用于同时分析多个DIP和STR位点的复合扩增系统、方法、试剂盒及其用途

摘要

本发明公开了一种用于同时分析多个DIP和STR位点的复合扩增系统、方法、试剂盒及其用途，适用于微量混合样本和无创产前亲子鉴定，可扩增的DNA样本混合比例高达100：1，能够检测46个DIP和46个STR位点信息，大大提高了个体识别和亲子鉴定的成功率和准确性。本发明可检测的扩增产物片段大小均设计在80到260bp之间，对血迹、毛发和腐败降解检材同样能够高效检测。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及人类基因组中短串联重复序列(STR)的检测技术，特别涉及用于同时分析多个DIP和STR位点的复合扩增系统、方法、试剂盒及其用途。

背景技术

目前针对微量混合样本或者无创产前亲子鉴定的检测，主要采用Y染色体短串联重复序列(Y-STR)和二代测序单核苷酸多态性(SNP)的方法来检测。Y-STR仅仅在混合样品中的主成分为女性、次成分为男性的情况下才能适用，而对于主成分和次成分均是女性、主成分是男性的情况无法适用。因此，Y-STR在微量混合样本中的应用范围很狭窄，不能作为通用的检测方法。由于SNP的等位基因数量大多都仅有2个，导致用于混合样本或亲子鉴定的有效SNP数量较高，至少需要1000个，因此二代高通量测序是检测大规模数量SNP的唯一办法。目前市场也确实是使用的二代检测SNP，大多数公司自行宣传检测的SNP数量在3000-5000个之间，但是实际调查得知的真正有效的SNP数量却仅在100-800个之间，所以二代测序SNP的方法应用于微量混合样本或无创产前亲子鉴定仍然存在识别率较低的担忧。通过二代测序技术检测的技术，由于其目前较高的测序成本、较长的检测周期、不够高的识别率，也不能作为微量混合样本或无创产前亲子鉴定的黄金标准方法。

中国专利CN106399535A公开了一种高通量测序检测无创亲子鉴定的方法，包括以下步骤：提取基因组DNA，包括提取孕妇新鲜血液中的胎儿游离DNA、提取孕妇DNA、提取疑似父亲的DNA；多重PCR扩增，利用多重PCR引物panel进行多重PCR扩增，并纯化扩增产物，采用含有多个SNP位点的扩增子试剂盒进行PCR扩增，分别对胎儿游离DNA、孕妇DNA、疑似父亲的DNA进行富集；文库构建，即采用文库构建试剂盒对纯化好的多重PCR扩增产物进行文库构建；文库质控，采用实时荧光定量PCR和Agilent 2100对构建好的文库进行质量控制，为上机测序做准备；测序，采用二代测序仪，包括Ion Torrent平台或Illumina平台的测序仪进行上机测序；数据分析，采用软件对上机测序结果进行生物信息学分析，进行亲子鉴定判断，并进行生物信息学数据分析，分析胎儿、孕妇和疑似父亲的DNA的SNP位点，并进行比对，鉴定出是否具有亲缘关系。然而，该方法物料成本高，人工需求量大，检测周期长。

发明内容

本发明提供一种适用于微量混合样本和无创产前亲子鉴定的分子检测技术，可扩增的混合比例高达100：1，能够检测46个DIP和46个STR位点信息，大大提高了个体识别和亲子鉴定的成功率和准确性。本发明可检测的扩增产物片段大小均设计在80到260bp之间，对血迹、毛发和腐败降解检材同样能够高效检测。

本发明提供一种用于同时分析多个DIP和STR位点的复合扩增系统，该复合扩增系统包含如下多个DIP-STR位点：rs10569326-STR、rs10577638-STR、rs142657156-STR、rs140373040-STR、rs10570760-STR、rs66912295-STR、rs536250011-STR、rs61531703-STR、rs145423446-STR、rs139483687-STR、rs149398657-STR、rs78064473-STR、rs111478323-STR、rs36081697-STR、rs112416275-STR、rs367718919-STR、rs35032587-STR、rs34481125-STR、rs66668171-STR、rs142964199-STR、rs113081990-STR、rs150228910-STR、rs35709010-STR、rs113098807-STR、rs138785568-STR、rs5829572-STR、rs71915999-STR、rs144136774-STR、rs35105135-STR、rs10654024-STR、rs35577493-STR、rs34163974-STR、rs74334881-STR、rs3044132-STR、rs35938841-STR、rs112604544-STR、rs5825451-STR、rs34952562-STR、rs58333334-STR、rs10647255-STR、rs67480455-STR、rs61036673-STR、rs5845148-STR、rs58063416-STR、rs71150206-STR和rs34212659-STR。

本发明的复合扩增系统能够同时扩增上述多个DIP-STR位点。

在优选实施例中，上述位点分别被该位点两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5’端进行标记。

在优选实施例中，上述标记为荧光标记。

在优选实施例中，上述复合扩增系统包括如SEQ ID NO：1～138所示的138条引物序列。

在优选实施例中，上述复合扩增系统包括3个复合扩增体系，其中第一复合扩增体系同时扩增如下DIP-STR位点：rs10569326-STR、rs10577638-STR、rs142657156-STR、rs140373040-STR、rs10570760-STR、rs66912295-STR、rs536250011-STR、rs61531703-STR、rs145423446-STR、rs139483687-STR、rs149398657-STR、rs78064473-STR、rs111478323-STR、rs34481125-STR、rs66668171-STR、rs142964199-STR、rs36081697-STR、rs112416275-STR、rs367718919-STR、rs35032587-STR；

第二复合扩增体系同时扩增如下DIP-STR位点：rs113081990-STR、rs150228910-STR、rs35709010-STR、rs113098807-STR、rs138785568-STR、rs5829572-STR、rs71915999-STR、rs144136774-STR、rs35105135-STR、rs10654024-STR、rs74334881-STR、rs3044132-STR、rs35938841-STR、rs35577493-STR、rs34163974-STR；

第三复合扩增体系同时扩增如下DIP-STR位点：rs112604544-STR、rs5825451-STR、rs34952562-STR、rs58333334-STR、rs10647255-STR、rs67480455-STR、rs61036673-STR、rs34212659-STR、rs5845148-STR、rs58063416-STR、rs71150206-STR。

在优选实施例中，上述第一复合扩增体系扩增的DIP-STR位点分为以下五种组合：第一组包括rs10569326-STR、rs10577638-STR、rs142657156-STR、rs140373040-STR、rs10570760-STR，第二组包括rs66912295-STR、rs536250011-STR、rs61531703-STR、rs145423446-STR，第三组包括rs139483687-STR、rs149398657-STR、rs78064473-STR、rs111478323-STR，第四组包括rs34481125-STR、rs66668171-STR、rs142964199-STR，第五组包括rs36081697-STR、rs112416275-STR、rs367718919-STR、rs35032587-STR；

上述第二复合扩增体系扩增的DIP-STR位点分为以下五种组合：第一组包括rs113081990-STR、rs150228910-STR、rs35709010-STR，第二组包括rs113098807-STR、rs138785568-STR、rs5829572-STR，第三组包括rs71915999-STR、rs144136774-STR、rs35105135-STR、rs10654024-STR，第四组包括rs74334881-STR、rs3044132-STR、rs35938841-STR，第五组包括rs35577493-STR、rs34163974-STR；

上述第三复合扩增体系扩增的DIP-STR位点分为以下五种组合：第一组包括rs112604544-STR、rs5825451-STR，第二组包括rs34952562-STR、rs58333334-STR，第三组包括rs10647255-STR、rs67480455-STR、rs61036673-STR，第四组包括rs34212659-STR，第五组包括rs5845148-STR、rs58063416-STR、rs71150206-STR；

其中，上述五种组合的引物分别由五种不同的荧光素标记。

在优选实施例中，上述五种不同的荧光素标记分别是6’-羧基荧光素(FAM)蓝色荧光标记、六氯-6-甲基荧光素(HEX)绿色荧光标记、4-甲基-6-羧基-罗丹明(TAMRA)黄色荧光标记、羧基-X-罗丹明(ROX)红色荧光标记、Cy5(Indodicarbocyanine)紫色荧光标记。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种同时分析DNA样品中多个DIP和STR位点的方法，该方法采用第一方面的复合扩增系统检测DNA。

在优选实施例中，上述DNA样品选自血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液、羊水或它们的混合物。

根据本发明的第三方面，本发明提供一种用于同时分析DNA样品中多个DIP和STR位点的试剂盒，其中DIP和STR位点包括以下位点：rs10569326-STR、rs10577638-STR、rs142657156-STR、rs140373040-STR、rs10570760-STR、rs66912295-STR、rs536250011-STR、rs61531703-STR、rs145423446-STR、rs139483687-STR、rs149398657-STR、rs78064473-STR、rs111478323-STR、rs36081697-STR、rs112416275-STR、rs367718919-STR、rs35032587-STR、rs34481125-STR、rs66668171-STR、rs142964199-STR、rs113081990-STR、rs150228910-STR、rs35709010-STR、rs113098807-STR、rs138785568-STR、rs5829572-STR、rs71915999-STR、rs144136774-STR、rs35105135-STR、rs10654024-STR、rs35577493-STR、rs34163974-STR、rs74334881-STR、rs3044132-STR、rs35938841-STR、rs112604544-STR、rs5825451-STR、rs34952562-STR、rs58333334-STR、rs10647255-STR、rs67480455-STR、rs61036673-STR、rs5845148-STR、rs58063416-STR、rs71150206-STR和rs34212659-STR，上述试剂盒包括如SEQ ID NO：1～138所示的138条引物序列。

根据本发明的第四方面，本发明提供一种第一方面的复合扩增系统、或第三方面的试剂盒在微量混合样本或者无创产前亲子鉴定的检测中的用途。

本发明最终选取的46个DIP-STR位点为从千人基因组选取的全新组合位点，均是全球首次报道。本发明不仅能够用于常规的基因分型，还能够检测出微量混合DNA样本中两者的基因型，且混合比例可高达100：1。本发明为荧光标记复合扩增体系，能够在单管内一次性扩增多个DIP-STR位点，相比于单独位点扩增能够极大地节省物料和时间成本。本发明相对目前市场主流使用的NGS测序检测无创产前亲子鉴定方法，可以缩短检测周期、降低检测成本。

附图说明

图1为本发明中2841个DIP-STR位点筛选流程示意图；

图2为本发明中DIP-STR位点排布示意图；

图3为本发明中对DNA标准品9947a的基因分型图；

图4为本发明中对DNA标准品9948的基因分型图；

图5为本发明中对DNA标准品9947a：9948＝1：100(质量比)DNA混合物中9947a的基因分型图；

图6为本发明中对DNA标准品9948：9947a＝1：100(质量比)的DNA混合物中9948的基因分型图；

图7为本发明中对样本A：样本B＝1：100(质量比)的DNA混合物中样本A的基因分型图；

图8为本发明中对样本B：样本A＝1：100(质量比)的DNA混合物中样本B的基因分型图；

图9为本发明中对编号为1223家系(肯定)母血分型样本中胎儿游离DNA的基因分型图；

图10为本发明中对编号为1247家系(肯定)母血分型样本中胎儿游离DNA的基因分型图；

图11为本发明中对编号为1066家系(否定)母血分型样本中胎儿游离DNA的基因分型图；

图12为本发明中对编号为1242家系(否定)母血分型样本中胎儿游离DNA的基因分型图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明提出一种名为DIP-STR的新型遗传标记，依赖于配对缺失/插入多态性(DIP，或称indel/insert)与标准短串联重复序列(STR)，作为微量混合样本和无创产前亲子鉴定的新方法。这种DIP-STR方法不同于传统对DIP和STR单独检测的方法——需要不同引物对DIP和STR进行分别检测，而本发明选择的DIP和STR都是距离在100bp内、可以使用同一引物同时扩增得到DIP和STR、最终片段大小在80至260bp之间。依据DIP的长度多态性设计可分别扩增插入和缺失的差异性扩增引物，分别检测indel-STR和insert-STR的扩增产物片段，能够有效区分微量混合样本和无创产前亲子鉴定样本中主成分、次成分的DNA遗传信息。即便本发明所使用的DIP大多也只有2个等位基因，但不同于目前二代测序只检测SNP的方法，DIP-STR方法还兼顾了STR的特征，使得DIP-STR的等位基因数量在STR和DIP单独检测时的等位基因数量基础上成倍增长。

如图1，DIP-STR位点筛选流程示意图所示，在人类基因组中，每7.2kp就包含一个DIP位点，本发明，首先从千人基因组数据中筛选STR的数据(原始文件ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp/release/20130502/supporting/strs/ALL.wgs.v3_lobSTR.20130502.micros at.integrated_light_weight.genotypes.vcf.gz)，计算STR的遗传学参数，在dbSNP中公布的人类基因组indel位点中检索，进一步选择两侧100bp以内包含indel的STR位点。所包含的indel最小等位基因频率大于0.3，所包含的STR位点的杂合度大于0.5，且DIP与STR在基因组间隔距离不超过100bp的DIP-STR位点，共计有2841个DIP-STR位点。

然后，将获得的2841个DIP-STR位点在NCBI的dbSNP数据库中逐条比对，人工过滤掉假阳性的DIP和STR位点，过滤后得到的DIP-STR位点数为143个。最终获得的143个DIP-STR位点针对其插入、缺失两种变异分别设计1条特异性引物，分别命名为DIP-STR-L、DIP-STR-S，并保证它们共用另1条引物。

引物设计采用Primer Premier 6软件，保证每条引物退火温度都在60℃左右、不产生引物二聚体或者非特异性扩增产物。将所有共用的引物序列用6’-羧基荧光素(FAM)蓝色荧光标记，这样即获得143个位点的286对蓝色荧光标记引物，其最终扩增产物的长度均在80-260bp之间，并进行引物单独扩增测试。

扩增测试体系除混合物外还包括PCR缓冲液、DNA模板及1U至2U的Taq DNA聚合酶。本发明的PCR扩增反应的缓冲体系中包括：10mM DMSO，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3，25℃)，2.0mM MgCl

扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI Veriti、Bio-Rad myCycler等)采用以下的温度循环条件可以得到较好的结果：91℃预变性1分钟；95℃变性3秒钟，58℃退火1分钟，70℃延伸20秒钟，该步骤重复28个循环；60℃继续延伸30分钟；4℃～12℃保存。

按在上述扩增体系和PCR扩增程序进行扩增后，得到带有蓝色荧光标记的扩增产物。混扩增产物与甲酰胺、分子量内标按30：1的比例进行混合变性后，再使用毛细管电泳法分离。最终的荧光标记混合物在激光激发下发出可识别的光信号，能够被遗传分析仪(ABI3130、3100、3500等)成功接收。接收的荧光信号可以在

根据检测结果，将不产生非特异扩增、引物二聚体，且在10个无关个体中显示出DIP和STR均具有多态性的DIP-STR的合格位点数为46个，包括：rs10569326-STR、rs10577638-STR、rs142657156-STR、rs140373040-STR、rs10570760-STR、rs66912295-STR、rs536250011-STR、rs61531703-STR、rs145423446-STR、rs139483687-STR、rs149398657-STR、rs78064473-STR、rs111478323-STR、rs36081697-STR、rs112416275-STR、rs367718919-STR、rs35032587-STR、rs34481125-STR、rs66668171-STR、rs142964199-STR、rs113081990-STR、rs150228910-STR、rs35709010-STR、rs113098807-STR、rs138785568-STR、rs5829572-STR、rs71915999-STR、rs144136774-STR、rs35105135-STR、rs10654024-STR、rs35577493-STR、rs34163974-STR、rs74334881-STR、rs3044132-STR、rs35938841-STR、rs112604544-STR、rs5825451-STR、rs34952562-STR、rs58333334-STR、rs10647255-STR、rs67480455-STR、rs61036673-STR、rs5845148-STR、rs58063416-STR、rs71150206-STR、rs34212659-STR，共计46个DIP-STR位点，如表1所示。

表1

根据上述STR位点扩增产物片段大小将其分为3个复合扩增体系，每个体系又分为五组，且为避免同一位点的L和S引物的交叉干扰，每个复合扩增体系又分为均是L引物和S引物的复合扩增反应，因此共计6个复合扩增反应。

体系1(引物序列见表2)——第一组：rs10569326-STR、rs10577638-STR、rs142657156-STR、rs140373040-STR、rs10570760-STR，用6’-羧基荧光素(FAM)蓝色荧光标记；第二组：rs66912295-STR、rs536250011-STR、rs61531703-STR、rs145423446-STR，用六氯-6-甲基荧光素(HEX)绿色荧光标记；第三组：rs139483687-STR、rs149398657-STR、rs78064473-STR、rs111478323-STR，用4-甲基-6-羧基-罗丹明(TAMRA)黄色荧光标记；第四组：rs34481125-STR、rs66668171-STR、rs142964199-STR，用羧基-X-罗丹明(ROX)红色荧光标记；第五组：rs36081697-STR、rs112416275-STR、rs367718919-STR、rs35032587-STR，用Cy5(Indodicarbocyanine)紫色荧光标记。

表2

体系2(引物序列见表3)——第一组：rs113081990-STR、rs150228910-STR、rs35709010-STR，用6’-羧基荧光素(FAM)蓝色荧光标记；第二组：rs113098807-STR、rs138785568-STR、rs5829572-STR，用六氯-6-甲基荧光素(HEX)绿色荧光标记；第三组：rs71915999-STR、rs144136774-STR、rs35105135-STR、rs10654024-STR，用4-甲基-6-羧基-罗丹明(TAMRA)黄色荧光标记；第四组：rs74334881-STR、rs3044132-STR、rs35938841-STR，用羧基-X-罗丹明(ROX)红色荧光标记；第五组：rs35577493-STR、rs34163974-STR，用Cy5(Indodicarbocyanine)紫色荧光标记。

表3

体系3(引物序列见表4)——第一组：rs112604544-STR、rs5825451-STR，用6’-羧基荧光素(FAM)蓝色荧光标记；第二组：rs34952562-STR、rs58333334-STR，用六氯-6-甲基荧光素(HEX)绿色荧光标记；第三组：rs10647255-STR、rs67480455-STR、rs61036673-STR，用4-甲基-6-羧基-罗丹明(TAMRA)黄色荧光标记；第四组：rs34212659-STR，用羧基-X-罗丹明(ROX)红色荧光标记；第五组：rs5845148-STR、rs58063416-STR、rs71150206-STR，用Cy5(Indodicarbocyanine)紫色荧光标记。

表4

每组之中各STR位点扩增产物根据长度差异分开，相邻两个STR位点不能有重叠。分别对每组引物进行复合扩增试验，PCR扩增缓冲体系和反应条件与上述引物单独测试相同，在确定该组没有非特异扩增现象和交叉反应等情况后，调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。

按在上述复合扩增体系和PCR扩增程序进行扩增后，得到带有五种荧光标记的混合扩增产物。混合扩增产物与甲酰胺、分子量内标按30：1的比例进行混合变性后，再使用毛细管电泳法分离。最终的荧光标记混合物在激光激发下发出可识别的光信号，能够被遗传分析仪(ABI 3130、3100、3500等)成功接收。接收的荧光信号可以在

以下通过具体实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1DIP-STR位点排布示意图

根据引物单独筛选所得的46个DIP-STR位点，将其分为3个体系。

如图2a所示，体系1为rs10569326-STR、rs10577638-STR、rs142657156-STR、rs140373040-STR、rs10570760-STR、rs66912295-STR、rs536250011-STR、rs61531703-STR、rs145423446-STR、rs139483687-STR、rs149398657-STR、rs78064473-STR、rs111478323-STR、rs36081697-STR、rs112416275-STR、rs367718919-STR、rs35032587-STR、rs34481125-STR、rs66668171-STR、rs142964199-STR。

如图2b所示，体系2为rs113081990-STR、rs150228910-STR、rs35709010-STR、rs113098807-STR、rs138785568-STR、rs5829572-STR、rs71915999-STR、rs144136774-STR、rs35105135-STR、rs10654024-STR、rs35577493-STR、rs34163974-STR、rs74334881-STR、rs3044132-STR、rs35938841-STR。

如图2c所示，体系3为rs112604544-STR、rs5825451-STR、rs34952562-STR、rs58333334-STR、rs10647255-STR、rs67480455-STR、rs61036673-STR、rs5845148-STR、rs58063416-STR、rs71150206-STR、rs34212659-STR。

实施例2对DNA标准品9947a的基因分型图

所用样本来自于三位匿名血液捐赠者和商业购买的9947a、9948。DNA采用chelex-100法提取(具体方法参考《Forensic DNA Protocol》，Humana Press，1998)。利用本发明的试剂盒(引物组合)对上述样本进行扩增，扩增反应在G1000热循环仪上进行，电泳及检测在ABI 3500遗传分析仪上进行，数据分析采用

(1)引物混合液配制

将体系1、体系2和体系3的引物按照表5、表6和表7给出的比例进行混合，其中表5、表6和表7中引物终浓度代表各位点所对应的正向引物和反向引物之和，正向引物和反向引物含量相同，比例为1：1。

表5体系1引物混合物中各引物的终浓度

表6体系2引物混合物中各引物的终浓度

表7体系3引物混合物中各引物的终浓度

(2)聚合酶链式反应(PCR)扩增

1)取缓冲液、引物混合物、Taq酶，按照表8配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管25μL，加入模板DNA。

表8复合扩增反应体系

2)按照表9的反应条件设置热循环仪增仪(G1000)，将PCR反应管放入仪器中进行PCR扩增。

表9复合扩增热循环条件

(3)电泳上机检测

扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3500遗传分析仪进行电泳和检测。电泳结果用

实施例3对DNA标准品9948的基因分型图

实验具体步骤与“实施例2”中相同。基因分析图谱如图4所示，图4a为体系1的全部L引物扩增结果，图4b为体系1的全部S引物扩增结果，图4c为体系2的全部L引物扩增结果，图4d为体系2的全部S引物扩增结果，图4e为体系3的全部L引物扩增结果，图4f为体系3的全部S引物扩增结果。

实施例4对9947a：9948＝1：100(质量比)的DNA混合物中9947a的基因分型图

实验具体步骤与“实施例2”中相同。基因分析图谱如图5所示，其中L和S分别表示使用的是L或S引物，第一栏表示单独9948的DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第二栏表示9947a与9948按照1：100的质量比混合后的DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第三栏表示单独9947a的DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因。

图5中显示rs34481125-STR-L、rs61531703-STR-L、rs139483687-STR-L、rs34163974-STR-L、rs71915999-STR-L、rs138785568-STR-L、rs10647255-STR-L，单独DNA测试的9948在上述7个DIP-STR位点中的等位基因均为缺失，而单独DNA测试的9947a在上述7个DIP-STR位点中的等位基因均为插入，因此推测9947a与9948的DNA混合样本在上述7个位点中显示出的插入等位基因均来自9947a。

rs66912295-STR-S、rs112416275-STR-S、rs142657156-STR-S、rs10654024-STR-S、rs113098807-STR-S，共计5个DIP-STR位点，单独DNA测试的9948在上述5个DIP-STR位点中的等位基因均为插入，而单独DNA测试的9947a在上述5个位点中的DIP-STR等位基因均为缺失，因此推测9947a与9948的DNA混合样本在上述5个位点中显示出的缺失等位基因均来自9947a。

进一步的数据比对发现，如表10所示，9947a与9948的DNA混合样本在上述12个位点的等位基因大小，均与单独DNA测试的9947a的等位基因大小保持一致，也即证明本发明成功从混合样本中检测出了低含量的样本基因型。

表10

实施例5对9948：9947a＝1：100(质量比)的DNA混合物中9948的基因分型图

实验具体步骤与“实施例2”中相同。基因分析图谱如图6所示，其中L和S分别表示使用的是L或S引物，第一栏表示单独9947a的DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第二栏表示9948与9947a按照1：100的质量比混合后的DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第三栏表示单独9948的DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因。

图6中显示rs61531703-STR-S、rs536250011-STR-S、rs34952562-STR-S，共计3个DIP-STR位点，单独DNA测试的9947a在上述3个位点中的DIP-STR等位基因均为插入，而单独DNA测试的9948在上述3个位点中的DIP-STR等位基因均为缺失，因此为推测9948与9947a的DNA混合样本在上述3个位点中显示出的缺失等位基因均来自9948。

rs144136774-STR-L共计1个DIP-STR位点，单独DNA测试的9947a在此位点中的DIP-STR等位基因均为缺失，而单独DNA测试的9948在此位点中的DIP-STR等位基因均为插入，因此为推测9948与9947a的DNA混合样本在此位点中显示出的插入等位基因均来自9948。

进一步的数据比对发现，如表11所示，9948与9947a的DNA混合样本在上述4个位点的等位基因大小，均与单独DNA测试的9948的等位基因大小保持一致，也即证明本发明成功从混合样本中检测出了低含量的样本基因型。

表11

实施例6对样本A：样本B＝1：100(质量比)的DNA混合物中样本A的基因分型图

样本A和样本B的DNA来源于2个无关个体自愿者捐献的血液样本经chelex-100法提取获得，样本A简称用“CD”代替，而样本B简称用“FDK”代替。实验具体步骤与“实施例2”中相同。基因分析图谱如图7所示，其中L和S分别表示使用的是L或S引物，第一栏表示样本A与样本B按照1：100的质量比混合后的DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第二栏表示单独样本B的DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第三栏表示单独样本A的DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因。

图7中显示rs367718919-STR-S、rs5829572-STR-S，共计2个DIP-STR位点，单独DNA测试的样本B在上述2个位点中的DIP-STR等位基因均为插入，而单独DNA测试的样本A在上述2个位点中的DIP-STR等位基因均为缺失，因此为推测样本A与样本B的DNA混合样本在上述2个位点中显示出的缺失等位基因均来自样本A。

rs3044132-STR-L、rs71915999-STR-L、rs67480455-STR-L，共计3个DIP-STR位点，单独DNA测试的样本B在上述3个位点中的DIP-STR等位基因均为缺失，而单独DNA测试的样本A在上述3个位点中的DIP-STR等位基因均为插入，因此推测样本A与样本B的DNA混合样本在上述3个位点中显示出的插入等位基因均来自样本A。

进一步的数据比对发现，如表12所示，样本A与样本B的DNA混合样本在上述5个位点的等位基因大小，均与单独DNA测试的样本A的等位基因大小保持一致，也即证明本发明成功从混合样本中检测出了低含量的样本基因型。

表12

实施例7对样本B：样本A＝1：100(质量比)的DNA混合物中样本B的基因分型图

样本A和样本B的DNA来源于2个无关个体自愿者捐献的血液样本经chelex-100法提取获得，样本A简称用“CD”代替，而样本B简称用“FDK”代替。实验具体步骤与“实施例2”中相同。基因分析图谱如图8所示，其中L和S分别表示使用的是L或S引物，第一栏表示样本B与样本A按照1：100的质量比混合后的DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第二栏表示单独样本A的DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第三栏表示单独样本B的DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因。

图8中显示rs36081697-STR-L、rs61531703-STR-L、rs111478323-STR-L、rs142657156-STR-L、rs367718919-STR-L，共计5个DIP-STR位点，单独DNA测试的样本A在上述5个位点中的DIP-STR等位基因均为缺失，而单独DNA测试的样本B在上述5个位点中的DIP-STR等位基因均为插入，因此推测样本B与样本A的DNA混合样本在上述5个位点中显示出的插入等位基因均来自样本B。

进一步的数据比对发现，如表13所示，样本B与样本A的DNA混合样本在上述5个位点的等位基因大小，均与单独DNA测试的样本B的等位基因大小保持一致，也即证明本发明成功从混合样本中检测出了低含量的样本基因型。

表13

实施例8对编号为1223家系(肯定)母血分型样本中胎儿游离DNA的基因分型图

家系1223中母亲、胎儿、父亲的DNA来源于自愿者捐献的血液样本经chelex-100法提取获得，母亲DNA样本用“M”代替，胎儿DNA样本用“C”代替，而父亲DNA样本用“F”代替。实验具体步骤与“实施例2”中相同。基因分析图谱如图9所示，其中L和S分别表示使用的是L或S引物，第一栏表示母亲单独DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第二栏表示母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第三栏表示父亲DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因。

图9中显示rs61531703-STR-L、rs144136774-STR-L、rs149398657-STR-L、rs367718919-STR-L，共计4个DIP-STR位点，单独DNA测试的母亲在上述4个位点中的DIP-STR等位基因均为缺失，而单独DNA测试的父亲在上述4个位点中的DIP-STR等位基因均为插入，因此推测母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本中胎儿在上述4个位点中显示出的插入等位基因均来自父亲。

rs35938841-STR-S、rs142964199-STR-S，共计2个DIP-STR位点，单独DNA测试的母亲在上述2个位点中的DIP-STR等位基因均为插入，而单独DNA测试的父亲在上述2个位点中的DIP-STR等位基因均为缺失，因此推测母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本中胎儿在上述2个位点中显示出的缺失等位基因均来自父亲。

进一步的数据比对发现，如表14所示，母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本中胎儿在上述6个位点的等位基因大小，均与单独DNA测试的父亲的等位基因大小保持一致，也即证明本发明成功从混合样本中检测出了低含量的样本基因型。通过DIP-STR位点检测实验数据分析可知该胎儿基因型与父亲均能一一匹配，证明父亲为胎儿的亲生父亲，也与真实情况一致。

表14

实施例9对编号为1247家系(肯定)母血分型样本中胎儿游离DNA的基因分型图

家系1247中母亲、胎儿、父亲的DNA来源于自愿者捐献的血液样本经chelex-100法提取获得，母亲DNA样本用“M”代替，胎儿DNA样本用“C”代替，而父亲DNA样本用“F”代替。实验具体步骤与“实施例2”中相同。基因分析图谱如图10所示，其中L和S分别表示使用的是L或S引物，第一栏表示母亲单独DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第二栏表示母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第三栏表示父亲DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因。

图10中显示rs5825451-STR-L、rs34481125-STR-L、rs36081697-STR-L、rs78064473-STR-L、rs145423446-STR-L，共计5个DIP-STR位点，单独DNA测试的母亲在上述5个位点中的DIP-STR等位基因均为缺失，而单独DNA测试的父亲在上述5个位点中的DIP-STR等位基因均为插入，因此推测母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本中胎儿在上述5个位点中显示出的插入等位基因均来自父亲。

rs10577638-STR-S、rs149398657-STR-S，共计2个DIP-STR位点，单独DNA测试的母亲在上述2个位点中的DIP-STR等位基因均为插入，而单独DNA测试的父亲在上述2个位点中的DIP-STR等位基因均为缺失，因此推测母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本中胎儿在上述2个位点中显示出的缺失等位基因均来自父亲。

进一步的数据比对发现，如表15所示，母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本中胎儿在上述7个位点的等位基因大小，均与单独DNA测试的父亲的等位基因大小保持一致，也即证明本发明成功从混合样本中检测出了低含量的样本基因型。通过DIP-STR位点检测实验数据分析可知该胎儿基因型与父亲均能一一匹配，证明父亲为胎儿的亲生父亲，也与真实情况一致。

表15

实施例10对编号为1066家系(否定)母血分型样本中胎儿游离DNA的基因分型图

家系1066中母亲、胎儿、疑父的DNA来源于自愿者捐献的血液样本经chelex-100法提取获得，母亲DNA样本用“M”代替，胎儿DNA样本用“C”代替，而疑父DNA样本用“F”代替。实验具体步骤与“实施例2”中相同。基因分析图谱如图11所示，其中L和S分别表示使用的是L或S引物，第一栏表示母亲单独DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第二栏表示母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第三栏表示疑父DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因。

图11中显示，rs36081697-STR-L、rs67480455-STR-L，共计2个DIP-STR位点，单独DNA测试的母亲在上述2个位点中的DIP-STR等位基因均为缺失，而单独DNA测试的疑父在上述2个位点中的DIP-STR等位基因均为插入，推测母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本中胎儿在上述2个位点中显示出的插入等位基因均来自胎儿亲生父亲。

rs10647255-STR-S、rs111478323-STR-S、rs142657156-STR-S、rs145423446-STR-S，共计6个DIP-STR位点，单独DNA测试的母亲在上述4个位点中的DIP-STR等位基因均为插入，而单独DNA测试的疑父在上述4个位点中的DIP-STR等位基因均为缺失，推测母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本中胎儿在上述4个位点中显示出的缺失等位基因均来自胎儿亲生父亲。

进一步的数据比对发现，如表16所示，母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本中胎儿在上述6个位点的等位基因大小中，2个位点与单独DNA测试的疑父的等位基因大小保持一致(图11a)，4个位点不一致(图11b)，也即证明本发明成功从混合样本中检测出低含量的样本基因型。通过DIP-STR位点检测实验数据分析可知该胎儿基因型与疑父不能完全匹配，证明疑父不是该胎儿的亲生父亲。

表16

实施例11对编号为1242家系(否定)母血分型样本中胎儿游离DNA的基因分型图

家系1242中母亲、胎儿、疑父的DNA来源于自愿者捐献的血液样本经chelex-100法提取获得，母亲DNA样本用“M”代替，胎儿DNA样本用“C”代替，而疑父DNA样本用“F”代替。实验具体步骤与“实施例2”中相同。基因分析图谱如图12所示，其中L和S分别表示使用的是L或S引物，第一栏表示母亲单独DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第二栏表示母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因，第三栏表示疑父DNA样本在该DIP-STR位点的等位基因。

图12中显示，rs36081697-STR-L、rs71150206-STR-L、rs78064473-STR-L、rs10569326-STR-L、rs35105135-STR-L、rs139483687-STR-L，共计6个DIP-STR位点，单独DNA测试的母亲在上述6个位点中的DIP-STR等位基因均为缺失，而单独DNA测试的疑父在上述6个位点中的DIP-STR等位基因均为插入，推测母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本中胎儿在上述6个位点中显示出的插入等位基因均来自胎儿亲生父亲。

rs111478323-STR-S、rs10577638-STR-S，共计2个DIP-STR位点，单独DNA测试的母亲在上述2个位点中的DIP-STR等位基因均为插入，而单独DNA测试的疑父在上述2个位点中的DIP-STR等位基因均为缺失，推测母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本中胎儿在上述2个位点中显示出的缺失等位基因均来自胎儿亲生父亲。

进一步的数据比对发现，如表17所示，母亲外周血提取的含有母亲和胎儿混合DNA样本中胎儿在上述8个位点的等位基因大小中，4个位点与单独DNA测试的疑父的等位基因大小保持一致(图12a)，4个位点不一致(图12b)，也即证明本发明成功从混合样本中检测出了低含量的样本基因型。通过DIP-STR位点检测实验数据分析可知该胎儿基因型与疑父不能完全匹配，证明疑父不是该胎儿的亲生父亲。

表17

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大法医科技有限公司

<120> 用于同时分析多个DIP和STR位点的复合扩增系统、方法、试剂盒及其用途

<130> 19I28483

<160> 138

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcccaaacg ttaagttcat gagtctctg 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcccaaacg ttaagttcat gagtctgtc 29

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atcccagtgt aaattagatc acagag 26

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttaggacag gctgggcttg actctgag 28

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cttaggacag gctgggcttg actctggtc 29

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcacaaaccc tagggttcag acgatg 26

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gccttagtaa tcttgggtaa gaaccaagag cat 33

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gccttagtaa tcttgggtaa gaaccaattt cc 32

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tccacagagg tacttgtgtc accac 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggggtgggaa ggagattgag tagta 25

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggggtgggaa ggagattgag taagat 26

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcacttggca tgcaatcatt tcagaagc 28

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

caaaacacca tagcctagaa ctccc 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caaaacacca tagcctagaa cctgc 25

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gacaccgagc tgagtctgtt tacggat 27

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cccagcaaaa tgtacaaaca cgtatagtat 30

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cccagcaaaa tgtacaaaca cgtatttt 28

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

acttctgttg tcttgattct ggacaggc 28

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cacatacaca tatatacaca acttaaac 28

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cacatacaca tatatacaca aaccac 26

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tgcatgcatg tatatacaca gtacatac 28

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gtgcaaatgg aaagtgggtt ggcaataag 29

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gtgcaaatgg aaagtgggtt ggcaatgtt 29

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atgtgcatgt gtacatatgt tatctatttg 30

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gaattcatca ctgaatctat taggttt 27

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aggaattcat cactgaatct attagtc 27

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ctccaaaact gcatcaacga 20

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

actccagact gggcgacaga gtgag 25

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

actccagact gggcgacaga gactc 25

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

actacttgtg cccattgctt tctcct 26

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gaacatcaga aggcattaac tactgactt 29

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gaacatcaga aggcattaac ttccat 26

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gcttcctgtg ctcagtagca gtgtcac 27

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

ggaagcgcag aagaccctta cttacg 26

<210> 35

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ggaagcgcag aagaccctta cgatgc 26

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gctgcccatt ttggatttgt ctaatcc 27

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

cccatgtaga aatgtgaaat gat 23

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

ccatgtagaa atgtgaaatg agag 24

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

cctggcaaat agagtgagat g 21

<210> 40

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gcataaactc aaaagtccaa actccagag 29

<210> 41

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gcataaactc aaaagtccaa actccagtc 29

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ctgtcttggg atgatagcac cttgag 26

<210> 43

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gccaatccac aaaactgtga agctaag 27

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gccaatccac aaaactgtga aggtg 25

<210> 45

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ggagacttat ttagttaact ggatggcag 29

<210> 46

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

tgctgggtaa ggatggtggg attacct 27

<210> 47

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

tgctgggtaa ggatggtggg attatag 27

<210> 48

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

acagatgctg atgcatatga aagggcc 27

<210> 49

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gtcatatgta tctctctaag tcattagc 28

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

gtcatatgta tctctctaag tcattaaata 30

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tcacactctc tgacctacaa attc 24

<210> 52

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gctcaacttt tccccttaat tgtatgtag 29

<210> 53

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

gctcaacttt tccccttaat tgtagattc 29

<210> 54

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

cattcctggt tgatgaagcc aataac 26

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

ggaacatggg gttgaagtaa atgaaagagc 30

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

ggaacatggg gttgaagtaa atgaaagctc 30

<210> 57

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

tgttccagag agcaccagcc acaaatgtg 29

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

catggtgaaa ttgtttcaaa cttagtcagt 30

<210> 59

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

catggtgaaa ttgtttcaaa cttagtagg 29

<210> 60

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

cttgagctca gtgcagggta cacaggtg 28

<210> 61

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

ccagtctgtg ttcttatttc gcagagggt 29

<210> 62

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

ccagtctgtg ttcttatttc gcagagtct 29

<210> 63

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

cagcaaccag ttgcaatgtt tagacc 26

<210> 64

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

cgtgtgactg accagttctc tcctcct 27

<210> 65

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

cgtgtgactg accagttctc tcctttg 27

<210> 66

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

cagctgctta cttgatgtat tca 23

<210> 67

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

gttgccttta aataagcatt atacactcat at 32

<210> 68

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

gttgccttta aataagcatt atacactcat gac 33

<210> 69

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

cagaatatgc acacgtaaga ttcaagac 28

<210> 70

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

ccacttttgg ctataagcat aatg 24

<210> 71

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

ccacttttgg ctataagcat gctg 24

<210> 72

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

ggtcctctgt taaggaagtg aggtc 25

<210> 73

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

gcactataat gtcaggtgtg agtagtt 27

<210> 74

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

gcactataat gtcaggtgtg agtatgg 27

<210> 75

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

gtttgctgcc tcaaagtctt agg 23

<210> 76

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

cagtttatgc cgatttaatc cagcc 25

<210> 77

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

cagtttatgc cgatttaatc tgggg 25

<210> 78

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

gcctcaggta ttcctttata acagg 25

<210> 79

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

ctcaccttta taactctcac agcctaaag 29

<210> 80

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

ctcaccttta taactctcac agcctagct 29

<210> 81

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

ccaacaatgt ggatctactt tgtcac 26

<210> 82

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

ggtactgcac atgttattag cttaatcaag 30

<210> 83

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

ggtactgcac atgttattag cttaagccat 30

<210> 84

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

gtatatatgt gcgtgtatat atgtgcg 27

<210> 85

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

ggggatgatc aaataacttc ttctattg 28

<210> 86

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

ggggatgatc aaataacttc tattgttc 28

<210> 87

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

ctgttgctga tgattctctc catcc 25

<210> 88

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

tcattataag aaaaaataat tgcacacatg 30

<210> 89

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

tcattataag aaaaaataat tgcacacgtt 30

<210> 90

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

catgcattca ggttgctgtg aatgtc 26

<210> 91

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

cttcagcagc aggctcattt gaaggcagac 30

<210> 92

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

cttcagcagc aggctcattt gaaggcactc 30

<210> 93

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

gcaatgagaa atgtctgtcc accgagg 27

<210> 94

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

gtaaggatca ttaagggatt tgagtttc 28

<210> 95

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

gtaaggatca ttaagggatt tgagttat 28

<210> 96

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

ggtagccatt ttaattctca ggaac 25

<210> 97

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

ctgacttcca ggtagctgcc ttc 23

<210> 98

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

ctgacttcca ggtagctgtc att 23

<210> 99

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

agttaatgag gtctcaagag tg 22

<210> 100

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 100

gcagcttgct gatgacagat catagaac 28

<210> 101

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 101

gcagcttgct gatgacagat catagctt 28

<210> 102

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 102

gctctattat ggtagtctgg aact 24

<210> 103

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 103

caaaataggt atggatgcca catg 24

<210> 104

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 104

caaaataggt atggatgcca cgag 24

<210> 105

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 105

cagtccctgg caagcatgaa tttac 25

<210> 106

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 106

ggagaaacaa aagtagatct ttcaaattaa ag 32

<210> 107

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 107

ggagaaacaa aagtagatct ttcaaagact 30

<210> 108

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 108

gccagggttt ttagaaccta tttaaatgg 29

<210> 109

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 109

cctaagaggg tgtatgaatc tcactcatc 29

<210> 110

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 110

cctaagaggg tgtatgaatc tcaatctgg 29

<210> 111

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 111

ctaggttcaa tgactaaagc ccat 24

<210> 112

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 112

gcaccacaca ccacactcaa g 21

<210> 113

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 113

gcaccacaca ccacactcga c 21

<210> 114

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 114

gatttgtgca tgtctgtatg atgtgc 26

<210> 115

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 115

gctgaggcag gaggattcac ttgaac 26

<210> 116

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 116

gctgaggcag gaggattcac acccag 26

<210> 117

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 117

ccattatgca aactagggtt acc 23

<210> 118

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 118

cacccacaca tactaacact caaag 25

<210> 119

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 119

cacccacaca tactaacact cagac 25

<210> 120

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 120

agtgtgggtg agagcatacg tgactg 26

<210> 121

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 121

ggcaggaaat atagataata ctttctatg 29

<210> 122

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 122

ggcaggaaat atagataata ctttctgag 29

<210> 123

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 123

gcaggagctc tgtccagttc ttgac 25

<210> 124

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 124

aggccgaggc aggagtatca cttgaac 27

<210> 125

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 125

aggccgaggc aggagtatca ctacc 25

<210> 126

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 126

tgtctcttcc tagagaaccg agagc 25

<210> 127

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 127

gtctgtctat ctatccatcc atccatctat 30

<210> 128

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 128

gtctgtctat ctatccatcc atccatcatc 30

<210> 129

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 129

ggatcctagt tatcacctac attagtc 27

<210> 130

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 130

gtaatatgct gttccactcc cctgtactct 30

<210> 131

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 131

gtaatatgct gttccactcc cctgtacgcc 30

<210> 132

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 132

catatcacct tcatggaaag gtaagac 27

<210> 133

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 133

tactcgggag gctgaggcag gagaat 26

<210> 134

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 134

tactcgggag gctgaggcag aattgc 26

<210> 135

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 135

ccacaacagt ggctctgaat ataagagc 28

<210> 136

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 136

aaagaattgg tttagagagt cttctta 27

<210> 137

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 137

aattggttta gagagtcttc tcctta 26

<210> 138

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 138

caggcctatc actacacatg c 21