功能化碳量子点的制备及在生物酶活性检测中的应用

摘要

碳量子点(CQDs)作为一种尺寸在10nm以下的新型碳纳米材料，具有极好的可分散性、化学稳定性和耐光性，易修饰、激发依赖多颜色发射、低毒性和很好的生物相容性使得它有望替代染料探针、毒半导体量子点和低荧光聚合物，在化学传感、生物传感、生物成像、药物运输、光伏器件、光催化等领域发挥越来越重要的作用。
　　本文以活性炭为原料，利用浓硫酸、浓硝酸氧化法制备得到水溶性好，且表面富含羧基和羟基官能团的碳量子点，合成的碳量子点具有强黄绿色荧光。在此基础上，我们利用多巴胺与碳量子点表面羧基的缩合反应合成了多巴胺功能化的碳量子点(dopa-CQDs)。
　　我们利用碳量子点表面的羧基与无水焦磷酸钠(PPi)对铈离子(Ce3+)的竞争反应设计了一个荧光纳米开关来检测PPi;基于聚集分散机制及碱性磷酸酶(ALP)对PPi和三磷酸腺苷(ATP)的水解作用及酸性磷酸酶(ACP)对PPi的水解作用分别实现了对ALP和ACP的定量实时检测;利用乙酰胆碱酶(AChE)对乙酰胆碱(ATCh)的水解作用和巯基与碳量子点表面羧基对铜离子（Cu2+）的竞争反应实现对AChE活性检测及抑制剂筛选;利用多巴胺-碳量子点中的多巴胺部分被酪氨酸酶(TYR)氧化成醌，与碳量子点发生光致电子转移(PET)过程实现对TYR活性的检测及抑制剂筛选。主要研究内容如下:
　　(1)基于碳量子点的聚集分散机制，我们构建了一个方便可逆的荧光纳米开关来实现对PPi的定量检测。聚集和分散状态分别对应与荧光信号的开和关。Ce3+与碳量子点表面的羧基具有强络合作用而使碳量子点发生聚集，Ce3+与PPi对羧基的竞争反应又使得碳量子点解聚，因而PPi可以作为碳量子点/Ce3+纳米开关的外在化学刺激，它的量可以通过体系的荧光强度来反映。定量检测PPi的线性范围为0.3-29.3μM，检测限为0.1μM。我们同时评估了PPi在人类HeLa细胞中的检测效果，观察到PPi存在及不存在时的荧光纳米开关的打开和闭合。
　　(2)基于碳量子点的聚集和分散机制我们实现了ALP活性的定量检测。
　　方法一:碳量子点和PPi分别作为检测ALP活性的荧光指示器和底物。碳量子点表面富含的羧基与Cu2+络合，碳量子点发生聚集，荧光猝灭;ALP将PPi水解成pi，pi将Cu2+从碳量子点/Cu2+的络合体系中夺取出来，碳量子点重新分散，荧光恢复。定量检测ALP活性的线性范围为16.7-782.6U/L，检测限为1.1U/L。该法的灵敏度达到了人血清中ALP的检测的要求。
　　方法二:碳量子点和ATP分别作为ALP活性检测的荧光指示器和底物。碳量子点表面的羧基与Ce3+作用，碳量子点聚集，荧光猝灭;ALP水解ATP形成pi，pi将Ce3+从碳量子点/Ce3+的络合体系中夺取出来，碳量子点重新分散，荧光恢复。定量检测ALP活性的线性范围为4.6-383.3U/L，检测限为1.4U/L。
　　这两种方法的灵敏度能够满足人血清中ALP活性的检测的要求，拓宽了荧光碳量子点的传感应用，为基于聚集分散的光学探针的发展提供了借鉴。
　　(3)我们发展了基于碳量子点纳米材料和PPi的可逆荧光纳米开关，在此基础上，实现了对ACP活性的实时定量检测。Ni2+与CQD表面羧基的络合作用使得碳量子点聚集，荧光猝灭，而PPi能够将Ni2+从碳量子点/Ni2+的纳米聚集体系中夺取出来，使得碳量子点重新分散，荧光恢复。ACP能将PPi水解成pi，Ni2+重新猝灭碳量子点的荧光。定量检测ACP活性的线性范围为18.2 U/L-1300U/L，检测限为5.5U/L，该法的灵敏度可满足人血清和血浆中ACP的检测。
　　(4)我们用碳量子点作为荧光信号实现了对AChE活性检测和抑制剂筛选。检测原理如下:碳量子点表面的羧基与Cu2+络合使得碳量子点聚集，荧光猝灭，AChE催化水解ATCh成TCh，TCh的巯基与Cu2+的络合作用要强于羧基，荧光恢复，当AChE的抑制剂存在时，AChE失去催化活性，荧光保持在猝灭状态。用这个方法我们检测AChE活性的线性范围为14.2-121.8U/L，检测限为4.25U/L，该法的灵敏度可实现人血清和血浆中AChE活性的检测。研究结果也证实了该法在AChE抑制剂筛选中的潜在应用。
　　(5)基于多巴胺修饰的碳量子点材料我们发展了一种检测TYR活性和抑制剂筛选的方法。首先将多巴胺功能化在碳量子点表面，多巴胺-碳量子点有很强的蓝绿色荧光。当多巴胺-碳量子点的多巴胺部分被TYR催化氧化成多巴醌衍生物时，碳量子点与多巴醌部分发生PET过程，多巴胺-碳量子点的荧光猝灭。利用荧光猝灭效率与TYR活性之间的线性关系实现了TYR活性的定量检测。该方法的线性范围宽至800U/L检测限低至7.0U/L。同时，我们用熊果苷做了抑制剂筛选实验，发现有熊果苷存在时TYR的活性受到了抑制。我们的研究结果也证实了多巴胺-碳量子点具有很好的生物相容性，能够灵敏地监测黑色素瘤细胞内的TYR水平及活体细胞内的pH变化。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 碳量子点概述

1．2 合成方法

1．2．1 自上而下法

1．2．2 自下而上法

1．3 碳量子点的表面钝化和功能化

1．3．1 表面钝化

1．3．2 表面功能化

1．4 碳量子点的荧光性质

1．4．1 来自于共轭p-区域能带转移的荧光发射

1．4．2 缺陷衍生起源的荧光发射

1．4．3 碳量子点的可调荧光发射

1．4．4 上转换荧光

1．5 碳点的应用

1．5．1 化学传感

1．5．2 生物传感

1．5．3 生物成像

1．5．4 纳米医疗

1．6 本论文研究内容及意义

参考文献

第二章 基于碳量子点纳米自组装的可逆荧光开关检测PPi

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 碳量子点的合成和表征

2．3．2 基于碳量子点构建和评估纳米开关

2．3．3 基于碳量子点和Ce3+定量检测焦磷酸根

2．4 结论

参考文献

第三章 基于碳量子点检测ALP的两种方法

3．1 前言

3．2 基于PPi的ALP检测

3．2．1 实验部分

3．2．2 结果与讨论

3．3 基于ATP的ALP检测

3．3．1 实验部分

3．3．2 结果与讨论

3．4 结论

参考文献

第四章 基于碳量子点纳米自组装的可逆荧光开关检测ACP的活性

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 基于荧光碳量子点纳米开关检测ACP活性的原理

4．3．2 基于碳量子点纳米开关的ACP活性检测策略的评价

4．3．3 基于碳量子点纳米开关定量检测PPi

4．3．4 荧光法实时检测ACP活性

4．4 结论

参考文献

第五章 基于碳量子点荧光法检测AChE活性和抑制剂筛选

5．1 前言

5．2 实验部分

5．2．1 实验试剂

5．2．2 实验方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 基于碳量子点的AChE活性检测及抑制剂筛选原理

5．3．2 Cu2+猝灭碳量子点荧光及硫代胆碱使荧光恢复

5．3．3 基于碳量子点荧光法检测AChE

5．3．4 AChE抑制剂筛选

5．4 结论

参考文献

第六章 多巴胺功能化碳量子点检测TYR活性和抑制剂筛选

6．1 前言

6．2 实验部分

6．2．1 实验试剂

6．2．2 实验方法

6．3 结果与讨论

6．3．1 基于多巴胺-碳量子点的TYR活性检测原理

6．3．2 多巴胺-碳量子点的合成与表征

6．3．3 基于多巴胺-碳量子点检测TYR活性策略评估

6．3．4 荧光法实时监测TYR活性

6．3．5 TYR的抑制剂筛选

6．3．6 细胞毒性测试和细胞内传感

6．4 结论

参考文献

第七章 结论

硕士期间取得的研究成果

致谢

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