注射用rhGH蛋白含量测定和HCP检测方法学建立及应用

摘要

生长激素（Human Growth Hormone，hGH）是一种肽类激素，其主要生理作用是促进机体蛋白质的合成。但这种天然生长激素来源于垂体提取，价格昂贵，也不易获得，限制了其临床应用。重组人生长激素（Recombinant Human Growth Hormone，rhGH）是以大肠杆菌表达的细胞因子类生物重组制品。在纯化过程中，大肠杆菌的宿主蛋白（Host Cell Protein，HCP）残留是衡量重组制品纯度的关键问题。精细纯化过程能够有效去除 HCP残留量，但在纯化过程中能够精准定量 HCP残留量的检测方法成为了目前企业和学者们的瓶颈问题。
　　本研究旨在建立rhGH原液中HCP残留量及蛋白含量检测方法并进行方法学验证。并将HCP残留量与蛋白含量两种检测方法相结合，共同应用于rhGH原液纯化工艺生产中，并对每一步纯化工艺进行HCP残留量质控。检测HCP残留量的方法学建立主要通过比较直线回归拟合与三次样条曲线拟合分析方法，对比是否采用封闭液封闭，对比四种稀释液检测效果，利用正交试验设计对实验条件进行多因素筛选，对重建的HCP残留量检测方法进行方法学验证；采用药典方法对rhGH原液蛋白含量进行检测，并对检测方法进行方法学验证；按照建立的两种方法检测rhGH原液原有纯化工艺每一步纯化产物的HCP残留量及蛋白含量，根据检测结果进行指导并优化纯化工艺，以每毫克rhGH原液中含有HCP残留量的浓度作为标准，在新旧纯化工艺生产中，比较HCP残留量改善情况。 比较结果显示，选取三次样条曲线拟合对数据进行分析，不采用封闭液封闭，选用pH6.0柠檬酸缓冲液作为样品稀释液，正交试验设计筛选结果显示，最佳实验条件为24℃、600rpm/min、孵育170min，经过方法学验证后，各验证项目均符合相关规定；rhGH原液蛋白含量方法学验证结果显示，各检验项目均符合相关规定；优化后的纯化工艺能够使HCP残留量由优化前的13-16ng/mg减低到2ng/mg，使纯化产物符合药典要求（＜10ng/mg)。建立了重组人生长激素原液中 HCP残留量及蛋白含量的检测方法，并对两种检测方法进行了方法学验证。对每一步纯化环节，控制重组人生长激素原液含有HCP残留量具有重要的指导意义，为重组人生长激素的生产和研究奠定了基础。

目录

英文缩写符号Abbreviation symbols

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 课题的研究背景

1.3 HCP检测方法的比较

1.4 蛋白含量检测方法的比较

1.5 方法学验证

1.6 研究内容及技术路线

第二章 HCP残留量的方法建立及方法学验证

2.1实验材料

2.2 实验样品

2.3实验溶液

2.4实验内容

2.5 实验结果

2.6 结果讨论

第三章rhGH蛋白含量检测的方法学验证

3.1 实验材料

3.2 实验样品

3.3 判定标准

3.4 测定方法

3.5 方法学验证

3.6实验结果

3.7结果讨论

第四章 方法学的应用

4.1 实验材料

4.2 重组人生长激素的纯化

4.3 rhGH纯化产物的检定结果

4.4 结果讨论

结论

参考文献

致谢