技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种rhGH中和抗体的检测方法。
背景技术
重组人生长激素(Recombinant Human Growth Hormone，rhGH)的氨基酸含量、空间构象及序列与人生长激素完全相同，具有与人体内源性生长激素等同的生物学作用：刺激骨骺端软骨细胞分化、增殖，刺激软骨基质细胞增长，刺激成骨细胞分化、增殖，引起线性生长加速及骨骼变宽；促进全身蛋白质合成，纠正手术等创伤后的负氮平衡状态，纠正重度感染及肝硬化等所致低蛋白血症；刺激免疫球蛋白合成，刺激淋巴样组织、巨噬细胞和淋巴细胞的增殖，增强抗感染能力；刺激烧伤创面及手术切口胶原体细胞合成纤维细胞以及巨噬细胞分裂增殖，加速伤口愈合；促进心肌蛋白质合成，增加心肌收缩力，降低心肌耗氧量，调节脂肪代谢，降低血清胆固醇、低密度脂蛋白的水平；补充生长激素分泌不足或缺乏，调节成人的脂肪代谢、骨代谢、心肾功能。
随着对生物药物免疫原性的检测越来越重视，给药过程中产生的中和抗体的检测也成为药物开发阶段的重要关注点。中和抗体能够通过直接与药物作用结合位点结合，或者通过空间位阻的作用使药物失去与其靶点结合的能力，从而阻断、中和药物的治疗活性。因此，在药物开发过程中(包括临床前研究和临床试验阶段)，对中和抗体的检测和评价已经成为药品监管部门的常规要求，由于细胞学检测方法更能接近体内的药物作用情况。与其他免疫原性检测方法相比(如Elisa方法)，基于细胞的检测方法所用细胞的表面受体呈自然状态，更能模拟体内药物与受体结合的过程，所以中和抗体的检测方法FDA推荐使用细胞学方法(FDA,Guidance for Industry:Immunogenicity Testing of TherapeuticProtein Products—Developing and Validating Assays for Anti-Drug AntibodyDetection.2019)。
基于细胞学检测中和抗体的方法，由于细胞引入的不确定因素较多，一直以来都存在灵敏度低的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种稳定的基于细胞学的rhGH抗体中和活性测定方法。该方法灵敏度高，能检测出人血清中较低浓度的rhGH中和抗体。抗血清干扰能力强，药物耐受水平也比较高，可应用于rhGH药物受试者群体。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种rhGH中和抗体的检测方法，包括以下步骤：
步骤1：将样品置于50～60℃条件下灭活30～35分钟；样品包括待检血清样品、阴性对照样品、阳性对照样品；
步骤2：将灭活后的样品与rhGH工作液混合，在37℃、5％CO
步骤3：将细胞悬液与中和后的样品混合，在37℃、5％CO
步骤4：将细胞显色液与培养后的细胞混合，室温下避光静置；
步骤5：采用荧光细胞活性检测系统检测活细胞数目，得到待检血清样品的抑制率，判断待检血清样品中是否存在rhGH中和抗体。
本发明基于体外细胞活性测定方法，选择的细胞为稳转GH受体的Baf3细胞系，该细胞高度依赖rhGH生长。rhGH与细胞表面表达的rhGH受体结合，活化酪氨酸激酶JAK5，JAK5激活后催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位点”(docking site)，同时STAT5蛋白被招募到这个“停泊位点”。最后，激酶JAK5催化结合在受体上的STAT5蛋白发生磷酸化修饰，活化的STAT5蛋白以二聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合，调控基因的转录，促进细胞的增殖。如果有中和抗体存在的情况下，rhGH与中和抗体结合，无法与细胞表明受体结合，则无促进细胞增殖作用。本方法采用血清灭活的方式将灵敏度提高到0.25μg/mL，美国药典对中和抗体检测灵敏度的要求为0.5～2μg/mL(USP，1106.1IMMUNOGENICITY ASSAYS—DESIGN AND VALIDATION OFASSAYS TO DETECT ANTI-DRUG NEUTRALIZING ANTIBODY)，可见，本发明灵敏度高于美国药典要求。
作为优选，待检血清样品为采血后于≤-60℃冰箱中储存至少12小时的血清；
作为优选，阴性对照样品为至少5个批次未接受rhGH药物治疗的正常人血清的混合血清；
作为优选，阳性对照样品为rhGH抗体与阴性对照样品的混合物，浓度不小于250ng/mL。
作为优选，阳性对照样品包括高质控阳性对照样品和低质控阳性对照样品；
作为优选，高质控阳性对照样品的浓度为3000～5000ng/mL，低质控阳性对照样品的浓度为250～2500ng/mL。
在本发明提供的具体实施例中，高质控阳性对照样品的浓度为4000ng/mL，低质控阳性对照样品的浓度为1000ng/mL。
在本发明提供的具体实施例中，灭活的温度为56℃。
作为优选，步骤2中，rhGH工作液为采用分析培养基稀释的rhGH溶液，rhGH工作液中rhGH的浓度为2～6ng/mL，灭活后的样品与rhGH工作液的体积比为1:(5～15)。
在本发明提供的具体实施例中，步骤2中，rhGH工作液中rhGH的浓度为4ng/mL，灭活后的样品与rhGH工作液的体积比为1:9。
作为优选，分析培养基为含有1％～5％FBS和0.5％～1.5％双抗的1640基础培养基。
在本发明提供的具体实施例中，分析培养基为含有3％FBS和1％双抗的1640基础培养基。
作为优选，步骤2中，孵育的时间为2小时±10分钟，孵育的温度为20～30℃。
作为优选，步骤3中，细胞悬液的密度为(1～10)×10
在本发明提供的具体实施例中，步骤3中细胞悬液的密度为2×10
作为优选，步骤3中，细胞悬液与中和后的样品的体积比为(1～3):1。
在本发明提供的具体实施例中，步骤3中，细胞悬液与中和后的样品的体积比为2:1。
作为优选，细胞培养的时间为45～50h。
在本发明提供的具体实施例中，细胞培养的时间为48h。
作为优选，步骤4中，避光静置的时间为5～15分钟。
在本发明提供的具体实施例中，步骤4中，避光静置的时间为10分钟。
在本发明中，步骤5中，待检血清样品的抑制率不小于低质控阳性对照样品的抑制率，则判断待检血清样品中存在rhGH中和抗体。
本发明提供了一种rhGH中和抗体的检测方法。该检测方法包括以下步骤：将样品置于50～60℃条件下灭活30～35分钟；样品包括待检血清样品、阴性对照样品、阳性对照样品；将灭活后的样品与rhGH工作液混合，在37℃、5％CO
本发明方法采用CellTiter-Glo试剂进行最终的细胞活力检测。ATP腺嘌呤核苷三磷酸(简称三磷酸腺苷)参与生物体内多种酶促反应，是活细胞新陈代谢的一个指标，其含量直接反应了细胞的数量及细胞状态。实验过程中向细胞培养基加入等体积CellTiter-Glo试剂，测量发光值，在光信号和体系中，发光值与ATP量成正比，而ATP又和活细胞数正相关，因此可通过检测ATP含量得细胞活力。同传统的细胞活力检测试剂MTT、CCK8法相比，CellTiter-Glo发光活细胞检测系统的检测试剂具有最高灵敏度和较长的信号持续时间。血清基质的干扰一直是细胞学中和抗体检测方法的重要影响因素，本方法采用血清灭活的方式消除了这种基质干扰，将方法灵敏度提高至0.25μg/mL，并且一定程度增加了方法的药物耐受能力。
具体实施方式
本发明公开了一种rhGH中和抗体的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种基于细胞学的rhGH中和抗体检测方法包括以下步骤：
分析培养基的配制；
样品准备：所有的样品均为复孔(n＝2)，一个分析批至少包括3套阴性对照样品(NC)、3套阳性对照样品(高质控和低质控)；
样品灭活：将样品置于56℃水浴锅中，灭活30～35分钟；
样品孵育：向96孔浅孔稀释板中加入20μL/孔的样品(空白对照组加入阴性对照样品)，然后加入180μL/孔的rhGH工作液，震荡混合均匀，于37℃、5％CO
细胞处理：收集细胞，弃去上清液，加入适当分析培养基，重悬细胞，洗涤3次；用血球计数板对细胞计数，并加入一定量的基础培养基，将细胞调整至2×10
上样：往96孔板中加入100μL/孔的细胞液，然后加入50μL/孔样品，混合均匀；
细胞培养：将96孔板置于37℃、5％CO
显色：加入60μL/孔的显色液加入至细胞中，震荡混匀，室温下避光静置后检测；
检测：于luminescence条件下，全波长读取数据，保存数据至合适的位置。
结果分析：抑制率接近阴性对照的判断为阴性，大于LQC抑制率的判断为阳性。
本发明提供的rhGH中和抗体的检测方法中的应用中所用试剂、仪器等均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1.分析培养基的制备：1640基础培养基中加入3％的FBS和1％的双抗；
2.样品准备：所有的样品均为复孔(n＝2)。一个分析批至少包括3套阴性对照样品(NC)、3套阳性对照样品(高质控和低质控)。
2.1个体血清的准备：需要提前采集个体血清用于样品检测，取得个体血清后需要于≤-60℃冰箱中储存至少12小时后使用。
2.2阴性对照：至少5个批次未接受rhGH药物治疗的正常人血清混合制得(混合基质)；
2.3阳性对照：阳性对照样品采用阳性对照抗体配制于混合基质中制得，浓度分别为4000ng/mL(高质控，HQC)和1000ng/mL(低质控，LQC)。
2.4.样品灭活：将所有实验需要的样品置于56℃水浴锅中，灭活30～35分钟；
3.样品孵育：向96孔浅孔稀释板中加入20μL/孔的样品(空白对照组加入阴性对照样品)，然后加入180μL/孔的rhGH工作液(分析培养基稀释的4ng/mL rhGH)，震荡混合均匀，于37℃、5％CO
4.细胞处理：用移液管吹打混匀细胞，将细胞转移至离心管中，900rpm室温离心6分钟。弃去上清液，加入适当分析培养基，重悬细胞，900rpm室温离心6分钟。总共洗涤3次。用血球计数板对细胞计数，并加入一定量的分析培养基，将细胞调整至2×10
5.上样：往96孔板中加入100μL/孔的细胞液，然后加入50μL/孔样品，混合均匀；
6.细胞培养：将96孔板置于37℃、5％CO
7.显色：将Cell Titer Glo显色液以60μL/孔加入至细胞中，900rpm震荡混匀2分钟，室温下避光静置10分钟后检测；
8.检测：于luminescence条件下，全波长读取数据，保存数据至合适的位置；
9.结果分析：抑制率接近阴性对照的判断为阴性，大于LQC抑制率的判断为阳性。
试验例1：
灵敏度实验(以某rhGH中和抗体的两次实验结果为例)
表1
表2
上述实验结果表明，本发明在rhGH中和抗体浓度为0.25μg/mL时仍然有较明显抑制率，且测定结果的变异系数(CV)不高于20％，满足药监部门要求(FDA,Guidance forIndustry:Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products—Developingand Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection.2019)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
机译： AAV中和抗体检测方法
机译： AAV中和抗体检测方法
机译： 血清中针对重组人胰岛素的中和抗体的检测方法
