一种哌嗪功能化碳量子点的制备方法及其在土霉素检测中的应用

摘要

本发明提供了一种哌嗪功能化碳量子点的制备方法及其在土霉素检测中的应用，所述制备方法为，将柠檬酸和尿素同时溶解在乙二醇中，搅拌；将溶液置于反应釜内加热；通过滤膜过滤，将滤液置于纤维素透析袋内透析，得到的透析液经冷冻干燥后得到碳量子点粉末。本发明改变了碳量子点与有机物的发光状态，实现了针对土霉素的荧光偏移型检测，所述碳量子点制备简单、原料来源广泛，利用碳量子点表面修饰分子哌嗪与目标分析物土霉素的特异性结合，可实现水体中土霉素的快速高效检测并降低检测过程中其他共存物质的干扰，检测专一性强、灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明属于碳纳米材料制备和抗生素检测技术领域，尤其是涉及一种哌嗪功能化碳量子点的制备及其在荧光检测土霉素中的应用。

背景技术

土霉素被普遍用于畜牧业生产，环境中此类物质的检测对了解污染情况、预报污染趋势、评价治理效果等均起着重要作用。目前最普遍的用于土霉素的检测技术包括高效液相色谱法、逐层色谱法、免疫测定法和化学荧光法等，这些方法往往仪器价格高昂、检测时间长且大多需要繁杂的前处理过程。因此，发展一种简单高效且高选择性地针对土霉素的定性和定量检测方法仍十分必要。

作为碳纳米家族中的新成员，碳量子点具备荧光稳定性高且耐光漂白、激发光宽而连续、发射光可调节、生物相容性好等多种优越的性能。在荧光检测领域，碳量子点目前主要被应用于分析重金属和过渡金属等，这些物质导致的碳量子点荧光增强或淬灭可作为响应信号用于体系中污染物的检测。当以碳量子点荧光强度的增减变化来作为检测信号时，荧光强度容易被其他共存物质干扰，且不易实现直接的可视化分析。而以发射波长的偏移为检测信号的荧光检测法，更易排除干扰，实现简单且高选择性的可视化荧光检测。虽然目前多种表面功能化手段已经被用于提升碳量子点的荧光性能，在检测分析领域大部分研究的主要目的还是增加荧光量子产率或提高对目标分析物的检测专一性，而非针对目标检测物实现特定的荧光偏移。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种哌嗪功能化碳量子点的制备及其在荧光检测土霉素中的应用，本发明通过对碳量子点表面进行功能化，以表面修饰的哌嗪基团结合溶液中的土霉素分子，在碱性条件下以370nm作为激发波长，哌嗪功能化碳量子点与表面结合的土霉素分子发生荧光共振能量转移，随土霉素浓度的增加体系的归一化最大荧光发射波长逐渐红移，荧光颜色从蓝色过渡至黄绿色，实现了针对土霉素的荧光偏移型检测以及快速可视化半定量识别。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种哌嗪功能化碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)将柠檬酸和尿素溶解在乙二醇中，搅拌，加热，过滤，以去离子水为透析外液透析，透析液经冷冻干燥后得到碳量子点粉末；

(2)将碳量子点粉末加入到2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液内，先超声分散，后持续通入氮气；

(3)将步骤(2)中所得溶液置于冰浴内，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和羟基琥珀酰亚胺，保持氮气氛围，并搅拌；

(4)保持氮气氛围，在一定温度条件下，向步骤(3)所得溶液中加入叔丁氧羰基哌嗪，并向溶液内滴加氢氧化钠溶液，调节溶液pH；

(5)将步骤(4)所得溶液匀速搅拌一定时间，随后加入盐酸，于室温下继续搅拌；

(6)向步骤(5)所得溶液中加入碳酸氢钠粉末，当溶液pH达到一定值后，以去离子水为透析外液进行透析；

(7)将步骤(6)中经透析后的溶液进行冷冻干燥，得到哌嗪功能化碳量子点。

优选的，步骤(1)中，所述柠檬酸、尿素和乙二醇的摩尔比为1:(1～3):(40～80)，优选的，1:(1.5～2.5):(50～60)；加热温度为120～240℃，加热时长为2～24h，优选的，8～16h；过滤所用滤膜直径为0.1～0.5μm，透析所用透析外液去离子水量为800～1500mL；透析时长为2～72h，优选的，12～48h；更换透析外液时长为每24h更换2～4次，冷冻干燥时长为12～48h。

优选的，步骤(2)中，碳量子点粉末质量与2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(pH＝6)体积比为1mg:0.5～2.0mL，超声分散时长为5～60min，通入氮气时长为15～60min；优选的，2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液的pH为6。

优选的，步骤(3)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、羟基琥珀酰亚胺与步骤(2)中所用碳量子点粉末质量比为(2～5):(0.2～10):1，其中，搅拌时长为2～24h，优选的，8～16h。

优选的，步骤(4)中，叔丁氧羰基哌嗪与步骤(2)中碳量子点的质量比为(2～5):1，加入氢氧化钠溶液，调节溶液的pH至6.0～8.0，优选的，7.0～8.0；优选的，氢氧化钠溶液的浓度为1M。

优选的，步骤(5)中，所述搅拌时间为2～24h；优选的，8～16h；加入盐酸(1M)的体积与步骤(2)中碳量子点的质量比为(0.2～1)mL:1mg，室温下搅拌时长为1～4h。

优选的，步骤(6)中，加入碳酸氢钠粉末调节溶液pH至5～7，所用的透析外液去离子水量为800～1500mL，透析时长为2～72h；优选的，12～48h；步骤(7)中，冷冻干燥的时长为12～48h。

本发明还提供如上所述制备方法制备的哌嗪功能化碳量子点在荧光检测土霉素中的应用。

优选的，以370nm为激发波长，使用荧光光谱仪测试样品的荧光发射。

优选的，哌嗪功能化碳量子点与含有土霉素的样品中，加入0.025M，pH＝8～10的碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液，振荡摇匀，于室温下静置1h；优选的，pH为9.2～10.0。

当所用的激发波长为365nm时，随着土霉素浓度从0增长到10μM，体系的荧光颜色从原来的蓝色过渡到绿色，最后转变为黄绿色，该方法可实现对土霉素的快速半定量可视化识别。

六元环分子哌嗪与碳量子点的羧酸基团发生的酰胺化反应被引入到碳量子点表面，其相对位点上含有两个氮原子，这使其极有可能与其它分子发生氢键结合和静电作用。当通过这些分子间作用力结合溶液中游离的土霉素分子后，哌嗪功能化碳量子点的能量会通过荧光共振能量转移作用而部分转移到土霉素分子上，使土霉素分子的荧光被增强，而碳量子点的荧光被减弱。哌嗪功能化碳量子点和被结合的土霉素分子间的协同荧光发射波长将随着土霉素含量的增加而逐渐偏移，这可实现对土霉素的定量检测和可视化快速识别。

本发明的机理为：以柠檬酸和尿素为原料通过溶剂热法合成了表面富含亲水性基团的蓝色荧光碳量子点，并通过酰胺化反应和保护/去保护法在碳量子点的表面引入哌嗪基团合成哌嗪功能化碳量子点，哌嗪基团可通过氢键和静电相互作用结合溶液中的土霉素分子。在碱性条件下370nm波长激发时，哌嗪功能化碳量子点与其表面结合的土霉素分子之间发生荧光共振能量转移，作为能量受体的土霉素以哌嗪基团为媒介获得了来自哌嗪功能化碳量子点的部分激发能量，从而强化了结合在哌嗪功能化碳量子点表面土霉素分子的自身荧光。因此，随着土霉素浓度在0-10μM范围内的升高，体系的荧光发射逐渐红移，其荧光颜色从蓝色过渡至黄绿色，实现了对针对土霉素的荧光偏移型检测以及快速可视化半定量识别。

相对于现有技术，本发明所述的一种哌嗪功能化碳量子点的制备及其在荧光检测土霉素中的应用，具有以下优势：

(1)柠檬酸和尿素为原料通过溶剂热法合成了表面富含亲水性基团的蓝色荧光碳量子点，原料来源广泛、合成方法简单、成本低廉。

(2)对哌嗪分子一端的胺基基团进行保护后通过酰胺化反应将其负载在碳量子点表面，再进行去保护，既可确保哌嗪与碳量子点的有效结合，又可保留另一端自由胺基与目标分析物结合。

(3)利用碳量子点表面修饰分子哌嗪与目标分析物土霉素的特异性结合，改变了碳量子点与有机物的发光状态，实现了针对土霉素的荧光偏移型检测和快速可视化识别。

(4)哌嗪功能化碳量子点与土霉素的特异性结合可降低检测过程中其他共存物质的干扰，是一种专一性更强、灵敏度更高的检测手段。

附图说明

图1为(a)碳量子点和(b)哌嗪功能化碳量子点的TEM及粒径分布图。

图2(a)为NaHCO

图3为365nm紫外灯照射下NaHCO

图4为NaHCO

图5为NaHCO

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明。

实施例一

一种哌嗪功能化碳量子点的制备方法，包括如下步骤：

(1)碳量子点的制备

先将0.65g柠檬酸和0.42g的尿素同时溶解在25mL的乙二醇中，磁力搅拌2小时后，将溶液置于50mL的聚四氟乙烯不锈钢反应釜内，并于200℃下持续加热10小时。后自动冷却至室温，将反应釜内的黑色产物通过0.22μm的滤膜过滤以除去较大的颗粒杂质。然后将溶液置于纤维素透析袋(1000MWCO)内，以800mL去离子水为透析外液持续透析24小时，并以磁力搅拌加速透析，透析期间每24小时内更换3次外液。待透析结束，将透析袋内的黑色溶液倒入玻璃皿内，使用冷冻干燥机冷冻干燥约24小时最终获得碳量子点黑色粉末。

图1(a)为碳量子点的透射电镜及粒径分布图。

(2)哌嗪功能化碳量子点的制备

将30mg的碳量子点粉末加入到30mL的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(pH＝6)内，超声分散30分钟后通入氮气30分钟以除去溶液内的溶解氧，此后将溶液置于冰浴内并依次加入150mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和75mg羟基琥珀酰亚胺，继续保持氮气氛围并使用磁力搅拌机匀速搅拌12小时以保证反应的进行。在氮气氛围和0℃低温下加入0.10g叔丁氧羰基哌嗪，并向溶液内缓慢滴加少许氢氧化钠溶液(1M)以将溶液pH值调至约7.2的中性条件。继续匀速搅拌24小时以保证叔丁氧羰基哌嗪充分共价连接到碳量子点表面。随后向溶液内加入10mL盐酸(1M)并于室温下连续搅拌6小时。然后加入碳酸氢钠粉末以中和溶液内过量的盐酸，当溶液pH值达到6后，以800mL去离子水为外液透析24小时以去除混合液内的各类溶质。透析结束后用冷冻干燥获得哌嗪功能化碳量子点棕褐色粉末。

图1(b)为哌嗪功能化碳量子点的透射电镜及粒径分布图。

将实施例一制备的哌嗪功能化碳量子点用于土霉素的检测

将1mL的哌嗪功能化碳量子点分散液(0.05mg/mL)和1mL不同浓度的土霉素(10μM、40μM、60μM、80μM、100μM)先后加入到不同的10mL的安倍瓶内，随后将8mL的碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液加入到上述各混合液内，混合液经振荡摇匀后于室温下静置1小时，使用荧光光谱仪测试各混合液的荧光发射(激发波长370nm)。

根据5个样品的最大发射峰波长值的变化情况作出对应的最大发射峰波长值(Y)随土霉素浓度(X)变化的拟合曲线，该曲线所对应的函数为：Y＝4.44X+447.92，相关系数R

图2为NaHCO

图3为在365nm紫外灯照射NaHCO

对比例1：

选取结构上与土霉素相似的金霉素和盐酸四环素考察哌嗪功能化碳量子点对土霉素的选择性，将1mL哌嗪功能化碳量子点分散液(0.05mg/mL)和1mL金霉素(浓度分别为1、2、4、6、8、10μM)加入10mL安倍瓶内，随后加入8mL磷酸盐缓冲液，经振荡摇匀后于室温下静置1小时，使用荧光光谱仪测试溶液的荧光发射。

图4为NaHCO

对比例2：

选取结构上与土霉素相似的金霉素和盐酸四环素考察哌嗪功能化碳量子点对土霉素的选择性，将1mL哌嗪功能化碳量子点分散液(0.05mg/mL)和1mL盐酸四环素(浓度分别为0、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100μM)加入10mL安倍瓶内，随后加入8mL磷酸盐缓冲液，经振荡摇匀后于室温下静置1小时，使用荧光光谱仪测试溶液的荧光发射。

图5为NaHCO

根据选择性测试结果，通过荧光发射峰的偏移和哌嗪功能化碳量子点检测体系颜色的变化可以有效地排除来自其他共存物质的干扰，从而实现对土霉素的选择性检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。