一种共表达小反刍兽疫病毒H和F蛋白的重组山羊痘病毒

摘要

本发明提供一种用于重组山羊痘病毒构建的重组转移载体。所述的转移载体主要包含：TK基因的左臂和右臂、两个逆向的p7.5K启动子及其分别调控的小反刍兽疫病毒H基因和F基因、p11K启动子、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因、两个顺向Loxp序列。所述的转移载体与山羊痘病毒在羊睾丸细胞内发生同源重组，获得表达eGFP的重组山羊痘病毒，在Cre酶作用下，eGFP基因被特异性敲除，获得潜在共表达小反刍兽疫病毒H和F蛋白的重组山羊痘病毒。

说明书

技术领域

本发明属于重组病毒构建技术领域，具体涉及一种共表达小反刍兽疫病毒H和F蛋白的重组羊痘病毒。

背景技术

小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)，是一种由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)感染所引起的急性或亚急性传染病，现为国际动物卫生组织(OIE)必须通报疫病。该病通过直接或间接接触传播，以呼吸道和消化道为主要感染途径，病原可通过眼鼻口分泌物及飞沫传播。该病最易感染绵羊和山羊，而山羊比绵羊、新生羊比成年羊更易发病，发病率较高，急性感染的死亡率可达100％。

PPRV属副粘病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)成员。PPRV基因组为不分节段的单股负链RNA，全长15948nt。PPRV H基因开放阅读框(ORF)全长1830nt，编码病毒的H蛋白。该病毒全长609aa，分子质量约为68kD，属于II型糖蛋白。

成熟病毒粒子的H蛋白是由二硫键连接的两个同源二聚体，从而形成了一个铆钉样结构的四聚体，镶嵌在病毒囊膜表面。PPRV F基因较为保守，由2411nt构成。F蛋白由546个aa构成，分子质量约59kD。

成熟病毒粒子的F蛋白前体(F0)的104～108aa为蛋白水解区域，F0在该区域将被水解为由二硫键连接的F1和F2，其氨基酸切割位点及细胞蛋白酶的切割能力决定了病毒的毒力。PPRV的H和F蛋白是病毒的免疫保护性蛋白，在体内可诱导理想的免疫保护作用。

山羊痘病毒(goatpox virus,GTPV)属于痘病毒科(Poxviridae)、羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员。GTPV基因组为两端共价闭合、线性双股DNA，对外源基因容纳性较高，若经适当修饰，可成为理想的活疫苗载体。胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因是痘病毒复制的非必需基因，因此作为同源重组基因广泛用于重组GTPV构建。外源抗原基因插入至TK基因会破坏其表达，但不显著影响重组GTPV的复制。若外源蛋白能在体内表达且诱导理想的免疫保护作用，重组病毒将是潜在的活疫苗候选株。

发明内容

本发明提供一种共表达小反刍兽疫病毒H和F蛋白的重组羊痘病毒GTPV，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种用于重组山羊痘病毒构建的重组转移载体，所述的重组转移载体携带氨苄青霉素抗性基因，还包含有如下的作用元件：TK基因的左臂(TK

所述的重组转移载体H和F基因上游皆为p7.5K启动子，下游皆为“ATTTTTAT”早期转录终止信号。

筛选标记marker为eGFP基因，受p11K启动子调控，使后期筛选更为便捷。eGFP基因和p11K启动子两端为两个顺向Loxp序列。

所述的重组转移载体，其一种具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；

本发明另一个方面还提供种共表达小反刍兽疫病毒H和F蛋白的重组羊痘病毒GTPV，是将上述的重组转移载体转移到永生化羊睾丸(GT)细胞内，通过TK基因左右同源臂与亲本GTPV发生同源重组，借助于eGFP筛选marker的指示作用，通过连续多次噬斑纯化，获得含H、F及eGFP基因的重组山羊痘病毒(GTPV-HF-eGFP)。GTPV-HF-eGFP在细胞内Cre重组酶作用下，特异性敲除筛选marker，通过几轮噬斑纯化，筛选到潜在共表达H和F蛋白的重组GTPV(GTPV-HF)。

附图说明

图1：重组转移载体pLSEG-HF模式图。

图2：GTPV-HF-eGFP噬斑纯化。a：绿色荧光噬斑；b：亮场对照。

图3：F3/R3上下游引物退火位点。

图4：第8代GTPV-HF-eGFP噬斑纯化后PCR鉴定。M：DNA Marker；G：GTPV-HF-eGFP。

图5：筛选marker敲除的测序鉴定。黄色阴影序列：单一Loxp序列。

图6：重组山羊痘病毒(GTPV-HF)和母源山羊痘病毒(GTPV)生长曲线的比较。

具体实施方式

本发明利用分子克隆及同源重组技术，构建了一种重组山羊痘病毒转移载体(pLSEG-HF)，利用该重组载体与母源GTPV的同源重组，获得带有筛选marker的重组病毒。利用Cre-Loxp重组技术，对筛选marker进行特异性敲除，最终获得一株潜在共表达PPRV H和F蛋白的重组GTPV。

作为实施例的一种具体记载，其中H和F蛋白为PPRV(GenBank:KX421388)中的H和F蛋白。

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

实施例1.重组山羊痘病毒转移载体pLSEG-HF的构建

所构建的pLSEG-HF模式图如图1所示。TK基因的左臂(TK

实施例2.GTPV-HF-eGFP的构建

在六孔细胞培养板中接种GT细胞，培养至80－90％致密单层，接种GTPV AV41疫苗株，37℃作用2h。按照每孔加入150μL无血清Opti-MEM和6μL Lipofectamine 2000的比例，配制溶液I；按照每孔加入150μL无血清Opti-MEM和3μg pLSEG-HF的比例，配制溶液II。将溶液II逐滴加入溶液I中，轻柔混匀，室温静置20min。在此期间，吸弃六孔板内病毒液，每孔加入1mL Opti-MEM，再逐滴加入孵育后的脂质体与pLSEG-HF混合液。37℃5％CO

实施例3.GTPV-HF-eGFP的纯化

采用连续噬斑纯化的方法将GTPV-HF-eGFP从亲本毒种群中分离出来。将重组后病毒液冻融2次，按10

实施例4.GTPV-HF-eGFP纯化后的PCR鉴定

GTPV-HF-eGFP经历连续8次噬斑纯化后，采用病毒核酸提取试剂盒提取病毒液总核酸，进行PCR检测。首先根据TK

实施例5.GTPV-HF-eGFP筛选marker的敲除

将表达Cre重组酶的质粒转染至GT细胞，通过G418连续筛选3代，获得表达Cre重组酶的GT细胞(GT-Cre细胞)。将GTPV-HF-eGFP接种GT-Cre细胞，置于37℃5％CO

实施例6.GTPV-HF的纯化及鉴定

采用连续噬斑纯化法将GTPV-HF从亲本毒种群(GTPV-HF-eGFP)中分离出来。将收获的GTPV-HF病毒液冻融2次，按10

实施例7.GTPV-HF生长曲线测定

将GT细胞同时接种多个35mm细胞培养皿，次日将GTPV-HF及亲本毒(GTPV AV41疫苗株)分别平行感染多个GT细胞(MOI＝0.1)。感染0,24,48,72和96h后，分别将对应培养皿连续冻融2次并收获病毒液，测定不同培养时间点的病毒滴度，绘制重组毒和亲本毒的生长曲线(图6)。结果表明，外源片段的插入，并未显著影响病毒在细胞内的生长动力学。

应该理解，尽管参考其示例性实施方案，对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种共表达小反刍兽疫病毒H和F蛋白的重组山羊痘病毒

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9533

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagcttttta ttagtgggtt acctaatact atgtactcaa aggaagcact atcattaaat 60

agacaaccga taacatataa atattgtaat gatcttttac aatcaataaa tggatcacag 120

caagtattta ttaacgatat tcttagaaaa tgatgactcc ttttttaaat acttatcaga 180

acaagatgat gaaacagcta tgtctgatat cgaaactatt gtaacatatt taaatttttt 240

attgtcattg ttaattagat caaaggataa attagagtcg ataggttatt attatgaacc 300

actgtctgaa gaatgtaaaa cattagttga tttttccaat atgaaaaatt ttaggatatt 360

atttaataag attcctataa atatactaaa taaacaaata actgtaaata aagggtactt 420

atcagatttt gttacgacat tgatgagatt aaaaaaagaa ctttttttag aatcaccaga 480

gccgataaca tatatagacc ctagaaaaga tccaacattt ttaaacattt tatcaatatt 540

gcacgaaaat aattgaacaa atatttttta aaaaaaaatg gactatggat atatacattt 600

aattatagga cctatgtttt ctggcaaaag tactgaattg ataagaatag ttaaaagtat 660

gcccggtagt tgcgatatac ataaactgat cactaattcc aaacccaccc actttttata 720

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atattctaat ttattgcacg gtaaggaagt agaatcataa agaacagtca gatctggatc 840

tgcagggatc caccatgtcc gcacaaaggg aaaggatcaa tgccttctac aaagacaatc 900

ctcacaataa gaaccatagg gtgatcctgg atagagaacg cttggtcatt gaaagaccct 960

acatcttgct tggagtcctg ctggtaatgt tcctgagtct aatcggactg ctggccattg 1020

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ccaatattaa gttgaccgaa tctattgatc accagactaa ggatgtctta actccccttt 1140

ttaaaatcat tggcgatgaa gtcggcatca gaattccaca gaaattcagt gatcttgtca 1200

agttcatctc cgataagatt aaattcctca accctgatag agagtatgat ttcagggatc 1260

tccggtggtg catgaatccc cccgagagag tcaaaattaa ttttgatcag ttttgtgagt 1320

acaaagctgc ggttaagtca attgaacata tatttgagtc accactcaac aagtcaaaaa 1380

agctgcaatc attgactctc gggcccggaa caggctgtct aggcaggaca gtaacaaaag 1440

ctcatttctc agaacttaca ctgaccttaa tggacctgga tctagagatg aagcacaacg 1500

tgtcctcagt gtttaccgta gttgaagagg ggttattcgg aagaacatat accgtctgga 1560

gatccgatgc cagggatccg agcaccgatc taggtatcgg ccatttttta agagtcttcg 1620

agattggact gataagagat ctcgggctgg gtccccctgt ttttcatatg accaactatc 1680

tcacagtgaa catgagtgat gactatcgga gatgtctttt agcggtaggg gagttgaagt 1740

tgacagccct atgcacctca tctgagactg tgacactgag tgagagagga gctccaaaga 1800

gggagcctct tgtggttgtg atacttaatc tggctggacc cactctaggg ggcgaactat 1860

acagtgtctt gcctacctcc gatctcatgg tggagaaact ctatttatct tcacatagag 1920

ggatcatcaa ggatgacgag gccaattggg tagtgccgtc taccgatgtt cgtgatcttc 1980

agaacaaagg tgaatgtctg gtggaagcat gcaagactcg acctccttca ttttgcaatg 2040

gcacaggatc aggcccgtgg tcagagggga gaatccctgc ttacggggtg atcagggtca 2100

gtcttgactt agctagtgac ccggatgtag ttatcacttc agtgtttggc ccactgattc 2160

ctcacctatc cggcatggat ctttacaaca acccgttttc aagagctata tggttggctg 2220

taccacctta tgagcagtca tttctaggaa tgataaatac aattggattc cctaacagag 2280

cagaggttat gccgcacatt ttgaccacag agatcagagg ccctcggggt cgttgccatg 2340

ttcccataga attgtcccgc agggttgatg acgatatcaa gatcgggtcc aacatggtca 2400

tattgccgac gatggacctg aggtatatta cagccactta tgatgtttcc aggagcgagc 2460

atgcaatcgt gtactatatc tatgacacag gtcgctcatc atcttacttc tacccagttc 2520

gactgaattt caaaggcaat cctctctctc tgaggataga gtgtttccct tggcgtcata 2580

aggtgtggtg ctaccatgat tgtcttatat acaacaccat aacagatgaa gaggtccata 2640

cgagagggct gaccggtata gaggtaacat gcaatccagt ttgaattttt atgcggccgc 2700

ggcctatatg gcccggtccg gttaactacg tagacgtcga ggatttcgcg tgggtcaatg 2760

ccgcgccaga tccacatcag acggttaatc atgcgatacc agtgagggat ggttttacca 2820

tcaagggccg actgcacagg cggttgtgcg ccgtgattaa agcggcggac tagcgtcgag 2880

gtttcaggat gtttaaagcg gggtttgaac agggtttcgc tcaggtttgc ctgtgtcatg 2940

gatgcagcct ccagaatact tactggaaac tattgtaacc cgcctgaagt taaaaagaac 3000

aacgcccggc agtgccaggc gttataaaaa ttacagtgat ctcacgtacg actttgaggt 3060

cccggtcaga tcgggtttga gccctgggtt gattttggag atagggattt ccttgttctt 3120

acacctcccc ttacagcagc atattaatgt gacaagccct agggatactc caatgcaagc 3180

tgccagtgct atgtacatgt tcccgccgaa aggtgcccct ttgacagtct tcagtatttg 3240

gtctgatgca tctaggagct cctttgcatt ctccagtctt gtgactgcat tgcctaaatt 3300

ggtgcctaca tccagttttt ctagggagat ggctggacct aagtctattt tgtgtaagta 3360

tacagaatcc ggatactctc gactgccgac ctgtattgtc actccatcca cctcaactac 3420

aggacacttg tcggatgcta caacagttag tagtttgtca ggatcttggc tgatgactgt 3480

ctccgttgtg taacatttgc acaaaactga cgcacaattt gcaatcaggt tcccttttga 3540

taggataaat ctattactta tggtccctga aactagggtt ctggcgcacg attttgttga 3600

tcccctgaaa cattcctgaa gcaatgggct cattgggtac aacgcattct ggctgcaaac 3660

tgtcccctct ggagtgaata cgcatgacgt ctcatcaaag ttcgatatca gatacccctg 3720

agtggctaca tatttaggga tagtagtata ccactcctgt gccccaatgt tgtatgttat 3780

agcttctatc ttgtgaacta tcactccctt gatctcagat aaggttgggt aggcgatgct 3840

aaggattata aagtaatctc ttgtgtccac atatgtaacc cgggccttta ttcccttgct 3900

ctctaggatg gcaaggaaat ccccaccgct atacccaagc ttgtccagga ttttattaat 3960

gtctccgcct aatgcataac tgagtgcctg gatcgatatt tcggcagcta tcgggtctcg 4020

aaggctgggc ccgaatatgg acaggatctc ggtgtagtac ctaaggagct tgaggccgag 4080

cttgtggcct accagctcgc atgacattct atgaacagaa gggacaagct cattgttgat 4140

ataatcctgg acgccctgta ctgccagtat ggtctcctta tttgcaagtc tgatttcttc 4200

tattgcctga ttcgacttct caagactggt ttttaaactc tcaattgctt gagagttcat 4260

caatgattga tgaagagcga ctcctgcagt tatctgagcg gctgtcgcaa ctccaagtgc 4320

tactccggcc agaacagctc cagcaaaacg acgggttcta cgcccaggtg tcagggtttg 4380

aattggtctt acattcttgg ttatcaccga cagagcatcc tctacaggtt ttaacactgt 4440

gatcagcaat ctcttgtact ctgcaatctc tgactttgta caattgttga tggctgttat 4500

atttggcatt aactttataa ccagagtttg gtggcttggc ctagtcatca ccttgtagct 4560

ggcactccct gttcctacaa tcccgatctt ggatagattg ccccagtgaa tctggcacgc 4620

aacaacattt gggagaagaa acagaaatgt caagattgcg acccgtgtca tggtggcatc 4680

tcgcaagcct gtcttgtgtc caagcttggg ggatcgatcc gtcactgttc tttatgattc 4740

tacttcctta ccgtgcaata aattagaata tattttctac ttttacgaga aattaattat 4800

tgtatttatt atttatgggt gaaaaactta ctataaaaag cgggtgggtt tggaattagt 4860

gatcagttta tgtatatcgc aactaccggg caataacttc gtatagcata cattatacga 4920

agttattatg ataaaaagtc gacttaatta attaggcctc tcgagcctag taagaaatat 4980

aaagaagaat atcccattgt taacataaac accataaagc gttattacga aataaaagat 5040

tcaaaaatga catgtataaa ttttgaatca cctataagtg attatgatca agtaaattat 5100

ttaaaagatt acataaatat aagtgatgat tattatctgt atgacggatc gatccagatc 5160

ggggaattcc gatcctagaa gcgatgctac gctagtcaca atcaccactt tcatatttag 5220

aatatatgta tgtaaaaata tagtagaatt tcattttgtt tttttctatg ctataaatga 5280

attccgaagc catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg 5340

tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg 5400

atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc 5460

cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg 5520

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gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca 5700

tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca 5760

agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg 5820

tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc 5880

ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg 5940

atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc 6000

tgtacaagtc cggactcaga tccaccggat ctagataact gatcataatc agccatacca 6060

catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac 6120

ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 6180

aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 6240

gtttgtccaa actcatcaat gtatcttaac gcgactaata acttcgtata gcatacatta 6300

tacgaagtta tgaattcaaa tagcgcagta taaatgctgt gtagtaaaat acttaaaaga 6360

tatccgatat ggtaattctg tgtatacaca tgataataac catgtatctg ccatatcaac 6420

aactttatta tatgacgtcg ttgataaaat tatgaatttc gacattatag gtatagatga 6480

agggcaattt tttaaagata ttgtatcttt ttctgaaaat atggcaaata tgggaaagat 6540

aattataata gctgcactag atagcacgtt tcaacgaaaa gaatttaatg atatattgaa 6600

attgataccg ttatctgaaa aagtaacaaa attaaacgct gtatgtatgg aatgttataa 6660

agacgccgca ttttctaaga ggatcactaa agaaaaggaa atagaactca tcgggggtaa 6720

agaaaaatat aaatctgttt gtaggaaatg ttatttttta gaataataaa tattaatgaa 6780

aaaaaatcaa aaaaaagtga tctatttact tattaaacta tatagttaat aagtaaaatg 6840

ggtatcagac acgagttaga tattttgctt gtttctgaaa atctcgcact gaagaatgtt 6900

gaacttctta aaggtgatag ttatggatgt actattaata taaaagttaa tcaacaaaaa 6960

aaattggatt ttattattat attacggccc gattggacag aggtaaggaa tgttaaaaaa 7020

ataaatatgg tatgtaacgg tgttgttatt gatacaacac taattaaaaa atctttttac 7080

gaagaagtat attcatcatc tgtaacagtt tttcaaaata ctaccgttga attttttagt 7140

gatactagta agaaatataa agaagaatat cccattgtta acataaacac cataaagcgt 7200

tattacgaaa taaaagattc aaaaatgaca tgtataaatt ttgaatcacc tataagtgat 7260

tatgatcaag taaattattt aaaagattac ataaatataa gtgatgatta ttatctgtat 7320

gacgaattaa ttcttgaaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg 7380

tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 7440

cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 7500

cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 7560

tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 7620

tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 7680

atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 7740

gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 7800

aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 7860

aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 7920

gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 7980

cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 8040

atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 8100

tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 8160

ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 8220

ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 8280

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tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 8460

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tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 8640

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tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 8820

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acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 9060

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ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 9180

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attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 9300

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tacaactctc cattcaccat aatcatcttt gacctctaca attccaccat caggtttgat 9480

gctggaattt gaaacaaata aagtaccgcc aagatcaggg tcaatttttt tta 9533