组蛋白去泛素化酶在制备抗衰老和治疗衰老相关疾病的药物中的应用

摘要

本发明提供了组蛋白去泛素化酶在制备抗衰老和治疗衰老相关疾病的药物中的应用，涉及生物医药技术领域；所述组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明经过验证，缺失MYSM1蛋白导致小鼠显著衰老以及诱发与衰老相关的疾病；MYSM1促进DNA损伤修复，阻碍细胞衰老，抑制慢性炎症。利用表达鼠源MYSM1的腺相关病毒作为基因治疗的结果证明，MYSM1可显著延长小鼠的寿命，降低衰老细胞的进程与数量，提高组织器官的正常功能，减少衰老相关疾病的发生发展，证明MYSM1在延缓衰老及治疗衰老相关疾病中具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及组蛋白去泛素化酶在制备抗衰老和治疗衰老相关疾病的药物中的应用。

背景技术

延缓衰老(Delaying Aging)和延长寿命(Prolonging Lifespan)自古以来就是人们永恒的追求梦想。衰老是机体在生长发育过程中一个普遍的生物学现象；机体衰老通常体现为细胞周期失调和过度免疫应答和炎症反应，导致组织器官免疫损伤、功能失调，并产生严重退行性疾病。因此，研究抗衰老的分子靶标及其在延缓衰老和延长寿命中的应用意义重大。

有许多证据支持细胞衰老(Cellular Senescence)是与衰老和年龄相关疾病发生发展的重要因素

基因治疗(Gene Therapy)是一种重要和有效的新型治疗手段，是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗疾病的目的。其中也包括转基因等方面的技术应用，也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因的产物能治疗疾病，基因治疗已广泛运用于各类疾病治疗中。截至2019年8月，欧洲药品管理局(European Medicines Agency，EMA)、美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)及中国国家食品药品监督管理总局(NMPA)等机构至少已批准13种基因治疗产品上市，同时还有2500多项细胞和基因治疗正在进行临床试验

参考文献：

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[2]Campisi J.Aging,cellular senescence,and cancer.Annu Rev Physiol2013；75:685–705.

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[13]High KA and Roncarolo MG.Gene Therapy.N Engl J Med 2019；381:455–464.

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供组蛋白去泛素化酶在制备抗衰老和治疗衰老相关疾病的药物中的应用，MYSM1可显著延长小鼠的寿命，降低衰老细胞的进程与数量，提高组织器官的正常功能，减少衰老相关疾病的发生发展。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种表达组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1的基因在制备抗衰老和治疗衰老相关疾病的药物中的应用，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述MYSM1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种表达组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1的腺相关病毒，所述组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种抗衰老和治疗衰老相关疾病的基因治疗试剂盒，所述试剂盒中包括所述腺相关病毒。

本发明提供了一种抗衰老和治疗衰老相关疾病的药物，所述药物的有效成分包括组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1，所述组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供了表达组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1的基因在制备抗衰老和治疗衰老相关疾病的药物中的应用，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明利用表达鼠源和/或人源MYSM1的腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)作为基因治疗手段开展抗衰老治疗应用；同时利用MYSM1蛋白及其多肽(包括通过各种表达、纯化、合成或修饰等技术和途径所获得的MYSM1蛋白及其多肽)开展抗衰老治疗应用。结果显示，缺失MYSM1蛋白导致小鼠显著衰老以及诱发与衰老相关的疾病；机制研究表明，MYSM1促进DNA损伤修复，阻碍细胞衰老，抑制慢性炎症。利用表达鼠源MYSM1的腺相关病毒作为基因治疗的结果证明，MYSM1可显著延长小鼠的寿命，降低衰老细胞的进程与数量，提高组织器官的正常功能，减少衰老相关疾病的发生发展。本发明有效的将MYSM1蛋白用于抗衰老以及治疗与衰老相关的疾病，而且具有非常显著的效果，因此MYSM1在延缓衰老及治疗衰老相关疾病中具有很好的应用前景。

附图说明

图1为MYSM1抑制细胞衰老图；

图2为MYSM1抑制细胞衰老的分子机制图；

图3为MYSM1敲除导致机体加速衰老图；

图4为MYSM1基因治疗显著延缓机体衰老和抑制衰老相关疾病发生发展图。

具体实施方式

本发明一种表达组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1的基因在制备抗衰老和治疗衰老相关疾病的药物中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明所述MYSM1的氨基酸序列优选如SEQ IDNO.2所示。在本发明中，所述组蛋白H2A去泛素化酶(Histone H2Adeubiquitinase，2A-DUB)又称Myb样SWIRM和MPN结构域1蛋白(Myb-like,SWIRM and MPN domain-containing protein 1，MYSM1)。本发明所述MYSM1可促进DNA损伤修复，阻碍细胞衰老，抑制慢性炎症，防止肿瘤发生发展等。

本发明还提供了一种表达组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1的腺相关病毒，所述组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明对所述腺相关病毒(AAV)的病毒载体并没有特殊限定，利用本领域的常规病毒载体和/或其它基因治疗载体即可。本发明实施例中为方便说明所述MYSM1的具体效果，利用表达鼠源MYSM1的腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)作为基因治疗处理老年小鼠，基因治疗结果证明，MYSM1可显著降低衰老细胞的进程与数量，提高组织器官的正常功能，减少衰老相关疾病的发生发展，延长小鼠的寿命。

本发明还提供了一种抗衰老和治疗衰老相关疾病的基因治疗试剂盒，所述试剂盒中包括所述腺相关病毒。本发明所述腺相关病毒可体外表达所述MYSM1，经分离纯化后得到的MYSM1蛋白活性高。本发明利用所述试剂盒进行抗衰老和治疗衰老相关疾病的基因治疗时，以MYSM1作为基因治疗的靶点，抗衰老效果非常明显。

本发明还提供了一种抗衰老和治疗衰老相关疾病的药物，所述药物的有效成分包括组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1，所述组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。本发明利用利用MYSM1蛋白及其多肽(包括通过各种表达、纯化、合成或修饰等技术和途径所获得的MYSM1蛋白及其多肽)开展抗衰老和治疗衰老相关疾病的应用。

下面结合实施例对本发明提供的组蛋白去泛素化酶在制备抗衰老和治疗衰老相关疾病的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

确定MYSM1与年龄及衰老的相关性，小老鼠样本分析：取不同年龄阶段小老鼠，检测MYSM1表达情况。原代细胞实验：以C57BL/6小鼠分离的MEF为模型，利用衰老诱导剂依托泊苷(Etoposide，ETO)刺激，检测MYSM1表达情况。分子与细胞生物学研究：用衰老诱导剂依托泊苷(ETO)和过氧化氢(Hydrogen peroxide，H

具体步骤如下：

(A–C)用依托泊苷(Etoposide，ETO)或盐酸阿霉素(Doxorubicin Hydrochloride，DOX)刺激C57BL/6小鼠MEFs(A)。从2月龄和22月龄野生型(WT)小鼠(每组n＝3)中取肾脏(B)和肺脏(C)。用RT-PCR方法检测Mysm1基因mRNAs。免疫印迹法(Immunoblotting)检测MYSM1和GAPDH蛋白。(D–F)WT或Mysm1

结果如图1所示，MYSM1在衰老组织中显著下降，同时，敲除MYSM1显著促进药物诱导的细胞衰老以及自然状态的细胞衰老，表明MYSM1抑制细胞衰老。

实施例2

MYSM1抑制细胞衰老的分子机制。

确定MYSM1与DNA损伤的相关性，老鼠样本分析：取不同年龄阶段老鼠，检测Mysm1野生型小鼠(C57BL/6WT)以及Mysm1基因敲除小鼠(C57BL/6Mysm1

其步骤是：(A和B)野生型(WT)或Mysm1

结果如图2所示，MYSM1促进DNA损伤修复，抵抗细胞衰老，抑制慢性炎症。

实施例3

MYSM1敲除导致机体加速衰老。

利用C57BL/6小鼠模型，建立相MYSM1的敲除鼠，用衰老诱导剂依托泊苷和电离辐射刺激基因敲除鼠，同时研究自然衰老老鼠，检测与分析组织器官中免疫因子、炎症因子，衰老相关分子表达情况，确认MYSM1调控老鼠寿命以及组织损伤的功能。取老龄老鼠，分析自然衰老模型中组织器官中免疫通路激活情况，确认衰老情况以及器官损伤机制。明确MYSM1敲除促进机体衰老。

其步骤是：(A–D)10个月大的WT和Mysm1

结果如图3所示，利用C57BL/6小鼠模型，建立相MYSM1的敲除鼠，检测与分析组织器官中免疫因子、炎症因子，衰老相关分子表达情况，确认MYSM1调控老鼠寿命以及组织损伤，且MYSM1敲除促进机体衰老。

实施例4

MYSM1基因治疗显著延缓机体衰老和抑制衰老相关疾病发生发展。

小动物实验：利用C57BL/6小鼠模型，取16个月的老年老鼠为对象，注射AAV-9相关的MYSM1表达病毒以及对照病毒，检测与分析组织器官中免疫因子、炎症因子，衰老相关分子表达情况，确认MYSM1治疗延长老鼠寿命以及修复组织损伤的功能。明确MYSM1可作为基因治疗的靶点，抑制机体衰老。

其步骤是：(A–D)14月龄WT小鼠用AAV9-Ctrl(n＝4)或AAV9-Mysm1(n＝5)治疗2个月。治疗后16个月大的老鼠的图像(A，顶部)。用WB法(A，中部和下部)测定肾脏和心脏中p16和p21蛋白的含量。用IHC法测定小鼠肝脏(B)、肾脏(C)和心脏(D)的IL-6(左)、p16(中)和p21(右)蛋白水平。(E–Q)16个月大的WT小鼠用AAV9-Ctrl或AAV9-Mysml治疗6个月(每组n＝5)。治疗前后小鼠的图像(E，顶部)，治疗后的小鼠皮毛图像(E，中间)，以及治疗后小鼠毛发变化的分析(E，底部)。治疗小鼠的存活率(F)。治疗小鼠的眼睛图像和白内障和眼病的频率分析(右)(G)。(H–J)用IHC检测治疗小鼠肝脏、肾脏和心脏中产生的γγ-H2AX。(K–M)H&E染色的小鼠肝脏、肾脏和心脏的图像。(N–P)用Masson三色染色法分析治疗小鼠的肝脏、肾脏和心脏。(Q)小鼠肾脏PAS分析。

结果如图4所示，确认MYSM1治疗延长老鼠寿命以及修复组织损伤的功能。明确MYSM1可作为基因治疗的靶点，抑制机体衰老。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 吴建国（Jianguo Wu）

<120> 组蛋白去泛素化酶在制备抗衰老和治疗衰老相关疾病的药物中的应用

<141> 2020-08-07

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2487

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO.1)

<400> 1

atggcggctg aagaggcgga tgtggatatc gaaggggacg tggtagcggc ggcgggggca 60

cagccaggaa gtggtgaaaa tacagcatca gttttacaaa aagatcacta tcttgattca 120

tcttggagaa cagagaatgg ccttattcct tggaccttgg ataacaccat cagtgaagag 180

aacagagctg ttattgagaa aatgttgttg gaagaagaat attatttatc taaaaaatca 240

caaccggaaa aagtctggct tgatcaaaag gaagatgata aaaaatacat gaagagtctg 300

cagaaaacag caaaaatcat ggtacactct cctacaaaac cagccagtta ctcagtaaag 360

tggacgatag aagaaaaaga gctgtttgaa caagggctgg ctaaatttgg ccgaagatgg 420

accaaaattt caaagctaat tggaagccgc actgttttac aagtgaagag ttatgcaaga 480

cagtatttta aaaataaggt caaatgcggt ctggataaag aaacaccaaa tcagaagacc 540

ggccataatc ttcaagttaa aaatgaagat aaagggacaa aggcatggac accatcatgt 600

ttaaggggac gtgctgatcc caacttgaat gctgtaaaaa ttgaaaagtt atctgatgat 660

gaagaagtag acatcacaga tgaggtggac gagttgtctt ctcaaacacc ccagaagaat 720

tctagcagtg atctcttgtt agactttcct aatagtaaaa tgcatgaaac caatcaagga 780

gaattcatta cttctgacag ccaggaagct ctcttttcta agtcttccag gggctgtctt 840

caaaatgaaa agcaagatga aacactttca agctcagaaa ttacactgtg gactgagaaa 900

cagagcaatg gtgacaaaaa atcaattgaa ttaaatgacc agaaatttaa tgaattgatt 960

aaaaactgca acaagcatga tggaagggga ataatagttg atgccaggca gttgccttct 1020

ccagagcctt gtgaaattca gaaaaatttg aatgataatg aaatgctttt tcattcttgc 1080

caaatggtag aggaaagcca tgaggaagaa gagcttaagc caccagaaca ggaaatagaa 1140

atagatagaa atatcattca agaagaagaa aaacaagcaa ttcctgagtt ttttgagggg 1200

cgccaagcta aaacaccaga acgctatttg aaaattagaa attatatttt ggatcaatgg 1260

gagatatgca aaccaaaata cttaaataag acctcagtac gtcctggcct gaagaactgt 1320

ggagatgtta attgtattgg acggattcat acatacctcg aattgatagg agcaatcaat 1380

tttggatgtg aacaggctgt gtataatagg ccacaaacag ttgacaaagt acgaatcaga 1440

gacagaaaag atgcagtaga agcataccaa cttgcccagc gtctgcagtc tatgcgtaca 1500

aggagacgta gggtccgaga cccatgggga aactggtgtg atgcaaagga cttagaagga 1560

caaacgtttg agcatctctc tgctgaggag ttggcaaaaa gaagagaaga ggaaaaaggc 1620

agacctgtta aatctttaaa agtgccaaga ccaacaaaaa gctcgtttga tcccttccaa 1680

ctgatacctt gtaatttttt tagtgaagaa aagcaggagc catttcaggt gaaagtggct 1740

tcagaagcac ttttaataat ggatttgcat gctcatgttt ctatggcaga agtgattggt 1800

ctgttaggag gaagatactc agaagttgat aaagtagttg aagtctgtgc agcagaacca 1860

tgtaacagtc tgagtacagg actacagtgt gagatggatc ctgtatcaca aacacaggcc 1920

tcagaaacct tggctgttag aggcttcagt gttattggat ggtatcattc tcatcctgct 1980

tttgatccta atccttcctt acgagatatt gacacacaag ctaaatacca gagttacttc 2040

tccagaggag gtgcaaagtt cattgggatg attgttagtc cctataatcg aaataatccc 2100

ttaccatatt ctcagattac ctgcctggtt ataagtgagg aaattagccc agatggctct 2160

tatcgcttac cttacaaatt tgaagtacag cagatgttag aagaacctca gtggggatta 2220

gtatttgaaa agacaagatg gataatagaa aaatacaggc tctcccatag cagcgtcccc 2280

atggataaaa tctttcgccg ggattctgac ctgacttgtt tgcagaaact tttggagtgt 2340

atgaggaaga ctctgagcaa agtgaccaat tgctttatgg ctgaagaatt cttgactgaa 2400

atagaaaatt tgttcctttc caattataaa agcaaccaag agaatggagt aaccgaagag 2460

aactgtacaa aggaattgtt aatgtga 2487

<210> 2

<211> 828

<212> PRT

<213> 人工序列(SEQ ID NO.2)

<400> 2

Met Ala Ala Glu Glu Ala Asp Val Asp Ile Glu Gly Asp Val Val Ala

1 5 10 15

Ala Ala Gly Ala Gln Pro Gly Ser Gly Glu Asn Thr Ala Ser Val Leu

20 25 30

Gln Lys Asp His Tyr Leu Asp Ser Ser Trp Arg Thr Glu Asn Gly Leu

35 40 45

Ile Pro Trp Thr Leu Asp Asn Thr Ile Ser Glu Glu Asn Arg Ala Val

50 55 60

Ile Glu Lys Met Leu Leu Glu Glu Glu Tyr Tyr Leu Ser Lys Lys Ser

65 70 75 80

Gln Pro Glu Lys Val Trp Leu Asp Gln Lys Glu Asp Asp Lys Lys Tyr

85 90 95

Met Lys Ser Leu Gln Lys Thr Ala Lys Ile Met Val His Ser Pro Thr

100 105 110

Lys Pro Ala Ser Tyr Ser Val Lys Trp Thr Ile Glu Glu Lys Glu Leu

115 120 125

Phe Glu Gln Gly Leu Ala Lys Phe Gly Arg Arg Trp Thr Lys Ile Ser

130 135 140

Lys Leu Ile Gly Ser Arg Thr Val Leu Gln Val Lys Ser Tyr Ala Arg

145 150 155 160

Gln Tyr Phe Lys Asn Lys Val Lys Cys Gly Leu Asp Lys Glu Thr Pro

165 170 175

Asn Gln Lys Thr Gly His Asn Leu Gln Val Lys Asn Glu Asp Lys Gly

180 185 190

Thr Lys Ala Trp Thr Pro Ser Cys Leu Arg Gly Arg Ala Asp Pro Asn

195 200 205

Leu Asn Ala Val Lys Ile Glu Lys Leu Ser Asp Asp Glu Glu Val Asp

210 215 220

Ile Thr Asp Glu Val Asp Glu Leu Ser Ser Gln Thr Pro Gln Lys Asn

225 230 235 240

Ser Ser Ser Asp Leu Leu Leu Asp Phe Pro Asn Ser Lys Met His Glu

245 250 255

Thr Asn Gln Gly Glu Phe Ile Thr Ser Asp Ser Gln Glu Ala Leu Phe

260 265 270

Ser Lys Ser Ser Arg Gly Cys Leu Gln Asn Glu Lys Gln Asp Glu Thr

275 280 285

Leu Ser Ser Ser Glu Ile Thr Leu Trp Thr Glu Lys Gln Ser Asn Gly

290 295 300

Asp Lys Lys Ser Ile Glu Leu Asn Asp Gln Lys Phe Asn Glu Leu Ile

305 310 315 320

Lys Asn Cys Asn Lys His Asp Gly Arg Gly Ile Ile Val Asp Ala Arg

325 330 335

Gln Leu Pro Ser Pro Glu Pro Cys Glu Ile Gln Lys Asn Leu Asn Asp

340 345 350

Asn Glu Met Leu Phe His Ser Cys Gln Met Val Glu Glu Ser His Glu

355 360 365

Glu Glu Glu Leu Lys Pro Pro Glu Gln Glu Ile Glu Ile Asp Arg Asn

370 375 380

Ile Ile Gln Glu Glu Glu Lys Gln Ala Ile Pro Glu Phe Phe Glu Gly

385 390 395 400

Arg Gln Ala Lys Thr Pro Glu Arg Tyr Leu Lys Ile Arg Asn Tyr Ile

405 410 415

Leu Asp Gln Trp Glu Ile Cys Lys Pro Lys Tyr Leu Asn Lys Thr Ser

420 425 430

Val Arg Pro Gly Leu Lys Asn Cys Gly Asp Val Asn Cys Ile Gly Arg

435 440 445

Ile His Thr Tyr Leu Glu Leu Ile Gly Ala Ile Asn Phe Gly Cys Glu

450 455 460

Gln Ala Val Tyr Asn Arg Pro Gln Thr Val Asp Lys Val Arg Ile Arg

465 470 475 480

Asp Arg Lys Asp Ala Val Glu Ala Tyr Gln Leu Ala Gln Arg Leu Gln

485 490 495

Ser Met Arg Thr Arg Arg Arg Arg Val Arg Asp Pro Trp Gly Asn Trp

500 505 510

Cys Asp Ala Lys Asp Leu Glu Gly Gln Thr Phe Glu His Leu Ser Ala

515 520 525

Glu Glu Leu Ala Lys Arg Arg Glu Glu Glu Lys Gly Arg Pro Val Lys

530 535 540

Ser Leu Lys Val Pro Arg Pro Thr Lys Ser Ser Phe Asp Pro Phe Gln

545 550 555 560

Leu Ile Pro Cys Asn Phe Phe Ser Glu Glu Lys Gln Glu Pro Phe Gln

565 570 575

Val Lys Val Ala Ser Glu Ala Leu Leu Ile Met Asp Leu His Ala His

580 585 590

Val Ser Met Ala Glu Val Ile Gly Leu Leu Gly Gly Arg Tyr Ser Glu

595 600 605

Val Asp Lys Val Val Glu Val Cys Ala Ala Glu Pro Cys Asn Ser Leu

610 615 620

Ser Thr Gly Leu Gln Cys Glu Met Asp Pro Val Ser Gln Thr Gln Ala

625 630 635 640

Ser Glu Thr Leu Ala Val Arg Gly Phe Ser Val Ile Gly Trp Tyr His

645 650 655

Ser His Pro Ala Phe Asp Pro Asn Pro Ser Leu Arg Asp Ile Asp Thr

660 665 670

Gln Ala Lys Tyr Gln Ser Tyr Phe Ser Arg Gly Gly Ala Lys Phe Ile

675 680 685

Gly Met Ile Val Ser Pro Tyr Asn Arg Asn Asn Pro Leu Pro Tyr Ser

690 695 700

Gln Ile Thr Cys Leu Val Ile Ser Glu Glu Ile Ser Pro Asp Gly Ser

705 710 715 720

Tyr Arg Leu Pro Tyr Lys Phe Glu Val Gln Gln Met Leu Glu Glu Pro

725 730 735

Gln Trp Gly Leu Val Phe Glu Lys Thr Arg Trp Ile Ile Glu Lys Tyr

740 745 750

Arg Leu Ser His Ser Ser Val Pro Met Asp Lys Ile Phe Arg Arg Asp

755 760 765

Ser Asp Leu Thr Cys Leu Gln Lys Leu Leu Glu Cys Met Arg Lys Thr

770 775 780

Leu Ser Lys Val Thr Asn Cys Phe Met Ala Glu Glu Phe Leu Thr Glu

785 790 795 800

Ile Glu Asn Leu Phe Leu Ser Asn Tyr Lys Ser Asn Gln Glu Asn Gly

805 810 815

Val Thr Glu Glu Asn Cys Thr Lys Glu Leu Leu Met

820 825