dL)绘出。各盒装入了接受用10％蔗糖处理的肌酸酐传感器；

图3是四批编号为3919、3921、3925和3926的经蔗糖处理且包含聚乙烯亚胺的肌酸酐传感器在5个月室温储存之后在3周使用寿命期间的灵敏度的图示说明；测试了一共十二个肌酸酐传感器。

图4A是十个盒的组(酶混合物中无聚乙烯亚胺的肌酸酐和肌酸传感器)中的肌酸酐传感器在临床样品中的分析性能的图示说明，各自由不同的符号代表。在GEM PAK和参比化学分析仪之间的测量的肌酸酐的差值(即偏差，或误差)相对于由参比化学分析仪报告的血浆肌酸酐作图，虚线是用于临床应用的任何给定肌酸酐浓度下的可接受的偏差限度。由于传感器-到-传感器之间在性能上的变化，GEM和参比分析仪之间的偏差是分散的并且许多样品的偏差超出了可接受的限度(虚线之外的数据点)。

图4B是十个盒的另一种组(具有含聚乙烯亚胺的酶混合物的肌酸酐和肌酸传感器)中的肌酸酐传感器在临床样品中的分析性能的图示说明，各自由不同的符号代表。在GEM PAK和参比化学分析仪之间的测量的肌酸酐的差值相对于由参比化学分析仪报告的血浆肌酸酐作图，虚线是用于临床应用的任何给定肌酸酐浓度下的可接受的偏差限度。凭借改进的传感器性能，偏差分布紧凑并且大部分样品的偏差在临床可接受的限度之内(数据点在虚线内)。

具体实施方式

下文描述的本发明涉及用于增强酶稳定性以延长多种酶的生物传感器的保存寿命和使用寿命的装置和相关方法，包括但不限于用于体外诊断中、特别是定点照护应用的临床分析仪的肌酸和肌酸酐生物传感器。

根据本发明，多糖(例如，二糖，比如蔗糖)为维持多种酶的系统(比如三种酶的生物传感器系统，例如，肌酸酐传感器)的稳定性和活性以及延长其保存寿命和使用寿命的最佳成分。其他多糖比如海藻糖(α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡萄糖苷)、棉子糖(O-α-D-半乳吡喃糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基β-D-呋喃果糖苷)和乳糖醇(4-O-β-D-半乳吡喃糖基-D-葡萄糖醇)(全部多糖都从Sigma获得)还改进了多种酶的生物传感器中的酶的稳定性和活性，延长了其保存寿命和使用寿命。

为简单起见，10％蔗糖用作以下呈现的研究的示例多糖。凭借蔗糖稳定化，观察到在环境温度下保持多种酶的活性的显著改进。在蔗糖处理酶稳定化之后在室温下储存多种酶的传感器时，实现了至少5个月的稳定保存寿命。

聚电解质，即聚离子化合物，是除了多糖之外另一类已知的可用作多种酶的稳定剂的化学品，例如，聚乙烯亚胺(PEI)。PEI已在单一酶的生物传感器中应用，例如在含生物传感器的盒上的乳酸盐/酯酶型传感器配制物，例如，出于该目的的

如下文所描述，发明人确定了二糖(例如，蔗糖)是用于维持和使生物传感器(例如，肌酸酐传感器)的两种或三种酶的系统的活性具有稳定性的最佳成分之一。其他多糖(比如海藻糖、棉子糖和乳糖醇)也对多种酶的传感器具有类似的效果，改进稳定性。

典型的酶生物传感器，例如根据本发明的肌酸或肌酸酐生物传感器示于图1中。传感器卡50上的酶传感器59包括三层复合膜60，所述三层复合膜60包含：从体液样品流动室56到电极57布置的临近流道56的外部扩散膜51，位于外膜51和临近电极57的内膜55之间的酶层53。酶传感器59接触患者样品，随着样品沿流道56流动并且流过酶传感器59的外膜51。

在本发明的一个实施方式中，制造根据本发明的稳定的经二糖处理的多种酶的传感器的步骤包括：

(i)在电极上对多种酶进行溶剂流延，例如，任选地交联的多种酶的混合物，例如三种酶或两种酶的混合物，交联剂(如果施加的话)选自：戊二醛，1,4-二异氰酸根丁烷，1,2,7,8-二环氧辛烷，1,2,9,10-二环氧癸烷，及其组合；替代地，在所述电极的表面上固定一种或多种酶可通过物理吸附、用水凝胶滞留而实现，或例如通过与导电单体电聚合而涂覆在电极上而实现。电极可选自：铂，金，钯，前述物质的合金，碳，石墨，和碳纳米管；

(ii)向溶剂流延的多种酶的电极施加扩散控制阻隔物，扩散控制阻隔物比如为：聚氨酯，聚(四氟乙烯)离聚物(全氟磺酸盐离聚物，

(iii)使溶剂流延的电极暴露于多糖溶液，例如，二糖溶液，比如，蔗糖溶液，或海藻糖，棉子糖或乳糖醇，浓度(w/v)范围>0％至2％，2％至25％，2％至20％，5％至15％，10％至15％，优选地，10％溶液(暴露)达至少30分钟至24小时，至少30分钟至240分钟，至少30分钟至120分钟，至少30分钟至60分钟，优选至少30分钟，和，

(iv)空气干燥。

在上述制造经多糖处理的多种酶的生物传感器的方法的替代实施方式中，如以下更详细描述地，在将酶混合物溶剂流延在电极上之前，将多糖和任选的聚离子化合物(比如PEI)直接添加至酶混合物中，然后将多糖、任选的PEI、和多种酶的混合物溶剂流延在电极上，而不是在步骤(iii)中使电极暴露于多糖溶液。

在制造经多糖处理的多种酶的生物传感器的方法的另一个替代实施方式中，如以下更详细描述地，将以上的步骤(iii)与添加多糖的步骤组合，任选地直接向酶混合物中添加聚离子化合物(比如PEI)，然后将酶混合物溶剂流延在电极上。

实施例

制造具有延长的生物传感器活性的保存寿命和使用寿命的多种酶的生物传感器的应用和方法的实例在以下由为证明原理而进行的研究而呈现。

肌酸酐传感器通过用三种酶的混合物对铂电极进行溶剂流延而制造。三种酶的混合物用30％肌酸酐酶、30％肌酸酶、30％肌氨酸氧化酶和10％戊二醛(重量百分数)在水中制备。两个酶肌酸电极通过用在水中的45％肌酸酶、45％肌氨酸氧化酶和10％戊二醛的两种酶的混合物(重量百分数)对铂电极进行溶剂流延而制造。通过将水性酶溶液分配(散布，dispensing)到电极的表面上而将酶混合物流延在铂电极上。电极上的溶剂流延的酶层的厚度范围为1至10微米，优选2-5微米。酶流延的电极接着用聚氨酯覆盖以形成外膜。电极的外膜暴露于在传感器卡的流道中流动的患者的体液样品。

外膜包含具有不同吸水率水平的聚氨酯的共混物。外膜的一个实施方式的典型组成为77％的具有20％吸水率的脂族的、聚醚基聚氨酯，17％的具有60％吸水率的脂族的、聚醚基聚氨酯，和6％的具有3％吸水率的脂族的、聚醚基聚氨酯。扩散阻隔物外膜中的替代聚氨酯共混物也是可能的，比如描述在美国专利No.6,960,466中的那些和在同日(even-date)提交的Outer Membrane Compositions for Creatinine/Creatine Sensors(律师案卷号INL-169)，出于所有意图和目的，通过引用将每一篇以其全部内容并入本文。

在一个实施方式中，具有该组成的传感器外膜可例如通过将3.0mL环己酮溶剂、17.0mL四氢呋喃溶剂、1.08g的20％吸水率聚氨酯、0.24g的60％吸水率聚氨酯和0.08g的3％吸水率聚氨酯的溶液分配层铺在复合膜的酶层上并且与复合膜的酶层直接接触而制造。除了聚氨酯之外，其他合适的聚合物包括但不限于聚(四氟乙烯)离聚物(全氟磺酸盐离聚物，

参见图2A，在进行的研究中心，一些肌酸酐生物传感器(对照)是未经蔗糖处理的。这些肌酸酐传感器，就像经蔗糖处理的肌酸酐生物传感器一样在室温下储存。

参见图2B，在施加扩散阻隔物(在此情况中为聚氨酯)之后，将其他肌酸酐生物传感器沉浸在处于生物学pH 7.4缓冲下的10％蔗糖溶液中达30分钟，随后在环境温度下在空气中干燥。

参见图3，通过将聚乙烯亚胺添加到三种酶的混合物中研究另一组肌酸酐传感器。这些肌酸酐生物传感器例从如5重量％肌酸酐酶、55重量％肌酸酶、30重量％肌氨酸氧化酶、5重量％PEI和5重量％戊二醛的混合物制备。肌酸酐电极中的肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶的重量分数以及肌酸电极中的肌酸酶和肌氨酸氧化酶的重量分数可以变化并且不限于上述重量百分数。肌酸酐和肌酸电极中的聚乙烯亚胺的重量百分比可以变化，例如，为1％至20％，并且肌酸酐和肌酸电极中的戊二醛的重量百分比也可以变化，例如为1％至10％。还可以使用除了聚乙烯亚胺以外的聚离子稳定剂用于使酶混合物稳定化。聚离子化合物的实例包括但不限于：聚(N-乙烯基咪唑)，聚丙烯亚胺，聚烯丙基胺，聚乙烯基吡啶，聚乙烯基吡咯烷酮，多聚赖氨酸，鱼精蛋白，及其衍生物。如在之前的实施例中描述的，然后直接将聚氨酯外膜施加在酶层上。然后使传感器暴露于10％蔗糖达至少30分钟并且随后在空气中干燥。

施加多糖比如蔗糖以延长多种酶的生物传感器稳定性不限于前述研究中公开的蔗糖浓度、用或不用PEI。例如，在本发明的另一个实施方式中，在将含蔗糖的酶混合物施加在电极上之后，通过将具有施加至电极表面的含蔗糖的酶混合物的电极沉浸在具有多种浓度的蔗糖的溶液中来进一步进行蔗糖处理。例如，在水中用6％肌酸酐酶、50％肌酸酶、15％肌氨酸氧化酶、1％戊二醛和28％蔗糖(重量百分数)制造三种酶的混合物。在施加如在前述实施例中描述的外膜之后，具有此含蔗糖的酶混合物的肌酸酐传感器可随后再次经历额外的蔗糖处理，以进行多次蔗糖处理。

根据前述方法制备的肌酸酐生物传感器在室温下储存达5个月。在室温下储存5个月后在三周时间期间研究两组传感器的灵敏度，未经经蔗糖处理的对照肌酸酐传感器(图2A)和经蔗糖处理的肌酸酐传感器(图2B)。在三周使用寿命结束时需要的最低斜率(pA/mg/dL)为400pA/mg/dL。

再参见图2A，未用蔗糖处理的对照传感器的研究在一周之后中止因为传感器的斜率跌到低于所需最低斜率阈值(400pA/mg/dL)。

再参见图2B，对于用蔗糖处理的肌酸酐传感器，起始斜率显著更高并且在三周研究时间期间保持高于400pA/mg/dL阈值。

再参见图3，从四个批次(表示为批次号3919、3921、3925和3926)中选择十二个肌酸酐传感器，每批经蔗糖处理的(10％溶液)肌酸酐传感器的生产中选择三个传感器。这些传感器还在其酶混合物中含有PEI。在5个月储存和三周使用寿命之后研究十二个肌酸酐传感器的灵敏度。研究证实了在肌酸酐传感器的三周使用寿命期间在经PEI和蔗糖处理的肌酸酐传感器的多个批次之间的性能一致性。

参见图4A，进行经蔗糖处理的肌酸酐传感器(酶混合物中无聚乙烯亚胺)在测量临床样品中的肌酸酐的分析性能的研究。在GEM PAK和参比化学分析仪之间测量的肌酸酐的差值相对于由参比化学分析仪报告的血浆肌酸酐作图，虚线是用于临床应用的任何给定肌酸酐浓度下的可接受的偏差限度。由于传感器到传感器之间的性能变化，偏差在宽阔的空间范围内分散并且许多样品的偏差超出了可接受的限度(数据点在虚线外)。

参见图4B，显示了经蔗糖处理的肌酸酐传感器(具有含有聚乙烯亚胺的酶混合物)在临床样品中的分析性能的研究。在GEM PAK和参比化学分析仪之间测量的肌酸酐的差值相对于由参比化学分析仪报告的血浆肌酸酐作图，虚线是用于临床应用的任何给定肌酸酐浓度下的可接受的偏差限度。凭借通过添加聚乙烯亚胺而改变(改性)的传感器配制物，证实了改进的传感器性能(图4B相对于4A所显示的数据)，偏差紧凑分布并且用聚乙烯亚胺改变的传感器测量的大多数样品的偏差在临床可接受的限度内(数据点在虚线内)。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.生物传感器，其包含：

电极，固定在所述电极上的多种酶，在所述电极的表面上的扩散阻隔物，和多糖。

2.权利要求1所述的生物传感器，其中所述电极选自由以下组成的电极的组：铂，金，钯，铂、金和钯的合金，和碳电极。

3.权利要求1所述的生物传感器，其中所述电极选自由以下组成的电极的组：石墨和碳纳米管电极。

4.权利要求1所述的生物传感器，其中所述多种酶是交联的。

5.权利要求1所述的生物传感器，其中所述多种酶选自肌酸酶、肌酸酐酶和肌氨酸氧化酶。

6.权利要求1所述的生物传感器，其中多糖选自蔗糖、海藻糖、棉子糖和乳糖醇。

7.权利要求1所述的生物传感器，其中生物传感器能够测量肌酸。

8.权利要求1所述的生物传感器，其中生物传感器能够测量肌酸酐和肌酸。

9.权利要求1所述的生物传感器，其中所述扩散阻隔物包含聚合化合物，其选自：聚氨酯，聚(四氟乙烯)离聚物(全氟磺酸盐离聚物，

10.权利要求1所述的生物传感器，其中所述多糖包含10％蔗糖。

11.制造稳定的多种酶的生物传感器的方法，其包括：

提供电极；

在所述电极的表面上流延在溶液中的多种酶；

在所述电极的表面上施加扩散阻隔物；

向电极施加多糖溶液；

干燥电极以形成稳定的多种酶的生物传感器。

12.权利要求11所述的方法，其中所述酶是交联的。

13.权利要求11所述的方法，其中所述酶通过选自以下的化学品交联：戊二醛，1,4-二异氰酸根丁烷，1,2,7,8-二环氧辛烷和1,2,9,10-二环氧癸烷，及其组合。

14.权利要求11所述的方法，其中所述电极选自由以下组成的电极的组：铂，金，钯，铂、金和钯的合金，以及碳基材料。

15.权利要求11所述的方法，其中所述电极选自由以下组成的电极的组：石墨和碳纳米管。

16.权利要求11所述的方法，其中多糖选自蔗糖、海藻糖、棉子糖和乳糖醇。

17.权利要求11所述的方法，其中生物传感器能够测量肌酸酐和肌酸。

18.权利要求11所述的方法，其中生物传感器能够测量肌酸。

19.权利要求11所述的方法，其进一步包括向电极施加在酶混合物溶液中的聚离子化合物，其选自：聚乙烯亚胺，聚(N-乙烯基咪唑)，聚丙烯亚胺，聚烯丙基胺，聚乙烯基吡啶，聚乙烯基吡咯烷酮，多聚赖氨酸，鱼精蛋白，以及聚离子化合物的衍生物。

20.权利要求11所述的方法，其中施加所述扩散阻隔物包括施加：聚氨酯，聚(四氟乙烯)离聚物(全氟磺酸盐离聚物，

21.权利要求11所述的方法，其中施加多糖包括使电极暴露于多糖溶液至少30分钟。

22.权利要求11所述的方法，其中在环境温度下干储存5个月和使用21天之后，生物传感器保持稳定的肌酸酐性能。

23.权利要求11所述的方法，其中稳定的肌酸酐性能包括在环境温度下储存5个月和使用21天之后，保持大于400pA/mg/dL的稳定的生物传感器性能。

24.容纳多种酶的传感器的一次性的盒，所述多种酶的传感器包含：电极，多种酶，在所述电极的表面上的扩散阻隔物，和多糖。

25.权利要求24所述的一次性的盒，其中多种酶的传感器之一包括肌酸传感器。

26.权利要求24所述的一次性的盒，其中多种酶的传感器之一包括肌酸酐传感器。

27.权利要求24所述的一次性的盒，其中多种酶中的一种包括肌酸酐酶。

28.权利要求24所述的一次性的盒，其中多种酶中的一种包括肌酸酶。

29.权利要求24所述的一次性的盒，其中多种酶中的一种包括肌氨酸氧化酶。

30.权利要求24所述的一次性的盒，其进一步包含多个传感器阵列和校准试剂。

31.权利要求11所述的方法，其中在将酶溶液施加至电极之前，将多糖溶液添加至酶溶液。

32.权利要求11所述的方法，其中在将扩散阻隔物施加至电极之后，将多糖溶液施加至电极。

33.权利要求11所述的方法，其中在将酶溶液施加至电极之前，将多糖溶液添加至酶溶液，并且在施加扩散阻隔物之后，将多糖溶液添加至电极。

34.权利要求11所述的方法，其中多糖溶液包含10％蔗糖。

35.权利要求1所述的生物传感器，其包含多种酶的混合物和固定在电极上的多糖。

36.权利要求35所述的生物传感器，其中所述混合物进一步包含聚离子化合物。

37.权利要求36所述的生物传感器，其中聚离子化合物选自：聚乙烯亚胺，聚(N-乙烯基咪唑)，聚丙烯亚胺，聚烯丙基胺，聚乙烯基吡啶，聚乙烯基吡咯烷酮，多聚赖氨酸，鱼精蛋白，以及聚离子化合物的衍生物。

38.权利要求24所述的一次性的盒，其中多种酶的传感器包含与多种酶混合的聚离子化合物。

39.权利要求38所述的一次性的盒，其中聚离子化合物选自：聚乙烯亚胺，聚(N-乙烯基咪唑)，聚丙烯亚胺，聚烯丙基胺，聚乙烯基吡啶，聚乙烯基吡咯烷酮，多聚赖氨酸，鱼精蛋白，以及聚离子化合物的衍生物。

40.权利要求1所述的生物传感器，其中扩散阻隔物包含外膜，所述外膜包含具有不同吸水率水平的聚氨酯的共混物。

41.权利要求11所述的方法，其中扩散阻隔物包含外膜，所述外膜包含具有不同吸水率水平的聚氨酯的共混物。

42.权利要求24所述的一次性的盒外壳，其中扩散阻隔物包含外膜，所述外膜包含具有不同吸水率水平的聚氨酯的共混物。