一种载有核酸分子的酸响应聚合物修饰的铋单质纳米片及其制备方法和应用

摘要

本发明公开一种同时具有热疗联合免疫治疗、多种成像功能以及具有酸响应功能，可以载带核酸分子，可以代谢的铋单质纳米药物的制备方法，该纳米药物为一种酸响应聚合物修饰的载带核酸分子的铋单质纳米片。该纳米片既可用于光热联合免疫治疗及CT成像，同时作为二维材料具有较大的比表面积，提高了载药率，并且由于元素较为单一，生物安全性更高，为后续的生物医学应用提供了保障。在肿瘤微酸环境中，通过激光照射产生温和的热控制释放核酸分子，与此同时，温和的热一方面引发肿瘤免疫原性死亡，促进DC细胞成熟及T细胞免疫反应，另一方面通过EPPR效应促进纳米材料在肿瘤部位的聚集和渗透，解决了ICB疗法的局限性。此外，该纳米材料可代谢出体外，为纳米药物在临床的推广提供了一个安全的平台。这种具有诊疗一体化且安全的纳米药物，克服了传统肿瘤诊疗方法的缺陷，适合应用于有复杂需要的肿瘤诊断和治疗。

说明书

技术领域

本发明属于药物领域，具体涉及一种载有核酸分子的酸响应聚合物修饰的铋单质纳米片及其制备方法和在肿瘤诊断及治疗中的应用。

背景技术

尽管在过去的几十年中，人类对癌症的认知和攻克取得了长足的发展，癌症却依然是影响人类健康和寿命的主要疾病。世界卫生组织发布的《全球癌症报告2014》中指出“全球面临癌症大暴发，中国发病率第一”。全国肿瘤登记中心指出，2012年我国新增300多万癌症患者，每年约250万人死于癌症。如此之高的发病率和死亡率很大程度上是因为传统的癌症治疗方法效果差，毒副作用大以及不能实现可视化监测等。肿瘤热疗的方法已经被证明能够有效地提高癌症的治疗效果。近几年来研究表明，温和的热一方面可以促进药物在肿瘤部位的聚集和渗透，一方面通过诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡，释放损伤相关模式分子(DAMPs)，比如CALR(calreticulin)、ATP以及HMGB1(High-mobility group box1)，促进肿瘤相关淋巴结内DC细胞成熟，进而促进T细胞在肿瘤部位的浸润和功能，提升免疫疗法的疗效。

此外，癌症治疗的前期诊断以及治疗过程中的可视化监测对治疗效果有不可忽视的影响。成像技术不仅能够为癌症的综合诊断提供指导，监测治疗反应，针对癌症提供具有更高特异性和敏感性的方法，同时作为实时跟踪监测纳米粒子在体内代谢变化的有力武器。由于每种成像方式都有其独特的优势，因此，结合多种成像方式的多模态成像不仅可以充分利用每种成像方式的最优特征，同时也避免了它们的缺陷。

在带来治疗效果的同时，脏器积累产生的毒副作用大大阻碍了纳米药物的发展和应用。纳米粒子在动物体内积累会导致急性毒性，长期炎症反应，甚至纤维化和肿瘤。美国食品及药物管理局指出，注入人体的制剂应该在一个合理的时间范围内被清除。因此，诊疗一体化并且具有最佳的体内代谢的纳米药物是目前一个重要的研究任务。

发明内容

本发明的目的在于提供一种载有核酸分子的酸响应聚合物修饰的铋单质纳米片及其制备方法和在肿瘤诊断及治疗中的应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种基于铋单质的纳米药物，其中，所述纳米药物为酸响应聚合物修饰的载带核酸分子的铋单质纳米片。第二方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述纳米药物的制备方法，其中，该方法包括以下步骤：

(1)酸响应聚合物的制备

①将对甲酰苯甲酸，4-二甲氨基吡啶，N，N′-二环己基碳酰亚胺，聚(乙二醇)单甲醚按照一定比例溶于二氯甲烷中，室温反应一段时间，过滤溶液至澄清，将滤液旋蒸浓缩至一定体积，得到溶液A；

②将溶液A加至一定体积异丙醇中，冷冻过夜，收集沉淀，用异丙醇和乙醚洗涤，得到沉淀B，即醛基修饰的聚乙二醇(mPEG-CHO)；

③将沉淀B与支链聚乙烯亚胺PEI按照一定质量比在碱水(pH＝7.4)中搅拌反应一段时间，制备得到溶液C，即PEG修饰的PEI复合物mPEG-PEI。

(2)铋单质纳米片的制备

①将一定质量的硝酸铋溶于乙二醇中，制得溶液D。

②取硼氢化钠溶于乙二醇中，因硼氢化钠溶于乙二醇会产生大量的热，所以此步骤在敞口的烧杯中进行，得到溶液E；

③将溶液E滴入溶液D中，溶液由白色变为黑色，搅拌半小时后，离心弃掉上清，用水与乙二醇等体积混合的溶液洗沉淀，再用水洗后将合成的铋单质水溶液，密封4℃保存；

④将铋单质水溶液分散于少量的5％胆酸钠水溶液中，加入一定质量的带有负电荷的分子，采用湿法球磨(玛瑙珠)一定时间。

⑤继续用超声破碎仪处理球磨后的铋单质，在超声过程中保持冰浴，铋溶液中要继续加入5％胆酸钠的水溶液，防止氧化。将超声之后的铋单质水洗三次，冻干即可得到铋单质纳米片。

(3)酸响应聚合物包覆的铋单质纳米片的制备

①将酸响应聚合物与铋单质纳米片混合搅拌，离心水洗3次，得到酸响应聚合物修饰的酸响应铋单质纳米片(Bi@PP)。

(4)酸响应聚合物包覆的铋单质纳米片载带核酸分子

①将一定量的核酸分子与Bi@PP混合均匀，静置30min后离心取沉淀，得到载带核酸分子的Bi@PP。

4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述纳米粒子中酸响应聚合物、铋单质纳米片与核酸分子的质量比为25～50∶25～50∶1。

5、根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的酸响应聚合物mPEG-PEI产率为70～80％；

优选地，步骤(1)中①所述的对甲酰苯甲酸，4-二甲氨基吡啶，N，N′-二环己基碳酰亚胺，聚乙二醇摩尔比为10～20∶2∶5∶2。所述摩尔比例可以是10∶2∶5∶2、12∶2∶5∶2、15∶2∶5∶2、20∶2∶5∶2。限定四者的摩尔比是为了保证将mPEG和4-羧基苯甲醛通过酯键连接，合成mPEG-CHO，避免因某种试剂过多或过少而引起副产物的形成。

优选地，步骤(1)中①所述反应时间为10～30min。反应时间可以为10min、15min、20min、25min及30min。

优选地，步骤(1)中①所述溶液A的体积为10～30mL。所述体积可以为10mL、15mL、20mL、25mL、30mL。将滤液浓缩至一定体积是为了便于进行下一步的沉淀操作。

优选地，步骤(1)中②所述异丙醇的体积为50～100mL。所述体积可以为50mL、60mL、70mL、75mL、80mL、90mL、100mL。将异丙醇的体积限制在此体积是为了使mPEG-CHO充分沉淀，同时去除未反应的对甲酰苯甲酸。

优选地，步骤(1)中③所述沉淀B与PEI的质量比为1∶1～5。所述质量比可以为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5。将两者的质量比限制在一定范围是为了保证mPEG-PEI的顺利合成，同时减小PEI的毒性。PEI是一种阳离子聚合物，含有丰富的伯胺、仲胺、叔胺，具有优良的基因转染效率，常被用于基因转染实验。但PEI带有很强的正电荷，具有很强的破膜能力和细胞毒性，并且它很容易吸附血液中的蛋白而被快速清除。为了增加PEI的生物相容性，延长其体内循环时间，所以我们将其进行了可脱除的PEG修饰，以期达到扬长避短的目的。

优选地，步骤(1)中③所述的时间为10～60min。所述时间可以为10min、20min、30min、40min、50min、60min。

优选地，步骤(2)中③所述的溶液D与溶液E的摩尔比为1∶1～5。所述摩尔比可以为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5。将二者的摩尔比限制在此范围是为了使硝酸铋充分还原为铋单质。

优选地，步骤(2)中④所述的带有负电荷的分子可以为牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白(HSA)，11-巯基十一烷酸(11-MUA)。修饰此分子后，铋单质纳米片表面带有负电荷，才可利用静电作用进行酸响应聚合物的修饰。

优选地，步骤(2)中④所述的球磨时间为12h～24h。所述球磨时间可以为12h、15h、18h、20h、22h和24h。限制球磨时间在此范围是为了既要将铋单质破碎为纳米级尺寸，又要保证铋单质不被氧化。

优选地，步骤(2)中⑤所述的超声破碎仪的功率为100W～200W，超声时间为12h～24h。所述超声功率可以为100W、120W、150W、180W和200W。所述超声时间可以为12h、15h、18h、20h、22h和24h。超声功率和时间限定在这个范围之内是因为其影响最终产物的尺寸。

优选地，步骤(3)中①所述的的酸响应聚合物与铋单质纳米片的质量比为(0.5～2)∶1。所述质量比可以为0.5∶1、0.8∶1、1∶1、1.5∶1和2∶1。

优选地，步骤(4)中①所述的酸响应聚合物修饰的铋单质纳米片与核酸分子的质量比为20～50∶1。所述质量比可以为20∶1、25∶1、30∶1、40∶1和50∶1。将质量比控制在此范围是为了既要载有足够量的核酸保证后续肿瘤治疗的效果，又要控制纳米颗粒的尺寸不能过大。

优选地，步骤(4)中①所述的离心转速为8000～12000rpm。所述离心转速可以为8000rpm、9000rpm、10000rpm、11000rpm和12000rpm。控制离心速度在此范围是为了收集更多的最终产物。

优选地，步骤(4)中①所述的离心时间为10～30min。所述离心时间可以为10min、15min、20min、25min和30min。

优选地，步骤(4)中①所述的核酸分子可以为siRNA，mRNA，DNA。因为核酸分子带有负电荷，可以与酸响应聚合物中带正电的PEI发生静电作用，从而被载带在纳米片上。

作为优选技术方案，本发明所述的酸响应聚合物修饰的载有核酸分子的铋单质纳米片的制备方法包括如下步骤：

(1)酸响应聚合物的制备

①将对甲酰苯甲酸，4-二甲氨基吡啶，N，N′-二环己基碳酰亚胺，聚(乙二醇)单甲醚按照摩尔比10～20∶2∶5∶2溶于二氯甲烷中，室温反应10～30min，过滤溶液至澄清，将滤液旋蒸浓缩至10～30mL，得到溶液A；

②将溶液A加至50～100mL异丙醇中，冷冻过夜，收集沉淀，用异丙醇和乙醚洗涤，得到沉淀B，即醛基修饰的聚乙二醇(mPEG-CHO)；

③将沉淀B与支链聚乙烯亚胺PEI按照质量比1∶1～5在碱水(pH＝7.4)中搅拌反应，制备得到溶液C，即PEG修饰的PEI复合物mPEG-PEI。

(2)铋单质纳米片的制备

①将一定质量的硝酸铋溶于乙二醇中，制得溶液D。

②取硼氢化钠溶于乙二醇中，因硼氢化钠溶于乙二醇会产生大量的热，所以此步骤在敞口的烧杯中进行，得到溶液E；

③将溶液E滴入溶液D中，溶液D与溶液E的摩尔比为1∶1～5，溶液由白色变为黑色，搅拌半小时后，离心弃掉上清，用水与乙二醇等体积混合的溶液洗沉淀，再用水洗后将合成的铋单质水溶液，密封4℃保存；

④将铋单质水溶液分散于少量的5％胆酸钠水溶液中，加入一定质量的带有负电荷的分子，如牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白(HSA)，11-巯基十一烷酸(11-MUA)，采用湿法球磨(玛瑙珠)12h～24h。

⑤继续用超声破碎仪处理球磨后的铋单质，超声破碎仪的功率为100W～200W，超声时间为12h～24h。在超声过程中保持冰浴，铋溶液中要继续加入5％胆酸钠的水溶液，防止氧化。将超声之后的铋单质水洗三次，冻干即可得到铋单质纳米片。

(3)酸响应聚合物包覆的铋单质纳米片的制备

①将酸响应聚合物与铋单质纳米片按质量比为(0.5～2)∶1混合搅拌，离心水洗3次，得到酸响应聚合物修饰的酸响应铋单质纳米片(Bi@PP)。

(4)酸响应聚合物包覆的铋单质纳米片载带核酸分子

①将Bi@PP与核酸分子按照质量比为20～50∶1混合均匀，静置30min后离心取沉淀，离心转速为8000～12000rpm，离心时间为10～30min，得到载带核酸分子的Bi@PP/核酸分子。

第三方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述纳米药物在诊断和/或治疗肿瘤中的应用。

本发明提供的酸响应聚合物修饰的载有核酸分子的铋单质纳米片，具有诊断、热疗、免疫治疗和可代谢等多种功能，这些功能可以联合应用于肿瘤的诊断和治疗。

与现有的技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明制备的铋单质纳米片是一类片状纳米材料，具有较大的比表面积，对核酸分子的载带量高。因为元素较单一，Bi元素含量高，所以具有较好的CT成像效果和较好的生物安全性。

(2)本发明制备的铋单质纳米片可利用近红外吸收进行光热治疗(PTT)，PTT可以引起细胞免疫原性死亡(ICD)，促进DC细胞抗原的呈递和T细胞的渗透，改善免疫抑制微环境。

(3)本发明制备的铋单质纳米药物具有多种优良的成像功能：相较于临床使用的X射线断层扫描(CT)成像造影剂，铋具有更高的X射线衰减，因此本纳米药物具有优良的CT成像增强性质；核酸分子的载带可以同时进行荧光成像，二者结合诊断肿瘤的位置并监测治疗过程中的反应。

(4)本发明制备的铋单质纳米药物可以在光热响应和酸响应条件下在肿瘤富集，同时也可以较快地排出体外，大大提高了其安全性。本发明制备的纳米药物为无机材料在肿瘤诊断和治疗中的应用提供了安全保障。

附图说明

图1为实施例1中mPEG-CHO的核磁图谱；

图2为实施例1中铋单质纳米片的透射电镜图；

图3为实施例1中铋单质纳米片的原子力显微镜电镜图；

图4为实施例1中铋单质纳米片的紫外吸收光谱；

图5为实施例1中铋单质纳米片的X射线衍射图；

图6为实施例1中不同浓度的铋单质纳米片在同一激光功率照射下的升温曲线；

图7为实施例1中铋单质纳米片载带siRNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图8为4T1细胞对实施例1中制备的纳米材料的摄入图；

图9为Annexin V/PI染色法测试的4T1细胞经过实施例1中材料处理24h后的细胞活力图；

图10为实施例1中铋单质纳米片尾静脉给药后对荷瘤小鼠的荧光成像图；

图11为实施例1中铋单质纳米片尾静脉给药后对荷瘤小鼠的CT成像图；

图12为实施例1中铋单质纳米片尾静脉给药后，小鼠尿液及粪便中铋元素含量图；

图13为为实施例1中铋单质纳米片尾静脉给药后，小鼠主要脏器中铋元素含量图；

图14为实施例1中Bi@PP/siRNA经尾静脉给药及热疗后肿瘤的生长曲线图；

图15为实施例1中Bi@PP/siRNA经尾静脉给药及热疗后肿瘤组织中CRT蛋白的表达情况；

图16实施例1中Bi@PP/siRNA经尾静脉给药及热疗后肿瘤引流淋巴结中DC细胞成熟情况；

图17为为实施例1中Bi@PP/siRNA经尾静脉给药及热疗后荷瘤小鼠血清中炎症因子的表达。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为本发明的具体限制。

根据本发明的铋单质纳米片既可用于光热治疗及CT成像，同时作为二维材料具有较大的比表面积，提高了载药率，并且由于元素较为单一，生物安全性更高，为后续的生物医学应用提供了保障。在肿瘤微酸环境中，通过激光照射产生温和的热控制释放核酸分子，与此同时，温和的热一方面引发肿瘤免疫原性死亡，促进DC细胞成熟及T细胞免疫反应，另一方面通过EPPR效应促进纳米材料在肿瘤部位的聚集和渗透，解决了ICB疗法的局限性。此外，该纳米材料可代谢出体外，为纳米药物在临床的推广提供了一个安全的平台。这种具有诊疗一体化且安全的纳米药物，克服了传统肿瘤诊疗方法的缺陷，适合应用于有复杂需要的肿瘤诊断和治疗。

肿瘤的种类没有特别要求。例如可以应用的诊断和治疗的肿瘤包括：乳腺癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌等。

本发明中用到的激光器是飞秒掺钛蓝宝石脉冲激光器。实际治疗过程中并不限于这两种激光器。只要具有近红外波段的波长且功率足够材料升温的激光器都可以。

以下通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明不仅限于下述实施例，以下实施例所用到的试剂或测试仪器，如无特别说明，均为市售可以获得的。

实施例1

酸响应聚合物修饰的载带siRNA的铋单质纳米片的制备

(1)酸响应聚合物的制备

①将40mmol对甲酰苯甲酸(6g)，4mmol DCC(8.2g)，10mmol DMAP(1.2g)和4mmolmPEG(8g)溶于150ml二氯甲烷中，室温反应24h后，过滤溶液至澄清，将滤液旋蒸浓缩至20ml，得到溶液A；

②将溶液A加至80mL异丙醇中，冷冻过夜，收集沉淀，用异丙醇和乙醚洗涤，得到沉淀B，即醛基修饰的聚乙二醇(mPEG-CHO)；

③将沉淀B与支链聚乙烯亚胺PEI按照质量比1∶2在碱水(pH＝7.4)中搅拌反应30min，制备得到溶液C，即PEG修饰的PEI复合物mPEG-PEI。

(2)铋单质纳米片的制备

①将1mmol硝酸铋(0.395g)溶于20mL乙二醇中，制得溶液D。

②取5mmol硼氢化钠(0.189g)，溶于20mL的乙二醇中，因硼氢化钠溶于乙二醇会产生大量的热，所以此步骤在敞口的烧杯中进行，得到溶液E；

③将溶液E滴入溶液D中，溶液由白色变为黑色，搅拌半小时后，12000rpm离心5min弃掉上清，用水与乙二醇等体积混合的溶液洗沉淀1次，再用水洗2次后将合成的铋单质水溶液，密封4℃保存；

④将铋单质水溶液分散于少量的5％胆酸钠水溶液中，加入等质量的11-巯基十一烷酸(11-MUA)，采用湿法球磨(玛瑙珠)18h(9h后打开球磨仪再加入一些胆酸钠，避免氧化)。。

⑤继续用超声破碎仪处理球磨后的铋单质，超声破碎仪的功率为200W，超声时间为18h。在超声过程中保持冰浴，铋溶液中要继续加入5％胆酸钠的水溶液，防止氧化。将超声之后的铋单质水洗三次，冻干即可得到铋单质纳米片。

(3)酸响应聚合物包覆的铋单质纳米片的制备

①将mPEG-PEI与铋单质纳米片按质量比为1∶1混合搅拌，离心水洗3次，得到酸响应聚合物修饰的酸响应铋单质纳米片(Bi@PP)。

(4)酸响应聚合物包覆的铋单质纳米片载带核酸分子

①将Bi@PP与siRNA按照质量比为25∶1混合均匀，静置30min后离心取沉淀，离心转速为12000rpm，离心时间为20min，得到载带核酸分子的Bi@PP/siRNA。

实施例2

酸响应聚合物修饰的载带siRNA的铋单质纳米片的表征

取实施例1制备的mPEG-CHO进行核磁检测，图1为mPEG-CHO的1H-NMR谱，指认了各质子的化学位移。为了证明mPEG-d-PEI的酸响应性，我们将mPEG-d-PEI溶解在pH为6.5和7.4的D

取实施例1制备的的铋单质纳米片拍摄透射电镜图，如图2所示，可以看出，纳米片的粒径为110.61±15.79nm，具有良好的分散性。由图3的原子力显微镜结果得知，该纳米片的厚度不超过0.6nm。随后进行紫外吸收光谱分析，结果如图4所示。铋单质纳米片具有宽谱吸收。其X射线衍射结果如图5所示，Bi 4f被分割成了159.5和164.8eV两个峰，而160.2和165.5eV则源于Bi

随后对实施例1制备的Bi@PP纳米片进行激光照射升温分析，结果如图6所示，从图中可以看出，160μg/ml的材料采用LWRL808激光器以1W/cm

siRNA的载带实验：

利用Bi@PP载带siRNA，通过改变Bi@PP与siRNA的投料比，我们探究了siRNA的载药量。如图7所示，随着Bi投料量的增加，游离的siRNA逐渐减少，在Bi/siRNA质量比为25的时候，Bi@PP吸附了几乎所有siRNA，得到Bi@PP/siRNA。

实施例3

酸响应聚合物修饰的载带siRNA的铋单质纳米片的应用

图8表示4T1细胞对实施例1中制备的Bi@PP/siRNA的摄入情况，通过流式细胞仪测定，具体方法如下：

1)细胞培养

将鼠源乳腺癌细胞4T1培养于含有10％胎牛血清的DMEM或1640液体培养基中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养。

2)细胞摄入测定

将4T1细胞以6x 104的密度接种到6孔板，过夜培养后加入Bi@PP/siRNA(20nMsiRNA)，孵育12h，一组细胞利用LWRL808激光器以0.5W/cm2的功率照射5min，继续孵育24h，PBS洗3次。胰酶消化收集细胞后，200μLPBS重悬，利用流式细胞仪检测荧光强度。细胞摄入结果如图8所示，与对照组相比，实施例1制备的Bi@PP/siRNA经过光照更多地被肿瘤细胞摄入，说明激光照射促进细胞内吞及siRNA释放，而游离的free siRNA带有较多负电荷，且分子量较大，所以肿瘤细胞对其摄入远低于纳米颗粒组。

图9用于说明不同处理组对鼠源乳腺癌细胞4T1的杀伤作用。具体的方法如下：将4T1细胞以8x 104的密度接种到6孔板，过夜培养后，将细胞分为6组，Ctr，free siRNA，Bi@PP，Bi@PP/siRNA，Bi@PP+laser，Bi@PP/siRNA+laser组，各组加入材料后孵育12h，其中两个laser组细胞利用LWRL808激光器以0.5W/cm2的功率照射5min，继续孵育24h。胰酶消化收集细胞，PBS洗3次，加入Annexin V染料染色15min，PI染料染色10min，PBS洗1次，流式细胞仪检测细胞凋亡坏死情况。如图9所示，Bi@PP载体处理后，细胞活力与Ctr组相比没有明显变化，说明载体材料本身毒性很低。而照射激光后，Bi@PP+laser组有约40％细胞出现了凋亡坏死情况，Bi@PP/siRNA+laser则有约80％的细胞出现了凋亡坏死，说明激光照射一方面产生热量直接影响肿瘤细胞活性，另一方面促进细胞内吞及siRNA的释放。

图10用于说明Bi@PP/siRNA可以利用标记在siRNA上的荧光分子进行荧光成像。将小鼠分为3组，free siRNA组，Bi@PP/siRNA组，Bi@PP/siRNA+laser组(Bi@PP0.5mg/kg，siRNA 20mg/kg，LWRL808激光器以1W/cm2的功率照射5min)，尾静脉注射各组材料后，在6h，24h，48h用小动物活体荧光成像仪进行荧光分析。小动物活体成像数据显示，free siRNA在肿瘤富集较少，而Bi@PP/siRNA+laser组在肿瘤部位的荧光强度明显高于Bi@PP/siRNA组。

图11用于说明Bi@PP纳米片可以用于小鼠体内X射线计算机断层扫描成像。具体方法如下：当可以看到肿瘤血管时，尾静脉注射100μL Bi@PP(15mg mL-1)至荷瘤小鼠体内，进行小动物X射线计算机断层扫描设备成像，注射材料前的小鼠作为对照组。在10min，3h，6h，24h对小鼠进行全身CT扫描，扫描参数根据之前工作设置，具体如下：视野：78.92mm×78.92mm，84.56mm×84.56mm；厚度：154和165m；有效像素尺寸：50m；管电压：80和60kV；管电流：270和250A)。图像重构通过Feldkamp锥光束校正和SheppLogan滤波器，图像分析使用amira 4.1.2。如图11所示，伴随着血液循环，Bi@PP纳米片注射3h后在肿瘤部位明显积累，荷瘤小鼠肿瘤部位检测到明显的CT信号，这为Bi@PP纳米片用于肿瘤的光热治疗提供了有力的保障。此外，我们在肝脏和脾脏中也观察到明显的CT信号，这表明Bi@PP纳米片在体内会被网状内皮系统(RES)捕获，富集在肝脏和脾脏中。在6h，我们发现膀胱中明显的CT信号，以及在24h，小肠中的CT信号，提示Bi@PP可以通过尿液和粪便排出体外，为其生物应用提供了基本保障。

图12和图13通过ICP-MS分析该纳米材料的代谢及脏器分布：将Bi@PP(Bi@PP0.5mg/kg，siRNA 20mg/kg)通过尾静脉注入荷瘤小鼠体内，在特定的时间点，收集小鼠的脏器(心，肝，脾，肺，肾)和肿瘤。在30min，12h，24h及3d，利用代谢笼收集小鼠的尿液及粪便。分别称量质量后，将样品置于锥形瓶，加入4ml硝酸过夜，第二天将样品放在加热板上加热，温度由100-150-200度逐渐调高，待锥形瓶里的溶液剩余0.5mL，停止消化。样品冷却后，转移到5ml离心管里，用2％硝酸定容，每个样品用天平定容到3g，用ICP-MS测定Bi元素含量。ICP-MS检测结果显示，短时间点内，材料会在肝，脾，肾中富集，与CT成像结果一致，随时间延长，主要脏器中的材料逐渐减少，而肿瘤中材料逐渐累积。在48h，肿瘤中材料累计9.67ID％/g。30min在尿液及粪便中几乎为检测到Bi元素，12h在尿液和粪便中检测到Bi元素较高的信号，直到24h代谢物中Bi元素含量依然较高，3day后代谢物中检测到的Bi含量才开始降低。定量的数据充分佐证了CT成像观察到的明显现象。

图14用于说明荷瘤小鼠尾静脉给药治疗后肿瘤的生长曲线。具体方法如下：将100ul 4T1细胞(1x 105)接种到Balb/c小鼠右后腿上，待肿瘤体积长到100mm3，将小鼠随机分为4组，每组6只：对照组(Ctr)，Bi@PP/siRNA组，Bi@PP+laser组，Bi@PP/siRNA+laser组，尾静脉注射材料(Bi@PP 0.5mg/kg，siRNA 20mg/kg)，laser组使用LWRL808激光器以1W/cm2的功率照射5min。每两天记录肿瘤体积(肿瘤体积公式：V＝ab2/2，a代表肿瘤长度，b代表肿瘤宽度)。肿瘤在经过治疗后，相比于PBS组快速增长的肿瘤体积，Bi@PP+laser组及Bi@PP/siRNA+laser组不同程度地减缓了肿瘤的生长速度。值得一提的是，Bi@PP/siRNA+laser组取得了最佳的治疗效果，几乎完全遏制了肿瘤的生长。

我们进一步对原位肿瘤进行分析，发现如图15所示，Bi@PP/siRNA+laser组CRT蛋白表达明显升高。肿瘤细胞释放的损伤相关模式分子(DAMP)可以到达肿瘤相关淋巴结，刺激DC细胞的成熟，促进抗原呈递，进一步刺激T细胞免疫反应。CRT属于DAMP的一种，所以我们接下来对肿瘤相关引流淋巴结中的DC细胞进行了流式细胞仪分析，取肿瘤相关淋巴结，剪碎，使用胶原酶I和IV消化，获得单细胞悬液，用CD11c，CD86和CD80荧光抗体染色，采用流式细胞仪分析DC细胞成熟比例(CD11c+CD86+CD80+)。图16发现Bi@PP+laser组及Bi@PP/siRNA+laser组在治疗后，成熟DC(CD11c+CD80+CD86+)明显增多，而Bi@PP/siRNA+laser组成熟DC细胞所占比例最高，有效引发了肿瘤的ICD效应。同时，我们收集治疗后3day小鼠血清进行了炎症因子的测定。如图17所示，使用ELISA试剂盒测定IL-12及IFN-γ，Bi@PP/siRNA+laser组治疗后，血清中促炎因子IL-12和IFN-γ均明显上调。

本申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不以为这本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所述技术领域的技术人员应该明了，本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。