包含CD300C表达抑制剂或活性抑制剂的预防或治疗癌症的药物组合物

摘要

本发明涉及：用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含CD300c表达抑制剂或活性抑制剂等等。根据本发明的CD300c表达抑制剂或活性抑制剂，在癌症环境中，增加了肿瘤浸润淋巴细胞和细胞毒性T细胞的数量，减少了骨髓来源的抑制剂细胞的数量，并可以有效地抑制癌症的生长和发育，并且因此有望有效地用作免疫疗法来治疗各种癌症。

说明书

技术领域

本发明涉及包含CD300c蛋白表达抑制剂或活性抑制剂等的药物组合物。

背景技术

癌症是在现代人中占死亡原因最大份额的疾病之一，是由于各种原因引起的基因突变导致正常细胞发生变化而引起的疾病，并且是指不遵循正常细胞分化、增殖、生长方式等的恶性肿瘤。癌症的特征是“不受控制的细胞生长”，并且这种异常的细胞生长导致形成称为肿瘤的细胞团块，该细胞团块浸润周围的组织，在严重的情况下，可能转移到身体的其他器官。癌症是一种顽固的慢性疾病，在许多情况下，即使通过手术、放疗或化学疗法也无法从根本上治愈，会给患者带来痛苦，并最终导致死亡。

癌症药物治疗剂(即抗癌药物)通常是具有细胞毒性的化合物，可以通过攻击和杀死癌细胞来治疗癌症，但是由于它们不仅损害癌细胞而且损害正常细胞，因此显示出很高的副作用。因此，为了减少副作用，已经开发了靶向抗癌药。然而，在这些靶向抗癌药的情况下，可以降低副作用，但是存在耐药性高可能性发生的局限性(韩国专利公开No.10-2018-0099557)。因此，近年来，人们对使用人体免疫系统减少因毒性和耐药性引起的问题的免疫抗癌药物的兴趣迅速增加。作为这种免疫抗癌剂的实例，已经开发了与癌细胞表面上的PD-L1结合并抑制T细胞与PD-1的结合以激活T细胞并攻击癌细胞的免疫检查点抑制剂。然而，这些免疫检查点抑制剂也并非在各种类型的癌症中都有效，并且因此，需要开发在各种癌症中表现出相同治疗效果的新型免疫检查点抑制剂。

因此，本发明的发明人对在癌细胞表面上表达并且抑制T细胞在各种癌症中的表达的的诸如PD-L1之类的蛋白质进行了深入研究，从而完成了本发明。

具体实施方式

技术问题

设计本发明以解决上述问题，已经证实，通过抑制存在于各种癌细胞表面上的CD300c蛋白的表达或活性，T细胞的活性增加，并且可以抑制癌细胞的扩散，因此本发明的目的是提供用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括作为活性成分的CD300c表达抑制剂或活性抑制剂等等。

然而，本发明要解决的技术问题不限于上述技术问题，并且对本领域普通技术人员而言，根据以下的描述，其他未提及的技术问题将变得显而易见。

技术解决方案

根据本发明的一个方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括作为活性成分的CD300c表达抑制剂或CD300c活性抑制剂。

在本发明的一个实施方案中，CD300c表达抑制剂优选为与CD300c基因的mRNA互补结合的核酶、反义寡核苷酸(ASO)、小发夹RNA、小干扰RNA(siRNA)等，但是不受限于此，只要其是减少或抑制CD300c基因表达的材料即可。对于材料抑制CD300c表达的机制没有特别限制，例如可以是抑制基因表达的机制，例如转录和翻译。

在本发明的另一实施方案中，CD300c活性抑制剂是与CD300c蛋白互补结合的化合物、肽、肽模拟物、底物类似物、适体、抗体等，但不受限制，只要它是一种通过与CD300c蛋白结合来降低或抑制CD300c的活性的材料即可。对于材料抑制CD300c蛋白活性的机理没有特别限制，例如，可以是将活性形式转化为非活性形式的机制。在一实施方案中，该抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，优选人单克隆抗CD300c抗体，或抗体片段，但不受限制，只要其是与CD300c特异性结合的抗体即可。可溶性受体是与CD300c结合的受体，优选包括与SEQID NO：1的氨基酸序列特异性结合的序列，但不限于此，只要其是与CD300c结合的受体即可。

在本发明的另一个实施方案中，所述癌症优选为：结肠直肠癌、直肠癌、结肠癌、甲状腺癌、口腔癌、咽癌、喉癌、宫颈癌、脑癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、舌癌、乳腺癌、子宫癌、胃癌、骨癌和血液癌等，但不受限于此，只要其是在癌细胞表面上表达CD300c蛋白的癌症的类型即可。

在本发明的另一个实施方案中，药物组合物可以进一步包括其他现有的抗癌剂，并且抗癌剂优选为阿霉素、顺铂、吉西他滨、奥沙利铂、5-FU、西妥昔单抗、帕尼单抗、尼莫妥珠单抗、尼妥单抗、癌症抗原、抗癌病毒等等，但不限于此，只要它们是当前用作抗癌剂的材料即可。癌症抗原是对癌症特异的癌症疫苗，优选NY-ESO-1作为膀胱癌特异性癌症抗原，HER2作为乳腺癌特异性癌症抗原，CEA作为结直肠癌特异性癌症抗原，而VEGFR1和VEGFR2作为肺癌特异性癌症抗原，但不限于此，只要它们是已知作为癌症疫苗的癌症抗原类型即可。抗癌病毒的实例包括Imlygic和Pexa-Vec，但不受限于此，只要它们是已知的抗癌病毒即可。抗癌剂可以优选通过共同施用进一步被包含，或者可以是与本发明的抑制剂结合的形式，或者可以是一起包含在抗癌剂的载体中的形式。

在本发明的另一实施方案中，药物组合物可以抑制癌症或癌症干细胞的增殖、存活、转移和复发，以及对抗癌剂的抗性，但是作用不受限于此，只要它们是通过本发明的药物组合物获得的作用即可。

本发明还提供了一种筛选用于预防或治疗癌症的材料的方法，该方法包括：(a)培养表达CD300c蛋白的癌细胞；(b)用候选材料处理培养的癌细胞；(c)测量用候选材料处理过的细胞的CD300c表达水平；以及(d)选择降低CD300c表达水平的候选材料。

本发明还提供了一种筛选用于预防或治疗癌症的材料的方法，该方法包括：(a)用候选材料处理CD300c蛋白；(b)选择与CD300c蛋白结合的候选材料。

在本发明的一个实施方案中，表达水平的测量是指mRNA和/或蛋白质的表达水平的测量，而mRNA的表达水平的测量是指在生物学样品中是否存在CD300c mRNA及其表达水平的确认，可以通过测量mRNA的量来确定。用于此的分析方法包括RT-PCR、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、RNase保护测定(RPA)、印迹法和DNA微阵列芯片，但是本发明不限于此。另外，蛋白质表达水平的测定是指确认生物样品中是否存在CD300c蛋白质及其表达水平，这可以通过使用特异性结合CD300c的抗体测定蛋白质的量或可测量该蛋白的活性来确认。用于此的分析方法包括蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、Rocket免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀测定、完全固定测定、FACS和蛋白质芯片，但是本发明不受限于此。

在本发明的另一个实施方案中，选择与候选材料结合的材料是选择与CD300c蛋白结合的材料的方法，对此的分析方法包括蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀测定、完全固定测定、FACS和蛋白质芯片，但是本发明不受限于此。

在本发明的另一个实施方案中，候选材料是但不限于核苷酸、DNA、RNA、氨基酸、适体、蛋白质、化合物、天然产物、天然提取物或载体。。

本发明还提供了一种治疗癌症的方法，其包括向个体施用药物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的CD300c表达抑制剂或CD300c活性抑制剂。

本发明还提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物的用途，该药物组合物包括作为活性成分的CD300c表达抑制剂或CD300c活性抑制剂。

发明的有益效果

根据本发明的CD300c表达抑制剂或活性抑制剂通过与各种癌症表面上表达的CD300c结合或抑制CD300c的表达来活化T细胞，同时抑制癌细胞的增殖，并且因此可以有效地用作用于各种癌症的免疫治疗剂。这样的抑制剂可以在癌症环境中增加肿瘤浸润淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞的数量，减少髓样来源的抑制细胞的数量，并且还有效地抑制癌症的生长和发展，并且因此预期本发明的CD300c表达抑制剂或活性抑制剂作为新型免疫治疗剂可有效地用于癌症治疗。

附图说明

图1是显示根据本发明的实施方案的确认sCD300c-Fc的SDS-PAGE结果的图。

图2是显示证实根据本发明的一个实施方案的sCD300c-Fc对肿瘤浸润淋巴细胞的作用的结果的图。

图3是显示证实根据本发明实施方案的sCD300c-Fc对NF-κB的信号传导机制的作用的结果的图。

图4是显示证实根据本发明的实施方案的抗CD300c抗体对人T细胞的作用的结果的图。

图5显示证实根据本发明的一个实施方案的抗CD300c抗体对肺癌生长的抑制作用的结果。

图6是显示证实根据本发明的实施方案的抗CD300c抗体对乳腺癌生长的抑制作用的结果的图。

图7是显示证实根据本发明的实施方案的抗CD300c抗体对结肠直肠癌生长的抑制作用的结果的图。

图8是显示证实根据本发明的实施方案的抗CD300c抗体对体内癌症生长的抑制作用的结果的图。

图9是显示证实根据本发明的实施方案的抗CD300c抗体对体内癌症生长的抑制作用的结果的图。

图10示出了证实根据本发明的实施方案的CD300c siRNA对癌症生长的抑制作用的结果。

图11示出了证实根据本发明的实施方案的抗CD300c抗体对抗癌免疫应答的作用的结果。

图12是说明通过抑制CD300c的功能和/或表达来发挥抗癌作用的机理的示意图。

具体实施方式

本发明的CD300c表达抑制剂或活性抑制剂可以增加癌症环境中肿瘤浸润淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞的数量，减少髓样来源的抑制细胞的数量，并且还有效地抑制癌症的生长和发展，因此可以有效地用于治疗在表面上表达CD300c的各种癌症。

在本说明书中，“抗体”包括与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子，并且包括所有多克隆抗体、单克隆抗体及其功能性片段。另外，该术语可以包括通过基因工程产生的形式，例如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)和异源抗体(例如，双特异性抗体)。在这些抗体中，单克隆抗体是针对单个抗原位点(表位)的高度特异性抗体，与包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体不同，单克隆抗体仅针对抗原上的单个表位，因此作为治疗剂的质量控制很容易。抗体包括免疫球蛋白分子的重链和/或轻链的可变区，可变区包括形成抗体分子的抗原结合位点的部分作为其一级结构，并且本发明的抗体可以形成为含有可变区的一些片段。优选地，可变区可以由CD300c的可溶性受体代替，但不受限于此，只要其表现出与抗CD300c抗体相同的作用即可。

在本说明书中，“预防”是指通过施用根据本发明的药物组合物来抑制疾病例如癌症或延迟其发作的所有作用。

在本说明书中，“治疗”是指通过施用根据本发明的药物组合物来缓解或有益地改变由于癌症等引起的症状的所有作用。

在本说明书中，“个体”是指可以施用本发明的药物组合物的受试者，并且该受试者不受限制。

在本说明书中，“药物组合物”可以是胶囊、片剂、颗粒剂、注射剂、软膏剂、粉剂或饮料的形式，并且该药物组合物可以用于人类。药物组合物不限于上述实例，并且可以按照一般方法以例如粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、水悬浮液等口服制剂，外用制剂，栓剂和无菌注射溶液的形式配制。本公开的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。在口服的情况下，药学上可接受的载体可以是粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、颜料、矫味剂等，在注射的情况下，可以与缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等组合使用，并且在局部施用的情况下，可以是基剂、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。本公开内容的药物组合物的制剂可以通过与上述药学上可接受的载体混合以多种方式进行配制。例如，可以将用于口服的制剂以片剂、锭剂、胶囊剂、圣水(elixirs)、悬浮剂、糖浆剂、片剂等形式配制，并且可以将注射制剂配制成单位剂量的安瓿或多种剂型。另外，可以将药物组合物的制剂配制成溶液剂、悬浮剂、片剂、胶囊剂、缓释型制剂等形式。

同时，用于制剂的合适的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微量-结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。另外，药物组合物可以进一步包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。

根据本公开内容的药物组合物的施用途径包括但不限于口服施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、髓内施用、硬膜内施用、心内施用、透皮施用、皮下施用、腹膜内施用、鼻内施用、肠道给药、局部施用、舌下施用和直肠施用。口服施用或肠胃外施用是优选的。本文使用的术语“肠胃外”旨在包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、法氏囊内、胸骨内、硬膜内、病变内和颅内注射或注射技术。本公开内容的药物组合物也可以栓剂的形式用于直肠施用。

本发明的药物组合物可以根据各种因素而变化，这些因素包括所使用的特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄率、药物组合以及要预防或治疗的特定的疾病其严重程度，并且药物组合物的剂量根据患者的病情和体重、疾病的严重程度、药物形式、施用途径和施用时间而异，但可以通过本领域技术人员适当地选择，并且可以从0.0001mg/kg/天至约500mg/kg/天或0.001mg/kg/天至500mg/kg/天。药物组合物可以一天一次或多次施用。该剂量无意以任何方式限制本公开的范围。根据本发明的药物组合物可以配制成丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液或悬浮液。

在下文中，将描述以下实施例以帮助理解本发明。然而，提供这些实施例仅是为了促进对本发明的理解，而无意于限制本发明的范围。

实施例

实施例1：sCD300c-Fc的产生

为了分析CD300c在癌细胞和免疫系统中的功能，制备了其中抗体的重链区的Fc部分结合至可溶性CD300c的sCD300c-Fc。为了产生sCD300c-Fc，将编码SEQ ID NO：3的氨基酸序列的基因(SEQ ID NO：4)插入到pcDNA3.1中，并转化到HEK293T细胞系中。另外，为了产生sCD300c-Fc，将转化的细胞和提高细胞内基因转移效率的聚合物添加到补充了具有超低IgG含量的胎牛血清的RPMI培养基中，并在细胞培养箱中培养4天。培养完成后，使用离心机分离含有sCD300c-Fc的上清液，并使用0.22μm的过滤器过滤一次。另外，使用重组蛋白-ASepharose柱(GE Healthcare)分离和纯化sCD300c-Fc，并通过测量吸光度确定纯化的sCD300c-Fc的浓度。然后，将2μg纯化的sCD300c-Fc分别添加至还原样品缓冲液和非还原样品缓冲液中，并且然后使用预制的SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)进行电泳。之后，用考马斯亮蓝对蛋白质染色。其结果示于图1中。

如图1所示，证实纯化了纯度为90％或以上的sCD300c-Fc。

实施例2：证实sCD300c-Fc对肿瘤浸润淋巴细胞的作用

为了证实sCD300c-Fc对肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的作用，使用以与实施例1相同的方式制备的sCD300c-Fc进行了实验。更具体地，将补充了1％的胎牛血清(FBS)的EBD培养基(内皮基础培养基，Lonza)分配到6孔板中，将1×10

如图2所示，证实了sCD300c-Fc的浓度越高，肿瘤浸润淋巴细胞的数量越多，由此证实，通过sCD300c-Fc的处理，外周血单核细胞得以分化，从而导致渗入人脐静脉内皮细胞的淋巴细胞的数量增加，并且淋巴细胞数量的增加依赖于sCD300c-Fc的浓度。通过以上结果，证实了通过用sCD300c-Fc处理可以激活免疫细胞。

实施例3：证实sCD300c-Fc对NF-κB的信号传导机制的作用

为了确认sCD300c-Fc对NF-κB的信号传导的作用，使用与实施例1相同的方式制备的sCD300c-Fc进行了实验。更具体地说，将THP-1蓝细胞(单核细胞，InvivoGen)以每孔5,000个细胞的浓度接种到96孔板中，并培养12小时以稳定细胞。然后，将每个孔用sCD300c-Fc、脂多糖(LPS)和/或IgG处理，然后在37℃和5％CO

如图3所示，证实了在仅用LPS处理的对照中NF-κB信号为约0.4，并且在用sCD300c-Fc处理的对照中显示为0.8的默认值。相反，证实了在用LPS和sCD300c-Fc两者处理的实验组中，NF-κB的信号显著增加。还证实了通过加热而失活的sCD300c-Fc(h.i.sCD300c-Fc；热失活的sCD300c-Fc)不影响NF-κB的信号。通过以上结果，证实了sCD300c-Fc激活了NF-κB的信号传导机制，从而激活了作为免疫细胞的THP-1单核细胞，并且促进了向巨噬细胞的分化，从而有效地激活了先天免疫系统。

4.1.抗CD300c多克隆抗体的生产

为了产生针对CD300c的多克隆抗体，将用作抗原的CD300c的胞外域的基因(SEQID NO：2)插入pET28a(Novagen)表达载体中以表达6×组氨酸，并转化入大肠杆菌。然后，将转化的大肠杆菌接种到100mL补充有100mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，然后进行孵育，以使在OD 600nm处的吸光度为0.8-1.0，并添加IPTG。然后，在25℃温育16小时以诱导具有His-标签的CD300c的表达后，将培养基离心以除去上清液并获得细胞。使用将50mM NaH

然后，使用带有His-标签的纯化的CD300c对新西兰白兔进行抗原免疫。更具体地，将纯化的具有Hig-标签的CD300c抗原以浓度为0.5mg/400μL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释，与相同量的完全弗氏佐剂(Sigma)混合，并皮下注射以进行初次免疫。2周后，将0.5mg/400μL抗原和等量的不完全弗氏佐剂(Sigma)混合，并用于使用相同的方法进行二次免疫，并且然后最终使用相同的方法以2周的间隔进行四次免疫。在三次免疫后，通过从尾静脉收集血液来收集血液，并将获得的血液稀释1/1,000，以通过ELISA评估抗体的活性。在最后的第四次免疫后，在麻醉后从兔收集全血以获得血浆。

4.2.确认抗CD300c抗体的抗体特异性

为了确认以与实施例4.1相同的方式产生的抗CD300c抗体的特异性，使用稀释1000倍的血浆，通过ELISA和蛋白免疫印迹评估了以1ng、10ng、100ng、500ng和1μg的浓度稀释的CD300c抗原的特异性。结果，证实了抗CD300c抗体对CD300c抗原特异性应答。

4.3.抗CD300c抗体的纯化

为了从以与实施例4.1相同的方式获得的血浆中纯化抗CD300c抗体，使用了亲和纯化方法。更具体地说，使用偶联缓冲液(0.2M NaHCO

进行实验以确认抗CD300c抗体对人T细胞的作用。更具体地，首先使用T细胞分离试剂盒(130-096-534，Milltenyi)从人外周血单核细胞(PBMC)分离出pan T细胞。然后，将分离的T细胞以每孔5,000个细胞的浓度接种到96孔板中，并培养6小时以稳定细胞，并且用抗CD3抗体(Biolegend)和抗CD28抗体处理(Biolegend)。然后，以与实施例4.3相同的方式纯化的抗CD300c多克隆抗体以各种浓度处理。在37℃下孵育48小时后，分离培养上清液以测量IL-2的量。使用IL-2Quantikine试剂盒(R&D Systems)确认IL-2的量。其结果示于图4中。

如图4所示，确认了在用抗CD300c抗体治疗的实验组的情况中，IL-2的量根据治疗浓度而增加。由此确认，在抗CD300c抗体的情况下，IL-2的分泌增加以激活T细胞，这是一种适应性免疫系统。

6.1.确认抗CD300c抗体对肺癌生长的作用

为了确认抗CD300c抗体是否具有抑制肺癌生长的作用，首先检查了A549细胞表面是否存在CD300c抗原。更具体地，将作为人肺癌细胞系的A549细胞用4％甲醛固定，并且然后使用5％正常山羊血清封闭。然后，处理1μg抗-CD300c抗体并使之反应，然后用FITC标记的抗-兔IgG抗体染色。然后，使用流式细胞仪(FACS)确认荧光标记的细胞。其结果示于图5A中。

如图5A所示，证实人肺癌细胞系具有CD300c抗原。

另外，为了确认抗CD300c抗体是否抑制肺癌的生长，确认了癌细胞增殖的抑制作用。更具体地说，将A549细胞以每孔10,000个细胞的浓度接种到96孔板中，然后温育18小时以稳定细胞。然后，将细胞用0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL的抗CD300c抗体处理，并培养72小时。然后，使用显微镜捕获图像。其结果示于图5B中。另外，向每个孔中加入10μL的CCK-8(Dijindo)，使其反应4小时，然后测量450nm处的吸光度。其结果示于图5C中。

如由图5B和5C所示，随着所处理的抗CD300c抗体的浓度增加，肺癌细胞的增殖被抑制，由此可确认抗CD300c抗体抑制肺癌的生长。

6.2.抗CD300c抗体对乳腺癌生长抑制作用的证实

为了确认抗CD300c抗体是否具有抑制乳腺癌生长的作用，以与示例6.1相同的方式，使用属于乳腺癌细胞系的MDA-MB-231细胞检查了细胞增殖抑制作用。其结果示于图6中。

如图6所示，确认了随着所处理的抗CD300c抗体的浓度增加，乳腺癌细胞的增殖被抑制，由此确认抗CD300c抗体抑制乳腺癌的生长。

6.3.抗CD300c抗体对大肠癌生长抑制作用的证实

为了确认抗CD300c抗体是否具有抑制结直肠癌的生长的作用，与实施例6.1同样的方式使用属于转移性结直肠癌细胞系的CT-26细胞检查了细胞增殖抑制作用。其结果示于图7。

由图7可知，随着处理后的抗CD300c抗体浓度的增加，结直肠癌细胞的增殖受到抑制，由此可以确认抗CD300c抗体抑制结直肠癌的生长。

7.1.抗CD300c抗体对结直肠癌生长的抑制作用的确认

为了确认抗CD300c抗体是否具有抑制体内癌细胞生长的作用，将属于转移性结直肠癌细胞系的CT-26细胞以5×10

如图8所示，确认了随着抗CD300c抗体浓度的增加，转移性结直肠癌的大小增加减少，并且在10μg处理的实验组中，肿瘤的生长被完全抑制到15天，使得肿瘤不再发生。

7.2.抗CD300c抗体对肺癌生长抑制作用的确认

使用肺癌动物模型进行与实施例7.1相同的实验。更具体地，将作为人肺癌细胞系的A549细胞以5×10

如图9所示，确认了随着抗CD300c抗体浓度的增加，肺癌的增殖受到抑制，肿瘤没有生长。通过以上结果，证实了本发明的抗CD300c抗体甚至在体内也有效地抑制了癌症的生长。

通过以上结果，确认了抗CD300c抗体可以有效地抑制各种癌症的增殖，并且可以将抗CD300c抗体用作抗癌剂。

为了进一步确认CD300c对癌细胞增殖的作用，检查了对CD300c表达的抑制是否表现出抗癌作用。更具体地，根据使用针对CD300c的siRNA(sc-93646，Santa Cruz)提供的手册，在作为肺癌细胞系的A549细胞中CD300c的表达被抑制。将加扰(scrambled)RNA用作对照。使用Lipofectamine RNAiMax(Life Technologies)将siRNA转染到细胞中，并且然后培养30小时。然后，将培养的细胞用细胞裂解液(20mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1mMNa

如图10A所示，证实了使用CD300c siRNA可以抑制细胞中CD300c的表达。如图10B所示，还证实了当用siRNA处理癌细胞系时，细胞增殖被抑制。

根据以上结果，确认通过抑制CD300c的表达可以发挥抗癌作用，还可以确认，通过使用小干扰RNA(siRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、微小RNA(miRNA)等抑制CD300c的表达，或者通过使用与CD300c特异性结合的抗体、适体等抑制CD300a的活性，可以在各种癌症中发挥抗癌作用。

为了确认是否通过抑制CD300c的功能和/或表达来表现出抗癌免疫作用，将10μg抗CD300c抗体腹膜内注射到BALB/c小鼠中，在第0天、第1天和第5天，以与实施例7.1相同的方式向该小鼠移植了结肠直肠癌细胞系，以及在第7天安乐死后，从每只小鼠分离骨髓。然后，使用流式细胞仪(FACS)确认来自分离的骨髓的骨髓来源的抑制细胞(MDSC)、淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞。其结果示于图11中。

如图11所示，在用抗CD300c抗体处理的小鼠的情况中，淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)的数量增加，并且促进了淋巴细胞的分化诱导(CD4+)。相反，证实减少了骨髓来源的抑制细胞的数量。通过以上结果，证实了通过抑制CD300c的功能和/或表达，诱导了癌症动物模型的血液中的免疫系统的活化，并且通过减少了抑制T免疫细胞的活性或增殖的髓样来源的抑制细胞的数量，抗癌免疫作用显著增强，从而表现出癌症治疗作用。

图12是说明通过抑制CD300c的活性和/或表达的抗癌作用机理的示意图。在肿瘤表面表达的CD300c，例如形成已知免疫检查点的B7家族(例如，PD-1/PD-L1相互作用)，通过与T细胞表面上的结合伴侣结合来抑制T细胞的活化，但是已经证实，通过用与CD300c特异性结合的抗CD300c抗体处理，刺激了T细胞的活性和增殖，从而表现出抗癌作用，同时，抗CD300c抗体与肿瘤细胞表面的CD300c结合，从而直接抑制肿瘤增殖。可以确认的是，即使使用抑制CD300c表达的寡核苷酸抑制了肿瘤表面上CD300c的表达，也显示出相同的效果。

因此，由于通过上述结果证实，通过抑制CD300c的表达和/或功能，癌症环境中的肿瘤浸润淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞的数量增加，并且髓样来源的抑制细胞的数量增加。抑制CD300c的表达，从而有效激活体内的抗癌免疫反应，并且还可以通过抑制细胞增殖来有效地抑制癌症的生长和发展，可以有效地使用抑制CD300c表达和/或功能的材料来抑制各种癌症的增殖、复发、转移等。

提供本发明的以上描述仅出于示例性目的，并且本发明所属领域的普通技术人员应理解，在不脱离技术精神或其基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，本文描述的实施方案应仅在说明性意义上考虑，而不是出于限制的目的。

工业适用性

本发明的上述描述涉及存在于各种癌细胞表面上的CD300c蛋白的新用途，并且已经证实，通过抑制CD300c蛋白的表达或活性，可以增加T细胞的活性，并且癌细胞的增殖可以被抑制。因此，本发明的CD300c表达抑制剂或活性抑制剂不仅可以应用于各种癌症，而且还可以显著提高预防和/或治疗癌症的效果，并且因此有望应用于各种癌症治疗剂，并被广泛使用。

<110> 善萃科思生物科技公司

<120> 包含CD300C表达抑制剂或活性抑制剂的预防或治疗癌症的药物组合物

<130> MPO20-065CN

<150> KR 10-2018-0062620

<151> 2018-05-31

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<170> KoPatentIn 3.0

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人CD300c的细胞外结构域

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1 5 10 15

Gly Ser Leu Ser Val Gln Cys Arg Tyr Glu Lys Glu His Arg Thr Leu

20 25 30

Asn Lys Phe Trp Cys Arg Pro Pro Gln Ile Leu Arg Cys Asp Lys Ile

35 40 45

Val Glu Thr Lys Gly Ser Ala Gly Lys Arg Asn Gly Arg Val Ser Ile

50 55 60

Arg Asp Ser Pro Ala Asn Leu Ser Phe Thr Val Thr Leu Glu Asn Leu

65 70 75 80

Thr Glu Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Cys Gly Val Asp Thr Pro Trp

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Leu Arg Asp Phe His Asp Pro Ile Val Glu Val Glu Val Ser Val Phe

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Pro Ala Gly Thr Thr Thr Ala Ser Ser Pro Gln Ser Ser Met Gly Thr

115 120 125

Ser Gly Pro Pro Thr Lys Leu Pro Val His Thr Trp Pro Ser Val Thr

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Arg Lys Asp Ser Pro Glu Pro Ser Pro His Pro Gly Ser Leu Phe Ser

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人CD300c的细胞外结构域

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<213> 人工序列

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<223> CD300c-Fc

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Gly Ser Leu Ser Val Gln Cys Arg Tyr Glu Lys Glu His Arg Thr Leu

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