一种蜂王浆双歧杆菌粉的制备方法

摘要

提供一种能保持蜂王浆和双歧杆菌活性的蜂王浆双歧杆菌粉的制备方法，包括：1)将双歧杆菌冻干菌粉接种于MRS肉汤中，在37℃培养条件下MRS活化三次，得双歧杆菌菌悬液；2)配制浓度为10‑30％的多孔淀粉混悬液；3)将菌悬液和多孔淀粉混悬液按1:(0.6～1.2)质量比混合后离心处理，弃去上清液得双歧杆菌多孔淀粉菌泥；4)将鲜蜂王浆按1:1质量比与多孔淀粉混匀，密封放置6小时，得蜂王浆多孔淀粉泥；5)将双歧杆菌多孔淀粉菌泥按1:(1～3)和蜂王浆多孔淀粉泥混匀，得蜂王浆双歧杆菌泥；6)向蜂王浆双歧杆菌泥添加冻干保护剂，冻干，所用冻干保护剂的用量为蜂王浆双歧杆菌泥的1/3。

说明书

技术领域

本发明涉及蜂王浆双歧杆菌粉的制备方法，更具体地说，尤其涉及一种保持蜂王浆和双歧杆菌活性的蜂王浆双歧杆菌粉的制备方法。

背景技术

双歧杆菌(Bifidobacteria)是人体肠道中典型的益生菌，对人体有多项生理保健功能，如抑菌作用和营养作用。双歧杆菌在肠道中具有较高浓度水平时，能够抑制外侵的腐败菌如病原大肠埃希菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌或内源腐生菌。双歧杆菌能够在人体肠道内合成维生素B1、B2、B6和K，合成丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和苏氨酸，分泌多种酶类等，从而能够起到调理人体肠胃、提供人体必需的营养、抗衰老、抗肿瘤及提高免疫力作用。双歧杆菌在人体内的数量随年龄变化而呈动态变化，人体机体的衰老往往使人体肠道的双歧杆菌数量下降。环境污染、饮食改变、滥用抗生素等因素也会严重影响双歧杆菌数量。

双歧杆菌要对人体产生有益作用，首先它必需通过胃环境以大量的存活菌到达肠道并定植于肠粘膜上。但由于胃酸的杀菌作用，双歧杆菌的活菌数在此过程中也会大幅度下降(张丽君等，双歧联菌株微胶囊制剂的改进[J]，中国微生态学杂志，2001，13(004):208-209)。双歧杆菌专性厌氧，最适生长温度37～41℃，最低生长温度25～28℃，最高生长温度43～45℃，起始生长最适pH值6.5～7.0，pH值5.0以下或8.0以上不生长，酸性环境(pH≤5.5)对菌体存活不利(CN103932186A)。

开发双歧杆菌产品，通过外源摄入方式补充并增加双歧菌在人体肠道定植的数量，对于调整人体肠道微生态平衡，提高免疫力，提高人体的健康水平是很有意义的。

但双歧杆菌具有自身的生物特性，它们对营养条件要求较高，对氧极为敏感，专性厌氧，对低pH值环境的抵抗力差，酸性环境(pH≤5.5)对菌体存活不利，活性保持较困难等特点使得双歧杆菌的实际应用受到一定的限制。

蜂王浆又名蜂王乳、蜂皇浆等。蜂王浆具有复杂的化学成分。蛋白质在其干重中所占比例最高，还含有肽类、功能性脂肪酸如王浆酸、糖类、游离氨基酸、维生素、矿物质、蛋白酶等物质。蜂王浆具有增强机体免疫力、抗菌消炎、抗癌、抗辐射、抗疲劳、改善心血管疾病、延缓衰老等保健功能和疗效；蜂王浆不含中性脂肪，而且含有10种必需氨基酸，还含有12种非必需氨基酸，因此是人类滋补的良好食物。

蜂王浆稳定性差，容易受到光、热和其他化学物质的影响和破坏，暴露在空气中或日光照射时间长了，颜色变化较快，由白色变成淡黄，最后成褐色，发酵变质。这样给蜂王浆的保存带来很大的困难。蜂王浆在低温下性质稳定，在4℃贮存时，1个月不发生变质，在-18℃下冷冻保存时，可持续2年不变质，营养成分损失较少。研究表明，鲜王桨在常温下有很强的吸氧性，在-18℃时吸氧性几乎消失，这表明，蜂王浆须在低温条件下保存，有利于活性成分的保留。常温下、4℃、-20℃下储存的蜂王浆，结果表明：随着温度升高及贮存时间的延长，蜂王浆的稳定性渐渐变差，水溶性蛋白含量也逐渐下降；特别是其中含量较高且与其生理功效关系密切的蛋白质在储藏的过程中很容易发生变化，从而影响了蜂王浆生理功效的发挥并使其营养价值降低。。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种能够保持蜂王浆和双歧杆菌活性的蜂王浆双歧杆菌粉的制备方法，不需要特殊条件，无需低温，在常温下即可以实现保存的蜂王浆双歧杆菌粉。

根据本发明的一个方面，提供一种蜂王浆双歧杆菌粉的制备方法，包括下述步骤：

1)将双歧杆菌冻干菌粉接种于MRS肉汤中，在37℃培养条件下MRS活化三次，前两次以3体积％～5体积％的接种量转接，并在37℃的条件下培养22～24h，第三次按照2体积％～3体积％的接种量转接，并在37℃的条件下培养17-19h，得到双歧杆菌菌悬液；

2)配制浓度为10-30％，例如15-25％，特别是20％的水性多孔淀粉混悬液，110℃灭菌和离心除气处理后备用；

3)将步骤1)制备的菌悬液和步骤2)制备的多孔淀粉混悬液按照1:(0.6～1.2)的质量比例混合后进行离心处理，弃去上清液得双歧杆菌多孔淀粉菌泥；

4)将鲜蜂王浆按照1：(0.9-1.1)，特别是1:1的质量比例加入到多孔淀粉中，混匀，密封放置6小时，经巴氏灭菌法灭菌后得到蜂王浆多孔淀粉泥；

5)将步骤3)制备的双歧杆菌多孔淀粉菌泥按照1:(1～3)质量比例和步骤4)蜂王浆多孔淀粉泥充分混匀，得到蜂王浆双歧杆菌泥；

6)向步骤5)的蜂王浆双歧杆菌泥添加冻干保护剂，在真空度6Pa，冷冻温度-40℃条件下冻干，其中所用冻干保护剂与蜂王浆双歧杆菌泥的体积重量比为1/3mL/g。

根据本发明所述的方法，其中在步骤2)中的离心处理特别可为在5000-6000r/min(转/分)下离心10-30分钟。

根据本发明所述的方法，其中在步骤2)中的灭菌可以是在110℃下灭菌10-20分钟。

根据本发明所述的方法，其中在步骤4)中，利用巴氏灭菌法灭菌例如可在71.7度进行15秒，以避免影响蜂王浆的活性。

根据本发明所述的方法，例如可以如下进行步骤6)的冻干过程：将产品放入冷冻干燥机后，每半小时降温10度，降至-40度后，预冻2-5小时；真空度维持10-30pa下，按照半小时升温5-10度，逐渐升温至30度，进行冷冻干燥。

根据本发明，所述的冻干保护剂可由脱脂乳粉、甘油、低聚果糖、乳糖、胱氨酸、维生素C、水组成，其中，脱脂乳粉的浓度可为0.1-0.15g/mL，甘油的浓度可为0.01-0.015g/mL，低聚果糖的浓度可为0.02-0.025g/mL，乳糖的浓度可为0.01-0.015g/mL，胱氨酸的浓度可为0.001-0.0015g/mL，维生素C的浓度可为0.003-0.0035g/mL。

根据本发明的一个实施方式，所述的冻干保护剂可由脱脂乳粉100重量份、甘油10重量份、低聚果糖25重量份、乳糖12.5重量份、胱氨酸1重量份、维生素C 3重量份、水1000重量份组成，例如，所述的冻干保护剂是由脱脂乳粉100g、甘油10g、低聚果糖25g、乳糖12.5g、胱氨酸1g、维生素C3 g、水1000g组成。

根据本发明，所述的冻干保护剂中，胱氨酸、维生素C采用过滤除菌，其他成分采用在105℃灭菌30分钟。

根据本发明，多孔淀粉的用量限定在一定范围内，超出所限定的范围，则可能无法实现充分吸附或活性成分浓度过低的缺陷，如步骤1)制备的菌悬液和步骤2)制备的多孔淀粉混悬液按照1:(0.6～1.2)的质量比例混合，若超出此范围，如果多孔淀粉用量过少，则存在双歧杆菌不能完全或充分进入多孔淀粉的孔道中，多孔淀粉无法起到包埋保护作用，导致后期菌活性降低；如果多孔淀粉用量过多，则大大稀释了活性成分的浓度，降低成品中蜂王浆含量和双歧杆菌活菌数量；同样步骤4)中限定了鲜蜂王浆按照1:1的质量比例与多孔淀粉混合，以此比例即可以有效地实现对鲜蜂王浆的包埋隔绝作用，避免鲜蜂王浆与光线和氧气接触而被氧化。

多孔淀粉是利用物理、化学或是生物方法对原生淀粉进行改性而形成的一种新型淀粉。多孔淀粉相比较于普通原生淀粉，除了具备淀粉安全性高、可生物降解等特点外，由于它具有独特的中空结构特征，使得其在食品药品领域的应用范围更广泛。

多孔淀粉具有一种蜂窝状中空结构，直径约为1μm的微孔布满整个淀粉颗粒表面，并由表面向中心深入，形成三维网络状的类似海绵状结构。多孔淀粉结构中孔洞的容积约占整个颗粒体积约50％，因此多孔淀粉具有极高的比表面积和孔隙率，具有良好的吸附能力，能将很多物质牢固地吸附到孔的内腔里。

通过采用上述技术方案，多孔淀粉能够利用其内部孔道的吸附力，分别将双歧杆菌和蜂王浆吸附到淀粉结构内部，显著减少双歧杆菌、蜂王浆与外界氧气和光线的接触，对双歧杆菌、蜂王浆形成包埋保护作用，从而达到保持双歧杆菌活性、减缓蜂王浆氧化的作用。

双歧杆菌通过服用进入胃酸环境后，由于胃酸的低pH环境，导致双歧杆菌活菌数大幅度下降。通过采用上述技术方案，多孔淀粉在酸性环境下对双歧杆菌的包埋保护作用，有利于抵抗胃酸对双歧杆菌活性的影响，避免双歧杆菌活菌数大幅度下降，更多的活性双歧杆菌能够到达肠道，调整人体肠道微生态平衡。

蜂王浆和多孔淀粉以及双歧杆菌和多孔淀粉的共同作用，可以提高活性双歧杆菌和蜂王浆稳定性，从而真正起到提高人体免疫机能、改善代谢、增强人体健康的作用。

根据本发明的另一方面，提供了一种蜂王浆双歧杆菌粉，所述蜂王浆双歧杆菌粉由所述方法得到。

根据本发明的方法除冻干处理和灭菌外，其他步骤均可在常温下操作。根据本发明制备得到的蜂王浆双歧杆菌粉不易被氧化，在常温下密闭避光保存6个月以上，产品色泽没有明显变化，而且双歧杆菌活菌数目没有明显降低，因而和现有技术的低温储存相比提高了保存的温度，而且活性成分蜂王浆和双歧杆菌的活性和稳定性均不受明显影响。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

在以下实施例中，双歧杆菌冻干菌粉(两歧双歧杆菌)购自上海复祥生物科技有限公司，MRS肉汤购自青岛高科园海博生物技术有限公司，多孔淀粉购自辽宁立达生物科技有限公司(食品级)，鲜蜂王浆购自北京中蜜科技发展有限公司。除特殊说明外，实施例中所采用的原料、方法和设备均为本领域常规的原料、方法和设备。

实施例1

一种蜂王浆双歧杆菌粉的制备方法，包括下述步骤：

1)将双歧杆菌冻干菌粉接种于MRS肉汤中，在37℃培养条件下MRS活化三次，前两次以4％的接种量转接，并在37℃的条件下培养22h，第三次按照3％的接种量转接，并在37℃的条件下培养18h，得到双歧杆菌菌悬液；

2)用去离子水配制浓度为20％的多孔淀粉混悬液，110℃灭菌15分钟和离心除气处理后备用；

3)将步骤1)制备的菌悬液和步骤2)制备的多孔淀粉混悬液按照1:0.6的质量比例混合后6000r/min下离心处理20分钟，弃去上清液得双歧杆菌多孔淀粉菌泥；

4)将鲜蜂王浆按照1:1的质量比例加入到多孔淀粉中，混匀，密封放置6小时，经巴氏灭菌法在71.7度灭菌15秒后得到蜂王浆多孔淀粉泥；

5)将步骤3)制备的双歧杆菌多孔淀粉菌泥按照1:2质量比例和步骤4)蜂王浆多孔淀粉泥充分混匀，得到蜂王浆双歧杆菌泥；

6)向步骤5)的蜂王浆双歧杆菌泥添加冻干保护剂，在真空度6Pa，冷冻温度-40℃条件下冻干，得到蜂王浆双歧杆菌粉，其中所用冻干保护剂的用量为蜂王浆双歧杆菌泥的1/3(体积重量比，mL/g)。所述的冻干保护剂是由脱脂乳粉100g、甘油10g、低聚果糖25g、乳糖12.5g、胱氨酸1g、维生素C3g、水1000g组成。其中胱氨酸、维生素C采用过滤除菌，其他成分采用在105℃灭菌30分钟。

实施例2

1)将双歧杆菌冻干菌粉接种于MRS肉汤中，在37℃培养条件下MRS活化三次，前两次以3％的接种量转接，并在37℃的条件下培养24h，第三次按照2％的接种量转接，并在37℃的条件下培养18h，得到双歧杆菌菌悬液；

2)用去离子水配制浓度为20％的多孔淀粉混悬液，110℃灭菌15分钟和离心除气处理后备用；

3)将步骤1)制备的菌悬液和步骤2)制备的多孔淀粉混悬液按照1:1.2的质量比例混合后6000r/min下离心处理20分钟，弃去上清液得双歧杆菌多孔淀粉菌泥；

4)将鲜蜂王浆按照1:1的质量比例加入到多孔淀粉中，混匀，密封放置6小时，经巴氏灭菌法在71.7度灭菌15秒后得到蜂王浆多孔淀粉

5)将步骤3)制备的双歧杆菌多孔淀粉菌泥按照1:3质量比例和步骤4)蜂王浆多孔淀粉泥充分混匀，得到蜂王浆双歧杆菌泥；

6)向步骤5)的蜂王浆双歧杆菌泥添加冻干保护剂，在真空度6Pa，冷冻温度-40℃条件下冻干，得到蜂王浆双歧杆菌粉，其中冻干保护剂的用量为蜂王浆双歧杆菌泥的1/3(体积重量比，mL/g)。所述的冻干保护剂是由脱脂乳粉100g、甘油10g、低聚果糖25g、乳糖12.5g、胱氨酸1g、维生素C3g、水1000g组成。其中胱氨酸、维生素C采用过滤除菌，其他成分采用在105℃灭菌30分钟。充分混合后在真空度6Pa冷冻温度-40℃，冻干时间为9小时的条件下冻干，得到蜂王浆双歧杆菌粉。

实施例3

1)将双歧杆菌冻干菌粉接种于MRS肉汤中，在37℃培养条件下MRS活化三次，前两次以5％的接种量转接，并在37℃的条件下培养24h，第三次按照2％的接种量转接，并在37℃的条件下培养18h，得到双歧杆菌菌悬液；

2)用去离子水配制浓度为25％的多孔淀粉混悬液，110℃灭菌15分钟和离心除气处理后备用；

3)将步骤1)制备的菌悬液和步骤2)制备的多孔淀粉混悬液按照1:1的质量比例混合后6000r/min下离心处理20分钟，弃去上清液得双歧杆菌多孔淀粉菌泥；

4)将鲜蜂王浆按照1:1的质量比例加入到多孔淀粉中，混匀，密封放置6小时，经巴氏灭菌法在71.7度灭菌15秒后得到蜂王浆多孔淀粉

5)将步骤3)制备的双歧杆菌多孔淀粉菌泥按照1:1质量比例和步骤4)蜂王浆多孔淀粉泥充分混匀，得到蜂王浆双歧杆菌泥；

6)向步骤5)的蜂王浆双歧杆菌泥添加冻干保护剂，在真空度6Pa，冷冻温度-40℃条件下冻干，得到蜂王浆双歧杆菌粉，其中所用冻干保护剂的用量为蜂王浆双歧杆菌泥的1/3(体积重量比，mL/g)。所述的冻干保护剂是由脱脂乳粉100g、甘油10g、低聚果糖25g、乳糖12.5g、胱氨酸1g、维生素C3g、水1000g组成。其中胱氨酸、维生素C采用过滤除菌，其他成分采用在105℃灭菌30分钟。充分混合后在真空度6Pa冷冻温度-40℃，冻干时间为9小时的条件下冻干，得到蜂王浆双歧杆菌粉。

实施例4

1)将双歧杆菌冻干菌粉接种于MRS肉汤中，在37℃培养条件下MRS活化三次，前两次以4％的接种量转接，并在37℃的条件下培养24h，第三次按照3％的接种量转接，并在37℃的条件下培养18h，得到双歧杆菌菌悬液；

2)用去离子水配制浓度为15％的多孔淀粉混悬液，110℃灭菌15分钟和离心除气处理后备用；

3)将步骤1)制备的菌悬液和步骤2)制备的多孔淀粉混悬液按照1:2的质量比例混合后6000r/min下离心处理20分钟，弃去上清液得双歧杆菌多孔淀粉菌泥；

4)将鲜蜂王浆按照1:1的质量比例加入到多孔淀粉中，混匀，密封放置6小时，经巴氏灭菌法在71.7度灭菌15秒后得到蜂王浆多孔淀粉

5)将步骤3)制备的双歧杆菌多孔淀粉菌泥按照1:2质量比例和步骤4)蜂王浆多孔淀粉泥充分混匀，得到蜂王浆双歧杆菌泥；

6)向步骤5)的蜂王浆双歧杆菌泥添加冻干保护剂，在真空度6Pa，冷冻温度-40℃条件下冻干，得到蜂王浆双歧杆菌粉，其中所用冻干保护剂的用量为蜂王浆双歧杆菌泥的1/3(体积重量比，mL/g)。所述的冻干保护剂是由脱脂乳粉100g、甘油10g、低聚果糖25g、乳糖12.5g、胱氨酸1g、维生素C 3g、水1000g组成。其中胱氨酸、维生素C采用过滤除菌，其他成分采用在105℃灭菌30分钟。充分混合后在真空度6Pa冷冻温度-40℃，冻干时间为9小时的条件下冻干，得到蜂王浆双歧杆菌粉。

活菌数测定：无菌称取1.0g样品，加入到9.0ml稀释液(Mitsuoka's缓冲液(6.0gNa2HPO，4.5g KH2PO，0.5g L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g吐温80，1000mL蒸馏水))中，充分摇匀，4000r/min离心10分钟，取上清液5.0ml，作10倍系列稀释，取合适的稀释度溶液100μl，滴入活菌计数平板，共做3个板，并以L型棒涂布均匀，于36-38度厌氧培养48小时，观察每个平板菌落生长情况，并计数。

实施例1中，0时蜂王浆双歧杆菌粉的活菌数是9.68×10

与现有技术相比，比如市购可得的冻干蜂王浆软胶囊、冻干蜂王浆散等，这些产品都需要在冷藏或者2-10度条件下保存，如蜂王浆在4℃贮存时，1个月不发生变质，根据本发明方法制备的蜂王浆双歧杆菌粉可在常温下保存一定时间不变质。根据以上实施例1至4制备的蜂王浆双歧杆菌粉在常温下密闭避光保存6个月以上，产品色泽没有明显变化，而且双歧杆菌活菌数目没有明显降低，表明在高于冷冻粉的温度甚至在常温下即可保存，提高了保存的温度，而且保存时限可能会延长以及活性成分蜂王浆和双歧杆菌的活性和稳定性均不受明显影响。

本发明并不局限于上述实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员在权利要求的范围内所作出的任何改变和调整也应认为属于本发明的范围。