牛病毒性腹泻病毒BVDV-BJ175170及其应用

摘要

本发明提供牛病毒性腹泻病毒BVDV‑BJ175170及其应用。BVDV‑BJ175170保藏号为CGMCC NO.18339。通过克隆表达其Erns蛋白，用于BVDV的ELISA检测及试剂盒的制备。本发明试剂盒便于操作、成本低、重复性好，利用该试剂盒可检测出血清稀释度达1:6400的病毒性腹泻病毒抗体，弥补了目前缺乏单一抗原对BVDV‑PI牛诊断的不足，该试剂盒具有较高的敏感度，降低了漏检率，且精密度也更高，可用于抗体水平监测。本方法结合了抗原抗体的高特异性反应，能够更准确地检测出血清中的Erns蛋白抗体，为我国BVDV流行病学调查提供了敏感的检测手段，可用于牛病毒性腹泻病毒感染的早期诊断。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及牛病毒性腹泻病毒BVDV-BJ175170及其应用。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV)，又称为牛病毒性腹泻-黏膜病毒，其感染牛可呈现多种临床症状,如咳嗽、发热、腹泻、黏膜溃疡或糜烂等，感染牛表现白细胞减少、持续感染、免疫抑制与耐受，对怀孕母牛流产、产畸形胎或死胎等。自1946年lafson等首次在美国纽约州发现该病以来，已在世界范围内广泛流行，不仅感染牛，也能感染山羊、绵羊、鹿等反刍动物给世界各国畜牧业造成了严重的经济损失。流行病调查结果表明北京地区BVDV呈现广泛感染的态势，持续性感染牛是造成广泛感染的主要原因，同时，流行毒株的基因差异性较大，为该病的防控带来很大的挑战。世界动物卫生组织将其列为发病必须上报的动物传染病之一，加强对BVDV的监测，淘汰阳性感染牛，做好种群进化，势在必行。

随着我国牛业和奶牛业养殖量的不断增加，饲养方式向规模化和集约化等现代养殖模式的转变，BVDV感染率不断升高，很有必要加强对BVDV的防控工作。但由于我国对BVDV的研究起步较晚，对BVDV认识及危害的重视程度不足，也没有系统开展全国范围的BVDV分子流行病学调查，对BVDV流行规律和主要流行基因型或基因亚型缺乏相关研究数据；同时，BVDV属于RNA病毒，极易发生基因变异，用传统的标准毒株制备检测试剂盒和疫苗难以应对现有的所有临床毒株。另一方面，目前国外进口的BVDV检测试剂盒价格昂贵，而国内尚无自主研发的商品化BVDV抗体检测试剂盒，难以实现对规模化牛场的大规模牛群流行病学筛查和种群净化。

目前应用市售IDEXX牛病毒性腹泻病毒抗体检测试剂盒购买货期较长且价格昂贵；其他利用重组蛋白作为包被抗原的多采用E2蛋白，E2蛋白虽然是刺激动物机体产生抗体的最主要蛋白，但其保守性较低，蛋白容易产生变异，对于BVDV流行区域病毒发生变异而检测不出抗体。因此，亟待开发适合于目前BVDV流行毒株的检测试剂及试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供牛病毒性腹泻病毒BVDV-BJ175170及其应用。

为了实现本发明目的，发明人在本地区流行病学筛查的基础上，分离出BVDV临床毒株，进一步研制出一种能够应用于实际生产中的BVDV抗体检测试剂盒，而其中关键的一步是制备BVDV E

第一方面，本发明提供一种牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus)BVDV-BJ175170，保藏号为CGMCC NO.18339。

第二方面，本发明提供一种分离的BVDV病毒核酸分子，包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或由其组成。

第三方面，本发明提供一种分离的蛋白(E

i)来自所述牛病毒性腹泻病毒BJ175170如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

本发明还提供编码所述E

第四方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

第五方面，本发明提供所述牛病毒性腹泻病毒BJ175170的以下任一应用：

1)用于制备治疗或预防BVDV和/或CSFV(猪瘟病毒)感染以及由其感染所致相关疾病的疫苗或药物；

2)用于制备BVDV和/或CSFV检测试剂；

3)用作疫苗载体。

第六方面，本发明提供所述E

(1)用于制备治疗或预防BVDV和/或CSFV感染以及由其感染所致相关疾病的疫苗或药物；

(2)用于制备BVDV和/或CSFV感染检测试剂或试剂盒；

(3)用于非诊断目的BVDV和/或CSFV的检测；

(4)用于BVDV和/或CSFV的ELISA检测。

第七方面，本发明提供一种组合物，其包含所述E

第八方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含上述组合物。

第九方面，本发明提供一种BVDV和/或CSFV感染检测试剂或试剂盒，有效成分为所述E

第十方面，本发明提供一种牛病毒性腹泻病毒亚单位疫苗，有效成分为所述E

所述亚单位疫苗是由牛病毒性腹泻病毒E

在本发明的一个具体实施方式中，所述乳化剂为MF59。MF59是由4.3％角鲨烯、5％Tween-80和5％Span-85，按比例溶于10nM柠檬酸钠缓冲液中，超声乳化而成。

第十一方面，本发明提供以所述牛病毒性腹泻病毒毒株BJ175170、所述E

本发明人于2017-2019年间调查了北京周边的牛场，采集和检测了临床样品1,000余份，用间接ELISA方法对随机选取的2,000份样本进行了抗原检测，用进口商品化抗原捕获ELISA和RT-PCR方法对病毒抗原进行了检测，结果检测出1份抗原阳性样品。

用细胞培养法对阳性样本进行病毒分离，用免疫荧光技术对阳性样品进行鉴定，以确定分离到的临床毒株为BVDV。同时对分离到的毒株5’-UTR和N

参照NCBI中NADL Accession Number M31182.1 1196-1876中基因序列设计特异性引物对BVDV临床毒株BJ175170株RNA反转录产物进行扩增，扩增产物纯化后，连接T载体，连接产物转入感受态细胞中，获得含有阳性表达质粒的重组子。

在本发明的一个具体实施方式中，以提取的NADL毒株RNA作为模板进行反转录，反转录产物为模板扩增出E

本发明中原核表达的重组E

本发明提供的检测牛病毒性腹泻病毒抗体ELISA试剂盒还含有包被液、酶标二抗、封闭液等；所述可读性载体上记载了利用所述抗原蛋白溶液和所述酶标二抗检测的ELISA方法。

酶标二抗的稀释度为1:20000，作用时间1h。封闭液为5％的BSA。所述试剂盒的底物显色条件为加入TMB底物显色，37℃，显色时间10min。试验有效性判定：阴性平均OD值(即OD

S/P＝(OD

其中，阴性对照、阳性对照分别为已鉴定为BVDV抗体阴性、阳性的牛血清。

样品中牛病毒性腹泻病毒是否存在由S/P值决定。阴性S/P<0.20，可疑0.20≤S/P≤0.30，阳性S/P≥0.30。

本发明诱导表达的E

附图说明

图1为本发明较佳实施例中BVDV 5’-UTR与N

图2为本发明较佳实施例中BVDV临床分离株对MDBK细胞形态的影响。其中，A：攻毒组(临床分离株)；B：攻毒组(NADL株)；C：对照组。

图3为本发明较佳实施例中间接免疫荧光检测临床分离株侵染MDBK细胞情况。

图4为本发明较佳实施例中构建的BVDV临床分离株5’-UTR基因序列进化树。

图5为本发明较佳实施例中白细胞总数计数结果。

图6为本发明较佳实施例中抗体效价变化。

图7为本发明较佳实施例中BVDV临床分离株对兔肺脏、脾脏、肝脏、圆小囊、心脏、淋巴结、肾脏的影响(HE染色，200×，400×)。其中，A：病理组织学损伤图片；B：病理损伤评分。

图8为本发明较佳实施例中BVDV BJ175170E

图9为本发明较佳实施例中重组表达质粒双酶切的鉴定结果。其中，M：DNAMarker，1-2：目的基因酶切条带。

图10为本发明较佳实施例中重组蛋白表达SDS-PAGE图。其中，M：蛋白Marker，1：E

图11为本发明较佳实施例中E

图12为本发明较佳实施例中免疫时间和样品采集时间流程图。免疫三次，时间分别为0d、7d、14d。采血时间分别为0d、7d、14d、21d。组织样品收集时间为35d。

图13为本发明较佳实施例中抗体效价变化。其中，*和***表示不同处理组之间的差异具有统计学意义，*表示P<0.05，***表示P<0.001。

图14为本发明较佳实施例中接种BVDV BJ1305和BJ175170肠道、肺脏、肝脏和脾脏的病理组织学变化。

图15为本发明BVDV-BJ175170病毒粒子电镜图。BVDV病毒粒子有囊膜，直径大小在30-100nm之间。

图16为本发明较佳实施例中牛病毒性腹泻病毒灭活疫苗接种兔子后抗体效价测定结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 BVDV临床株分离鉴定及致病力研究

1、样品来源

2017年11月采自北京某牛场疑似BVDV发病牛血液样品，低温离心后收集血清。

2、样品BVDV抗原ELISA试剂盒检测

①在检测板前4个反应孔中加入50μL检测缓冲液。

②按照阴性对照、阳性对照、待测血清样品(编号175170)上样50μL。

③振荡器震动混合检测板中缓冲液与待测样品，37℃孵育2h。

④弃掉检测板中液体，加入300μL稀释好的Wash Solution润洗5次。

⑤加入100μL酶标抗体，常温放置30min，润洗5次。

⑥加入100μL TMB底物溶液，暗室常温孵育10min，加入终止液终止反应，450nm单波长下记录样品及对照组波长。

⑦检测结果OD

3、病毒RNA提取

①取200μL编号175170的血清样品与400μL裂解液VLB(北京艾德莱生物科技有限公司，货号RN27)混合后涡旋震动，常温静置10min，期间每隔5min在旋涡震动仪上涡旋震动混匀15s。

②加入450μL无水乙醇，立即在旋涡震动仪上混匀。

③将上述混合物分两次吸至吸附柱中，每次13000rpm离心1min，弃废液。

④加入500μL脱蛋白洗液RE，13000rpm离心1min、弃废液。

⑤加入500μL漂洗液RW，13000rpm离心1次并弃废液。

⑥空吸附柱13000rpm离心2min，充分除去漂洗液RW。

⑦吸附柱放入新离心管，在膜中央缓慢加入20μL溶液EB，静置2min后重复离心步骤，将离心管中所收集到的溶液再次加入到膜中央，重复操作1次。

4、RNA浓度和纯度测定

使用NanoDrop检测仪检测RNA浓度及纯度。运行NanoDrop软件，检测前取1μL DEPCH

5、BVDV 5’-UTR和N

按照如下反应体系和程序RT-PCR扩增病毒cDNA。反应体系：1μg样品RNA，2μLOligo(dT)，9.5μL DEPC H

经查询GenBank，使用APE软件设计BVDV 5’-UTR基因引物F5、R5和N

表1 BVDV 5’-UTR基因和N

按DEPC H

6、PCR反应产物鉴定

1)配制30mL 1％琼脂糖凝胶溶液，加入5μLI型核酸染色剂。

2)将25mL规格胶板放入胶槽中，插上胶梳，倒入配好的琼脂糖凝胶溶液，待其冷却、固定、拔梳。

3)在对应孔槽中加入10μL PCR产物和10μL DL2000 Marker。

4)以140V恒压电泳45min后关闭电源，在凝胶成像系统中分析条带大小，并保存图片，剩余PCR产物测序。

7、生物型鉴定

1)融化MDBK细胞，转移至15mL离心管并加入10mL 10％完全培养基后在1000rpm，25℃离心10min，弃上清。

2)加入1mL 10％完全培养基，充分悬浮细胞沉淀并吸至细胞培养瓶中，再加入4mL培养基，水平摇动细胞瓶，使细胞均匀铺在瓶底，于37℃，5％CO

3)当细胞长满约80％-90％且状态良好时进行细胞传代。弃掉细胞培养基并用1mL无菌PBS润洗1次，再加入1mL 25％胰酶，水平晃动细胞瓶，适当吹打，帮助细胞消化。

4)荧光倒置显微镜下观察到细胞消化完全后，加入5mL 10％完全培养基停止消化；将细胞吸至15mL离心管，离心，弃上清。

5)加入2mL 10％完全培养基悬浮细胞，混匀，各吸取1mL细胞悬液至两个25cm

6)将检测结果为阳性的血清样品经0.45μM滤器滤过除菌，接种至铺满MDBK细胞的细胞培养瓶中，并按同样方法分别接种CP生物型BVDV NADL毒株和培养基，设为攻毒组(NADL)和对照组。在细胞培养箱中培养。每天镜下观察MDBK细胞状态以确定临床分离株生物型。

8、病毒TCID

1)将BVDV临床分离株接种铺满单层的MDBK细胞，培养并连续传代5次，收集第5代病毒，用培养基作10

2)取出事先准备好的长满96孔板的MDBK细胞，吸去其中培养基后各孔再加入100μL培养基，去除残留血清。

3)将病毒与稀释液混匀后接种至96孔板中。每个稀释梯度按每孔100μL上样，共8个孔，并设置两排不接种病毒的细胞作为对照，细胞培养箱培养18h。

4)回收病毒，用预冷甲醇固定细胞15min，需将96孔板放置在冰上操作。弃掉固定液，每孔加入100μL PBS重复洗涤3次。

5)每孔加入100μL按1:100稀释鼠源BVDV E2蛋白单抗，37℃孵育1h，回收抗体并每孔加入100μL PBS重复洗涤3次。

6)每孔加入100μL按1:500稀释的cy3标记的山羊抗小鼠荧光二抗，37℃孵育1h后重复洗涤步骤3次。

7)试验完毕后将96孔板放在荧光显微镜观察，记录能够计数的最大稀释倍数的荧光孔数量，利用karber公式计算TCID

9、间接免疫荧光

1)准备4瓶传代好的MDBK细胞。

2)按每瓶细胞1mL 0.25％胰酶消化细胞，充分消化后各加入5mL 10％完全培养基终止消化。

3)将细胞转移至15mL离心管中，1000rpm离心10min。

4)弃上清，每管加入1mL完全培养基充分悬浮细胞，并吸取10μL细胞悬液计数。

5)按每孔5×10

6)PBS润洗细胞。

7)每孔接种事先培养的第5代BVDV临床分离毒株，37℃孵育1h，回收病毒。

8)PBS润洗细胞，加入10％完全培养基，37℃培养24h。

9)重复润洗细胞3次，用甲醇固定细胞20min，注意冰上操作，PBS重复润洗3次。

10)0.2％Triton在冰上透化细胞10min，用PBS重复洗涤3次。

11)每孔加入500μL 1％BSA，37℃恒温封闭45min。

12)每孔加入150μL按1:150稀释的鼠源BVDV E2蛋白单抗常温孵育1h，用PBS重复洗涤3次。

13)每孔加入150μL按1:500稀释的荧光二抗，避光孵育45min。

14)每孔加入一滴DAPI染细胞核5min，用PBS重复洗涤三次，最后在每孔中加入一滴防荧光衰减剂，轻轻摇匀。

15)镜下观察拍照。

10、构建进化树

根据临床分离株5’-UTR基因片段扩增的测序结果(SEQ ID NO:3)，并参考GenBank中保存的40种BVDV 5’-UTR基因片段，应用MEGA5软件进行系统进化树构建。

11、动物试验

(1)试验动物

8只体重3.5kg左右健康雄性新西兰大耳兔，购自北京维通利华实验动物中心，经BVDV抗原、抗体检测结果为阴性。饲养于中国农业大学动物医学院实验动物房，饲喂兔标准饲粮。待兔适应3d后随机分成攻毒组和对照组，每组4只。

(2)病毒

用于攻毒的病毒为此次分离得到的BVDV临床株。在MDBK细胞上传代五次。培养BVDV临床分离株期间所使用的所有试验材料未检测出BVDV抗原。

(3)试验步骤

攻毒组按每只10

(4)白细胞计数

将攻毒前(0d)和攻毒后1、3、5、7、14、21、28d采集的抗凝血送至中国农业大学动物医院有限公司进行白细胞计数。

(5)兔BVDV感染免疫应答血清学分析

检测攻毒前(0d)和攻毒后1、3、5、7、14、21、28d收集的血清样品中的BVDV抗体效价变化。操作步骤同上，检测板为由抗原包被的BVDV抗体检测板，在450nm单波长下测定血清样品及对照组波长。检测结果OD

(6)组织病理切片制作

将组织样品再次修块。按照75％、85％、95％和100％浓度酒精，二甲苯-无水酒精混合液(体积比1:1)和100％二甲苯，56℃、58℃和60℃熔点石蜡的程序依次脱水、透明、浸蜡。石蜡包埋组织、切片，每张3μm。将切好的组织置于39℃恒温水中展开，附着在载玻片磨砂面，经烤片机60℃恒温烤片2h后按表2程序脱蜡。

表2脱蜡反应试剂及反应时间

脱蜡程序完成后，苏木精染色2min，盐酸酒精分化7s，返蓝液返蓝40s，伊红染色100s，每步间隔期间均需蒸馏水冲洗至不脱色。按表3步骤脱水，完成后用中性树胶封闭玻片，镜下观查病理变化。

表3脱水反应试剂及反应时间

12、样品检测结果

采用IDEXX BVDV抗原检测试剂盒检测血清样品OD

提取175095号和175170号血清样品中病毒RNA，经RT-PCR反转录并以反转录后cDNA为模板进行BVDV 5’-UTR和N

13、生物型鉴定结果

将175170号血清经0.45μm滤器过滤除菌，接种至MDBK细胞并每天观察细胞状态，结果如图2所示，攻毒NADL毒株的MDBK细胞在24h时可见明显细胞病变甚至死亡，而攻毒临床分离株的MDBK细胞连续培养72h也未观察到任何细胞病变。因此，该BVDV临床分离株属于NCP生物型。

14、间接免疫荧光

为了进一步鉴定BVDV临床分离株，使用鼠源BVDV E2单抗进行间接免疫荧光。结果如图3所示，攻毒组MDBK细胞的细胞质中可检测到特异性免疫荧光信号，而未攻毒的对照组，MDBK细胞中不能检测到特异性免疫荧光信号。

15、TCID

重复三次试验后测得结果为10

16、进化树的绘制

根据临床分离株5’-UTR基因片段扩增测序结果，并参考GenBank中保存的40种BVDV 5’-UTR基因片段构建系统进化树，在分支旁边显示了使用1000个重复项在序列中聚集在一起的复制树百分比。结果如图4所示，BVDV临床分离株5’-UTR基因序列与MF-5毒株具有高度的序列同源性(88％)，表明其为BVDV-1型，1c基因亚型。

17、兔临床症状表现

在试验期间攻毒组和对照组所有兔采食量、饮水量、体温、精神状态均未见明显异常。

18、白细胞总数计数

收集攻毒前(0d)和攻毒后1、3、5、7、14、21、28d血液进行白细胞计数。结果如图5所示，虽然所有兔白细胞总数有所变化，但均在正常值范围以内。

19、免疫应答血清学分析

检测试验期间攻毒前(0d)和攻毒后1、3、5、7、14、21、28d血清样品中BVDV抗体滴度的变化，评估攻毒后兔免疫应答的血清学反应。结果如图6所示，攻毒组所有兔在第5d后BVDV抗体检测结果为阳性(S-N＞0.3)，第7d就达到比较强的抗体反应，而对照组所有兔在试验期间BVDV抗体检测结果保持阴性(S-N≤0.3)。

20、组织病理切片

为衡量BVDV临床分离株能否对兔主要组织器官产生微观病理变化，在试验第28d收集脾脏、肝脏、肾脏、回肠(圆形小球)、肺脏、心脏、空肠淋巴结和圆小囊组织，经固定、脱水、透明、包埋加工成石蜡方块，经切片、展片、染片、封片后于显微镜下观察并记录组织病理变化。很遗憾由于回肠组织在固定期间全部出现组织溶解现象，并未得到有效组织病理结果。

肺脏组织病理变化见图7。攻毒组兔肺脏组织可见局部出血、淤血，肺泡轻微扩张，少量肺泡内可见红细胞和巨噬细胞。对照组兔肺脏未出现上述异常。

脾脏组织病理变化见图7。攻毒组兔脾脏组织可见局部红髓内血细胞增多，大量炎性细胞浸润，淋巴细胞排空，呈“星空样变”。对照组兔脾脏虽未出现类似病理变化，但仍有部分兔表现出淋巴细胞少量排空现象。

肝脏组织病理变化见图7。攻毒组兔肝脏局部肝细胞点状或片状坏死并伴有少量炎性细胞聚集，血管区和汇管区周围可见大量炎性细胞。对照组兔肝脏组织虽未出现类似病理变化，但仍然发现肝细胞HE染色不均，疑似糖原沉积。

圆小囊组织病理变化见图7。攻毒组兔的圆小囊局部可见淋巴细胞排空，淋巴细胞坏死(核浓缩、核浓染、核破裂，细胞核消失)，淋巴细胞减少。对照组兔的圆小囊虽可见少量淋巴细胞排空现象，但无其它明显病理变化。

心脏组织变化见图7。攻毒组兔心脏可见少量心肌细胞呈空泡样变化，疑脂肪变性，而对照组兔心脏未出现上述异常且无其它明显病理变化。

空肠淋巴结组织变化见图7。攻毒组兔空肠淋巴结中可见淋巴细胞减少、疏松，疑似浆液渗出，而对照组兔空肠淋巴结未出现上述异常且无其它明显病理变化。

攻毒组和对照组兔肾脏组织结构均未见明显病理变化。

实施例2 pET-32a-E

1、引物设计与合成，设计引物扩增E

F：5′-CCC

R：5′-CCC

2、目的基因的扩增：以牛病毒性腹泻病毒反转录产物为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，62℃退火30s，72℃延伸100s，共30个循环；最后72℃延伸10min。扩增出的E

PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图8，条带位置正确，与预期结果相符，说明引物设计合理，PCR条件正确。扩增的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳后，紫外灯下切割目的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收和纯化DNA，具体步骤参照说明书进行。

3、将所得片段与T载体连接，将连接产物10μL加入到新制备的感受态细胞中，轻旋混匀。冰浴30min；42℃热休克90s，立即冰浴2min。然后加入到1mL 37℃预热的液体LB培养基中，37℃100r/min振摇45min；5,000r/min离心2min，弃去800μL上清，余下的200μL培养液涂布于固体LB平板(含100μg/mL Amp

4、挑取转化板上的单一菌落，无菌接至3mL LB/Amp

5、取克隆重组质粒进行PCR和Bam HI、XhoI双酶切鉴定。PCR反应体系及条件同上。混匀后37℃水浴2-3h，取出后全部上样，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

6、将pET-32a载体提取质粒，用Bam HI和XhoI进行双酶切后，用DNA纯化/回收试剂盒回收。同时将质粒pMD-18-T-E

实施例3重组蛋白的原核表达与纯化

1、对于实施例2测序正确的菌落pET-32a-E

2、SDS-PAGE凝胶电泳：组装好电泳设备，拔出样品梳，每孔加入10μL样品，样品在浓缩胶中采用80V电压进行电泳，在分离胶中采用120V的电压进行电泳。待溴酚蓝至分离胶底部约1cm时，停止电泳。取出凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液在摇床上染色30min左右，然后脱色至背景清晰，用清水冲洗、照相。SDS-PAGE表明，在IPTG诱导下，转化有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)可高效表达融合蛋白；时间梯度结果表明，3h的诱导量最高且以包涵体沉淀的形式表达。

3、包涵体蛋白纯化：取细胞破碎以破碎后细胞沉淀，用PBS洗涤沉淀并重选，于4℃，12000rpm离心1min，重复洗涤2-3次，加入19.7mL Buffer A(即平衡缓冲液：0.5mol/LNa

Bradford法测定纯化E

按“湿转法”进行：将SDS-PAGE后的凝胶中的蛋白质转到PVDF膜上，用BVDV兔源多克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗进行Western blot检测表达的蛋白。Western blot检测结果显示出清晰可见的条带(图11)，表明表达的E

E

实施例4ELISA检测方法的建立及条件优化

1、ELISA检测的试剂

(1)包被液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液，4℃保存。

(2)样本稀释液：含1％酪蛋白的磷酸盐-吐温缓冲液。

其中，磷酸盐-吐温缓冲液的配制如下：称取磷酸二氢钾(KH

(3)封闭液：含2％酪蛋白的磷酸盐-吐温缓冲液。

(4)酶标二抗：兔抗牛IgG/HRP。

(5)底物缓冲液(磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液：0.2mol Na

(6)TMB底物显色液：0.01g TMB干粉溶于1mL DMSO中，取底物缓冲液9.9mL加30μLH

(7)终止液(2M H

(8)0.05％PBST：在1L PBS中加入0.5mL的Tween-20。

2、E

采用双方阵试验：用0.05mol/L碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液(pH9.6)将纯化的重组蛋白(浓度为1mg/mL)作稀释后分别为0.02、0.01、0.008、0,006、0.004、0.002、0.001、0.0005、0.0002mg/mL，包被反应板100μL/孔，然后4℃过夜。将包被好的酶标板倒去孔内液体，PBST洗涤3次后，用2％酪蛋白封闭液37℃封闭1h，阳性血清及牛阴性血清分别用1％的BSA稀释50、100、200、400、800、1600倍，与重组蛋白不同稀释度组成方阵，100μL/孔。37℃孵育1h，PBST洗涤3次后加入稀释好的酶标抗体HRP－兔抗牛IgG(10000倍稀释)100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤后加入新鲜配制的显色液100μL/孔，显色10min，加100μL终止液。在酶标仪上读出OD

3、酶标二抗工作浓度的确定

将E

4、封闭液的选择

将E

5、抗原和血清反应时间的确定

抗原抗体反应会随着时间的增加，反应量也增加，但达到一定的时间后，反应即达到平衡，E

6、酶标二抗的作用时间的确定

E

7、底物显示时间的确定

按照已确定的ELISA反应程序依次包被、封闭、加入阴阳性血清，各做3个重复，再和酶标二抗反应0.5h之后加入TMB底物显色，37℃孵育反应设5min、10min、15min三个显色时间，测定在OD

8、间接ELISA方法阴阳性的判断

用E

S/P＝(OD

其中，阴性对照、阳性对照分别为已鉴定为BVDV抗体阴性、阳性的牛血清。

样品中牛病毒性腹泻病毒是否存在由S/P值决定。阴性S/P＜0.20，可疑0.20≤S/P≤0.30，阳性S/P≥0.30。

9、检测灵敏度试验

将阳性和阴性血清平行倍比稀释，按建立的间接ELISA方法检测血清中抗体的含量，将P/N≥2.1的最大血清稀释度作为ELISA检测方法的灵敏度。结果通过对血清的倍比稀释后检测发现，当血清稀释度达到1:6400时，P/N值仍大于2.1，说明所建立的间接ELISA方法有很高的灵敏度。

10、重复性试验

(1)批内重复性试验

用同一次纯化的E

(2)批间重复性试验

用4次不同批次纯化的E

实施例5牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA检测板的制备及检测流程

(1)将上述制得的已纯化的重组E

(2)加入2％酪蛋白，300μL/孔，37℃1h，洗板3次后密封；

(3)待检血清稀释：加入1：300稀释的待检血清到包被好的酶标反应板，100μL/孔，37℃孵育1h，洗板3次；

(4)加酶标物：被检测物种的特异IgG抗体，100μL/孔，37℃30min，洗板3次；

(5)显色：将配置好的TMB底物溶液100μL/孔加入，37℃避光10min；

(6)终止反应：加入终止液2mol/L的H

(7)确定本次试验是否成功：利用酶标仪，空白孔调零，读取450nm波长处吸光度，即OD

(8)结果判断：计算S/P值，公式为：

S/P＝(OD

其中，阴性对照、阳性对照分别为已鉴定为BVDV抗体阴性、阳性的牛血清。

样品中牛病毒性腹泻病毒是否存在由S/P值决定。阴性S/P＜0.20，可疑0.20≤S/P≤0.30，阳性S/P≥0.30。

实施例6牛病毒性腹泻病毒亚单位疫苗的制备及保护效力

1.1 MF59乳化剂的制备

将MF59乳化剂各成分角鲨烯(4.3％)，Tween-80(5％)，Span-85(5％)，按比例溶于柠檬酸钠缓冲液(10nM)中混合均匀，超声乳化。超声条件为：工作3s，间歇3s，超声时间5min。乳化完毕后经0.22μm滤膜过滤除菌，保存于4℃，即为MF59乳化剂(即MF59佐剂)。

1.2 E

将MF59乳化剂与实施例3制备的E

1.3实验分组

将60只6-8周雌性BALB/c小鼠按照体重随机分为三组(N＝20)：PBS空白对照组(A组)、MF59佐剂组(B组)和E

1.4血液和组织样品采集

血液采集时间：分别第一次免疫前(0d)，第二次免疫(7d)和第三次(14d)免疫，攻毒前一周(21d)和麻醉处死(35d)时采取小鼠血液。血液采集方式：用于收集血清抗体。组织样品采集：攻毒前一周(21d)和处死(35d)采集小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠和回肠组织。

1.5抗体效价检测

从-80℃冰箱中取出各时间段采集的小鼠血清，用自制的BVDV抗体试剂盒进行测定。

1.6组织病理切片分析

小鼠麻醉处死后，取脾脏、肝脏、肺脏和小肠组织固定于组织固定液中，之后进行组织病理切片制作和HE染色。(1)组织块修剪；(2)脱水、透明；(3)浸蜡；(4)包埋；(5)切片；(6)烤片；(7)HE染色。

2.结果

2.1抗体效价测定结果

为了评价E

2.2组织病理切片结果

为了评价小鼠主要组织器官在攻毒BVDV后的组织病理学变化，以及免疫E

2.3透射电镜观察结果

为了观察BVDV-BJ175170病毒粒子的形态和结构，相对于正常细胞组，病毒接种组细胞内质网处观察到椭圆形，有囊膜，直径大小在30-100nm的病毒粒子(图15)。

实施例7牛病毒性腹泻病毒灭活疫苗的制备及抗体效价测定

1.牛病毒性腹泻病毒灭活疫苗的制备

(1)以DMEM/F12作为基础培养液，用添加10％胎牛血清和1％青链霉素的完全培养基培养牛肾上皮细胞系(MDBK)。

(2)当MDBK汇合度生长至80％-85％时用PBS清洗细胞瓶一次。加入除菌过滤好的病毒BJ175170，37℃作用1h，期间多次摇动培养瓶使病毒充分与细胞接触。

(3)弃掉病毒液，加10％DMEM完全培养基进行培养，传代4-5代，进行扩大培养。

(4)收集细胞，反复冻融细胞3次，以彻底释放病毒粒子。

(5)将收获的含有病毒的细胞冻融液无菌收集起来，以10000rpm转速，4℃离心20min，收集上清，弃去沉淀。调整病毒液的浓度6×10

(6)根据稀释后的体积添加0.4％-0.7％福尔马林灭活。37℃放置36-48h。

(7)用15ml离心管收集灭活液，离心机8000rpm离心15min，收集上清。再次将上清静置过夜，离心收集上清，重复2-3次。

(8)将上清液经滤膜过滤除菌，收集滤液。

(9)检测灭活是否完全，将灭活的病毒液接种到MDBK细胞，培养36h后检测细胞上清液有没有BVDV。

(10)分3次接种兔子(健康雄性新西兰大耳兔，6月龄，4kg左右，共2组，每组4只)，每针剂间隔1周进行免疫，免疫剂量为200μL/次。

2.抗体效价测定结果

检测试验期间攻毒前(0d)和首次免疫后7、14、21、28、36、43、50d血清样品中BVDV抗体滴度的变化，评估攻毒后兔免疫应答的血清学反应。结果如图16所示，免疫组所有兔在第7d后BVDV抗体检测结果为阳性(S/P＞0.3)，第28d就达到抗体反应高峰，而对照组所有兔在试验期间BVDV抗体检测结果保持阴性(S/P<0.2)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 牛病毒性腹泻病毒BVDV-BJ175170及其应用

<130> KHP181111031.7

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 681

<212> DNA

<213> 牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus)

<400> 1

gaaaacataa cacagtggaa cctacaagat aatgggacgg aagggataca acgggcaatg 60

ttccaaaggg gtgtgaatag aagcttacat ggaatctggc cagagaaaat ctgtactggt 120

gtcccttccc atctagccac cgatatagaa ctaaaaacaa ttcatggtat gatggatgca 180

agtgagaaga ccaactacac gtgttgcaga cttcaacgcc atgagtggaa caagcatggt 240

tggtgcaact ggtacaatat tgaaccctgg attctagtca tgaataggac ccaagccaat 300

ctcactgagg gacaaccacc aagggagtgc gcagtcactt gtaggtatga tagggctagt 360

gacttaaacg tggtaacaca agctagagat agccccacac ccttaacggg ttgcaagaaa 420

ggaaagaact tctcctttgc aggcatattg atgcggggtc cctgcaactt tgaaatagct 480

gcaagtgatg tattattcaa agaacatgaa ggcactagta tgttccagga tactactctt 540

taccttgttg acgggttgac caactcctta gaaggtgcta gacaaggaac cgctaaactg 600

acaacctggt taggcaagca gctcgggata ctaggaaaaa agttggaaaa caagagtaag 660

acgtggtttg gagcatacgc t 681

<210> 2

<211> 227

<212> PRT

<213> 牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus)

<400> 2

Glu Asn Ile Thr Gln Trp Asn Leu Gln Asp Asn Gly Thr Glu Gly Ile

1 5 10 15

Gln Arg Ala Met Phe Gln Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile

20 25 30

Trp Pro Glu Lys Ile Cys Thr Gly Val Pro Ser His Leu Ala Thr Asp

35 40 45

Ile Glu Leu Lys Thr Ile His Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Lys Thr

50 55 60

Asn Tyr Thr Cys Cys Arg Leu Gln Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly

65 70 75 80

Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile Glu Pro Trp Ile Leu Val Met Asn Arg

85 90 95

Thr Gln Ala Asn Leu Thr Glu Gly Gln Pro Pro Arg Glu Cys Ala Val

100 105 110

Thr Cys Arg Tyr Asp Arg Ala Ser Asp Leu Asn Val Val Thr Gln Ala

115 120 125

Arg Asp Ser Pro Thr Pro Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe

130 135 140

Ser Phe Ala Gly Ile Leu Met Arg Gly Pro Cys Asn Phe Glu Ile Ala

145 150 155 160

Ala Ser Asp Val Leu Phe Lys Glu His Glu Arg Thr Ser Met Phe Gln

165 170 175

Asp Thr Thr Leu Tyr Leu Val Asp Gly Leu Thr Asn Ser Leu Glu Gly

180 185 190

Ala Arg Gln Gly Thr Ala Lys Leu Thr Thr Trp Leu Gly Lys Gln Leu

195 200 205

Gly Ile Leu Gly Lys Lys Leu Glu Asn Lys Ser Lys Thr Trp Phe Gly

210 215 220

Ala Tyr Ala

225

<210> 3

<211> 288

<212> DNA

<213> 牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus)

<400> 3

atgcccttag taggactagc ataatggaag gggtagcaac gtggtgagtt cgttggatgg 60

cttagccctg agtacagggc agtcgtcagt ggttcgacac cttggaagaa caaggcctcg 120

agatgccacg tggacgaggg catgcccaaa gcacatctta acctgggcgg gggtcgctca 180

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ctgtattgct actaaaaatc tctgctgtac atggcacatg gagttgaa 288