抑制Treg细胞中NCoR1表达在防止肥胖和抵抗寒冷方面的应用

摘要

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种抑制Treg细胞中NCoR1表达在防止肥胖和抵抗寒冷方面的应用。基于上述效果，可以用于抑制NCoR1表达的试剂可用于生活方式相关疾病的预防、治疗和/或改善；并用于制备科研及临床相关的与褐色脂肪和米色脂肪产热、干预肥胖或者提高寒冷耐受的试剂/药物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种抑制Treg细胞中NCoR1表达在防止肥胖和抵抗寒冷方面的应用。

背景技术

脂肪组织通过储存能量和非颤栗产热为哺乳动物体温恒定和能量代谢平衡提供了重要基础。脂肪组织又分为褐色脂肪(Brown Adipose Tissue,BAT)，白色脂肪(WhiteAdipose Tissue,WAT)和米色脂肪(brite adipose tissue,bAT)。小鼠体内的褐色脂肪主要分布于颈部(cervical BAT,cBAT)，肩胛间(interscapular BAT,iBAT)和肩胛下(subscapular BAT,sBAT)，褐色脂肪组织中有丰富的血管分布，细胞内含有许多小脂滴，以及很高密度的线粒体。寒冷条件下，机体分泌的肾上腺素与褐色脂肪细胞膜上的β肾上腺素受体结合，分解脂肪为脂肪酸，使线粒体蛋白UCP1激活，发生解偶联作用产热，为机体提供热量。最近研究表明，在褐色脂肪中也存在另一种不依赖肾上腺素刺激的产热通路，即通过肠促胰液素激活褐色脂肪产热。白色脂肪主要位于皮下和内脏周围，细胞内含有一个大脂滴，线粒体含量极低，是动物体内的能量储存库。在寒冷刺激下，白色脂肪细胞内脂肪酸代谢增高，诱发UCP1蛋白介导的线粒体解偶联反应，从而使白色脂肪褐化成为米色脂肪。米色脂肪也可以通过UCP1蛋白在线粒体中发生解偶联产热，与褐色脂肪产热相比，呈现出分级效应。也有研究表明，在米色脂肪细胞中，存在另一条不依赖UCP1蛋白的产热途径：肾上腺素激活米色脂肪细胞内质网钙离子循环，通过受体蛋白RyR2释放出Ca

脂肪组织的产热和对冷刺激的应答与免疫系统的调控有着密不可分的关系。在脂肪组织中浸润着各种类型的免疫细胞，他们与参与调控脂肪组织的产热与炎性反应等过程，与机体肥胖，炎症及疾病有关。褐色脂肪和米色脂肪的产热激活过程受到了脂肪组织中巨噬细胞(M1/M2 Mφ)，嗜酸性粒细胞(Eos)和II型固有淋巴细胞(ILC2)等免疫细胞以及释放的一系列细胞因子的共同调控。其中巨噬细胞M1亚群可通过靶向抑制交感神经的激活进而减弱褐色脂肪产热。Sakamoto等人的研究表明，在高脂饮食中，褐色脂肪浸润的促炎性巨噬细胞类群(M1)增加，并通过分泌I型细胞因子TNFα抑制褐色脂肪细胞的解偶联产热反应。而另一种抑制炎症的巨噬细胞亚群(M2)则可以激活脂肪褐化和产热，寒冷条件下，M2亚群受到嗜酸性粒细胞等分泌的IL-4细胞因子的激活，在皮下白色脂肪和褐色脂肪中迅速募集，并分泌儿茶酚胺，诱导白色脂肪褐化，以及褐色脂肪产热相关基因的表达。另外，ILC2细胞在受到IL-33因子激活后，也可分泌IL-5和IL-13细胞因子，并呈递至嗜酸性粒细胞，与嗜酸性粒细胞一同作用于脂肪细胞前体，促进前体细胞增殖和分化。IL-33是脂肪能量代谢过程中的一类重要的细胞因子，缺乏IL-33或其受体ST2可导致UCP1蛋白合成障碍而影响褐色脂肪和米色脂肪产热。而IL-33除可激活嗜酸性粒细胞外，还可导致白色脂肪中调节性T细胞群(Regulatory T cells,Treg)的增加。

Treg细胞是T细胞的一个亚群，与维持体内稳态和自身免疫耐受有关。Treg细胞特异表达转录因子Foxp3，在体内具有不同亚群，行使不同的功能。Cipolletta等人的研究显示，位于内脏周围白色脂肪组织中的Treg细胞通过分泌PPARγ因子，参与调节并改善小鼠的炎性肥胖状态和胰岛素耐受情况。内脏脂肪组织(visceral adipose tissue,VAT)中的Treg细胞群在体型偏瘦的小鼠中发生了明显富集，这种富集最初发生在10至15周龄的小鼠中，并在20至25周龄时达到高峰(脂肪中Treg占比CD4+T细胞可达40％～80％，同期淋巴器官中这一比例为5％～15％)，然而，在40周龄的小鼠中，脂肪Treg的比例会发生下降，这种现象被认为可能受到了体内微生物群体的影响。Treg对VAT和棕色脂肪组织的影响可能和巨噬细胞以及其他免疫细胞相关，从瘦体型小鼠VAT中分离出来的Treg细胞和围产期巨噬细胞共培养可激活巨噬细胞分泌抑制炎症的细胞因子。

发明内容

本发明涉及用于抑制Treg中NCoR1水平的试剂在制备用于提高动物能量代谢水平的药物中的应用。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及用于抑制Treg中NCoR1水平的试剂在制备用于抑制动物肥胖的药物中的应用。

可选的，如上所述的应用，所述药物用于预防、治疗或改善生活方式相关疾病。

可选的，如上所述的应用，所述生活方式相关疾病是由于饮食习惯和/或健身习惯发生和发展的疾病或症状。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及用于抑制Treg中NCoR1水平的试剂在制备用于提高动物冷适应能力的药物中的应用。

可选的，如上所述的应用，所述药物用于诱导皮下白色脂肪褐化。

可选的，如上所述的应用，所述试剂特异性敲除Treg细胞中的NCoR1基因。

可选的，如上所述的应用，所述动物为哺乳动物。

可选的，如上所述的应用，所述动物为人。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及构建高能量代谢率、或不易肥胖、或冷适应能力强的动物模型的方法，包括抑制所述动物Treg细胞中的NCoR1基因的表达的步骤。

本发明的有益效果为：

首次发现了Treg细胞中NCoR1在动物能量代谢、肥胖、冷适应能力调节等方面的新功能。基于上述效果，可以用于抑制NCoR1表达的试剂可用于生活方式相关疾病的预防、治疗和/或改善；并用于制备科研及临床相关的与褐色脂肪和米色脂肪产热、干预肥胖或者提高寒冷耐受的试剂/药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中的实验流程示意图；

图2为本发明一个实施例中Treg细胞敲除NCoR1后显著影响小鼠的代谢水平；

图3为本发明一个实施例中Treg细胞缺失NCoR1基因后影响小鼠年龄依赖的脂肪代谢过程；

图4为本发明一个实施例中Treg细胞缺失NCoR1基因后小鼠的冷适应能力显著改善；

图5为本发明一个实施例中NCoR1缺失影响脂肪Treg的状态；

图6为本发明一个实施例中IL33诱导NCoR1缺失的Treg细胞表达更多的脂肪Treg标记；

图7为本发明一个实施例中Treg细胞中缺失NCoR1基因可能影响EPAS1基因的表达调控；

图8为本发明一个实施例中NCoR1基因可能通过与EPAS1基因相互作用影响Treg细胞对脂肪的调控；

图9为本发明一个实施例中NCoR1敲除后Treg细胞倾向于向皮下脂肪聚集。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及用于抑制Treg中NCoR1水平的试剂在制备用于提高动物能量代谢水平的药物中的应用。

NCoR1即核受体辅抑制因子1。

用于抑制Treg中NCoR1水平的试剂可于蛋白水平、RNA水平或者DNA水平进行抑制。

蛋白水平的抑制剂可以为NCoR1的中和抗体，或者可以对其活性起到阻断作用的物质，例如化合物。

RNA水平的抑制剂例如miRNA、siRNA、反义寡核苷酸等。

DNA水平的抑制剂例如各种可以敲除NCoR1全长或其部分片段的试剂。

本发明还涉及用于抑制NCoR1表达的试剂在制备用于抑制动物肥胖的药物中的应用。

在一些实施方式中，所述药物用于预防、治疗或改善生活方式相关疾病。

在一些实施方式中，所述生活方式相关疾病是由于饮食习惯和/或健身习惯发生和发展的疾病或症状。

生活方式疾病在本领域中被定义为，生活方式如饮食习惯、健身习惯、休息、吸烟或饮酒影响疾病的发生和发展的一组疾病。本发明的用于抑制NCoR1水平的试剂所制备的药物特别适用于饮食习惯和/或健身习惯引起其发生和发展的疾病或病症。这些疾病和病症的实例包括肥胖、血脂异常(特别是高甘油三酯血症)、糖尿病(特别是II型糖尿病)、高血压、动脉硬化(特别是动脉粥样硬化)、代谢综合征等。本发明所述的代谢综合征是指内脏脂肪蓄积伴随高血糖症、高血压和血脂异常中的两种或两种以上同时发生的病症。

根据本发明的再一方面，还涉及用于抑制Treg中NCoR1水平的试剂在制备用于提高动物冷适应能力的药物中的应用。

在一些实施方式中，所述药物用于诱导皮下白色脂肪褐化。

在一些实施方式中，所述试剂特异性敲除Treg细胞中的NCoR1基因或抑制其表达。

本发明所提供的药物的给药对象可以为哺乳动物，其非限制性地包括牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂等；特别地，为灵长类动物，更特别地，为人。

给药对象适用于健康受试者(用于预防)和生活方式相关的疾病的患者。

在本发明中，上述药物中可以包含药学上可接受的载体。

药学上可接受的载体成分的实例包括结合剂(糖浆、阿拉伯树胶、明胶、山梨醇、黄芪胶(tragacanth)、聚乙烯吡咯烷酮等)、填充剂(乳糖、蔗糖、淀粉、磷酸钙、山梨糖醇、甘氨酸等)、润滑剂(硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇等)、崩解剂(淀粉、微晶纤维素(microcrystalline cellulose)等)、湿润剂(十二烷基硫酸钠(sodium laury1 sulphate)等)、悬浮剂(山梨糖醇、糖浆、甲基纤维素、葡萄糖浆(glucose syrup)、明胶、氢化食用脂肪等)、乳化剂(卵磷脂、山梨醇单油酸酯、阿拉伯树胶等)、非水性载体(杏仁油、分馏椰子油或甘油、丙二醇、乙醇等疏水酯等)、防腐剂(对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸等)、芳香剂(合成香料、天然香料等)、甜味剂(蔗糖、甜叶菊、木糖醇等)、pH调节剂(碳酸氢钠、碳酸钾等)、粉剂(色素、染料、树脂等)、增稠剂(阿拉伯树胶、甲基纤维素等)、抗氧化剂(维生素C、维生素E等)等等。

只要所述试剂可以被给药，本发明的药物可以制成片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、液体和溶液、悬浮液、乳液、注射剂和滴剂等。

本发明对药物的给药方法没有任何限制，具体给药方法可以从口服、注射(皮下、皮内、肌内、静脉内、动脉内)、皮肤给药、经皮给药等中进行适当地选择。

根据本发明的再一方面，还涉及一种构建高能量代谢率、或不易肥胖、或冷适应能力强的动物模型的方法，包括抑制所述动物Treg细胞中的NCoR1基因的表达的步骤。

在一些实施方式中，抑制所述动物Treg细胞中的NCoR1基因的表达对方法为敲除NCoR1基因；进一步地，敲除的方法为Cre-loxP基因重组技术。

本发明公开了Treg细胞中NCoR1在动物能量代谢、肥胖、冷适应能力调节等方面的新功能。在实施例中，采用条件性敲除小鼠，本发明发现了NCoR1knockout小鼠与白脂褐化相关的基因(如Cidea、CytoC、Pdk4)表达量显著升高，脂肪Treg细胞的标记基因(如Epas1、Klrg1、Il1rl1)表达量显著升高，并且Treg细胞敲除NCoR1后，会更倾向于向皮下脂肪组织聚集，同时T细胞比例也有显著提高等现象，并相对于野生型小鼠和高脂诱导的肥胖模型小鼠表现出很多新性状。基于上述结果，确认本发明所述的Treg细胞中NCoR1的新用途成立。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例

一、实验方法

1.小鼠冷刺激诱导适应性产热实验

准备干净的鼠粮及饮用水于4℃预冷；在灭菌并干燥的鼠笼中加入相同质量的玉米芯垫料充分覆盖鼠笼底面并将鼠笼于4℃预冷。于晚上20：00左右每个鼠笼放1只小鼠在4℃开始实验。整个过程尽量保持与自然环境下相一致的光照节律，每12小时检查小鼠的生存状态并记录小鼠体重的变化。12h或48h后对小鼠进行后续的实验

2.组织切片及HE染色

采集小鼠新鲜组织，用4％的多聚甲醛溶液固定过夜。之后经过石蜡包埋、切片、HE染色及图像采集。整个切片过程及图像采集均在武汉百奥斯生物的协助下完成。图像采用NDP viewer软件进行分析。

3.小鼠组织多因子检测

采集小鼠组织，称重，迅速置于液氮中速冻备用。加入含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液，用直径3mm的钢珠60Hz 90sec匀浆组织。最高转速20min 4℃离心，所得上清即可进行多因子检测，也可于-80℃储存。

对于多因子检测，整个反应过程在Falcon管中进行。实验开始前先将试剂盒置于室温30min平衡，剧烈涡旋振荡试剂盒提供的多因子捕获微珠，使其均匀悬浮。在每个管中加入25ul的试剂盒提供的检测液，再对应加入25ul的样本溶液或标准品，随后依次加入试剂盒提供的多因子捕获微珠及检测抗体各25ul，涡旋振荡15sec后于室温避光孵育2h。整个孵育过程在定轨摇床上以1000rpm的转速进行，以防止微珠沉降。孵育结束后，320g 5min室温离心，弃上清；每管加入25ul的试剂盒提供的PE检测抗体，涡旋振荡混匀后继续室温避光孵育30min。整个孵育过程在定轨摇床上以1000rpm的转速进行，以防止微珠沉降。随后320g5min室温离心，弃上清，再用200ul试剂盒提供的清洗液清洗一次。最后用200ul清洗液重悬样本并涡旋振荡混匀后用流式细胞仪检测。

4.脾脏Treg细胞及皮下脂肪组织CD45

准备脾脏Treg细胞及皮下脂肪组织CD45

5.Treg细胞的RNA测序

流式分选Treg细胞，以至少3只小鼠的Treg细胞的混合作为一个生物学重复。

取1×10

6.小鼠CD4

准备小鼠淋巴细胞于Falcon流式管，用预冷的FACS缓冲液重悬细胞至每毫升100x10^6的密度，加入Anti-CD8-biotin及Anti-CD19-biotin抗体，震荡混匀，室温静置10min标记淋巴细胞。用5ml预冷的FACS缓冲液320g 5min 4℃洗细胞一次，重新用预冷的FACS缓冲液重悬细胞至每毫升100×10

7.小鼠Treg细胞的分选

由于小鼠Treg细胞占整个淋巴细胞群的比例相对较低，为提高分选效率，本课题所涉及的小鼠Treg细胞的分选均采用先磁珠阴选CD4

先采用上述提到的磁珠阴选的方法获得CD4

8.小鼠脂肪组织免疫细胞的分离

断颈处死小鼠，喷洒酒精表面消毒小鼠，解剖，迅速取出组织置于6cm培养皿中并用剪刀剪碎组织，随后用预热的含有0.1％四型胶原酶的HBSS缓冲液重悬组织并转移到15ml离心管，37℃摇床，200rpm消化30min。消化结束后用10ml预冷的FACS缓冲液终止消化过程，800g 20min 4℃离心得到细胞沉淀；直接用3ml 40％的Percoll重悬细胞沉淀，并轻轻将重悬好的细胞铺在3ml 80％的Percoll上面，使用600g 20min室温slow升速off减速模式进行密度梯度离心；用移液枪吸出密度梯度离心后所产生的淋巴细胞层，用10ml预冷的FACS缓冲液稀释，600g 10min 4℃离心得到淋巴细胞。

9.小鼠脾脏及淋巴结免疫细胞的分离

整个分离过程在冰上进行。

断颈处死小鼠，喷洒酒精表面消毒小鼠，解剖，迅速取出组织置于预先配置好的5ml FACS缓冲液中，使用磨砂的载玻片，粗糙面相对在FACS缓冲液中研磨组织，尽可能快的使组织中的细胞释放到缓冲液中。用70um孔径的尼龙膜过滤细胞至15ml离心管，320g 5min4℃离心，弃上清得细胞沉淀。对于胸腺和淋巴结来源的细胞，可用5ml预冷的FACS缓冲液重悬，所得细胞即可进行下一步分析；对于脾脏细胞沉淀，先震荡打散沉淀块，用1ml 1×的红细胞裂解液重悬细胞，室温静置5min裂解红细胞，随后用10ml预冷的FACS缓冲液终止裂解，颠倒混匀后，320g 10min 4℃离心得沉淀，用5ml预冷的FACS缓冲液重悬，70um孔径的尼龙膜过滤去除死细胞团块，所得细胞即可进行下一步分析。

10.小鼠Treg细胞中NCoR1基因的敲除。

我们用NCoR1-Floxed小鼠与YFP-Foxp3-Cre鼠杂交来构建Treg细胞中NCoR1单基因敲除的小鼠，筛选子代Treg细胞中条件性基因敲除(cKO)纯合子模型。

二、实验步骤

11.小鼠体重与脂肪含量测定。

自小鼠断奶(两周龄)时起，每周定时称量小鼠体重，绘制体重增长曲线，统计组间体重差异(图3A)。核磁共振测定小鼠组织分布，计算每只小鼠脂肪组织占比，并比较各组之间的差异(图3B-E)，并在高脂饮食诱导的肥胖模型中进行同步验证(图3F-J)；对冷刺激处理后小鼠的皮下脂肪进行切片和苏木精-伊红(HE)染色，检测皮下脂肪褐化情况的改变(图4B-C)。

12.呼吸代谢率测定。

利用CLAMS小动物新陈代谢系统测定小鼠的呼吸交换率与每小时消耗热量，来分析NCoR1基因对小鼠产热及代谢表型的影响(图2A-H)。

13.生存曲线绘制。

将NCoR1基因敲除组进行冷刺激处理，每隔6小时观察小鼠的生存状态，直至48小时结束。统计小鼠的存活率变化，并绘制基因敲除状态下与野生组小鼠的生存曲线(图4A)。

14.NCoR1缺失的Treg细胞对体内免疫组分的影响。

将敲除小鼠分为冷处理组和正常组，分离小鼠的脾脏，淋巴结，皮下脂肪与盆腔脂肪中的免疫细胞，利用流式细胞术分析不同组别中免疫细胞类群的比例变化与数量改变，同时观察每个组别中Treg细胞亚群的数量和比例变化(图6A-B)。

15.Treg细胞的体外增殖培养。

利用流式细胞分选术从小鼠脾脏和淋巴结中分选出Treg细胞，体外用anti-CD3e/anti-CD28和IL2刺激增殖，培养3-5天后收取细胞上清进行细胞因子分析，并用流式细胞技术对细胞的状态进行检测(图5A-B)。

16.转录组测序(RNA-seq)

分离脾脏中的Treg细胞，提取RNA并进行转录组建库测序。明确不同敲除条件与不同处理条件下基因表达调控网络的改变。通过聚类分析和基因互作网络分析目的基因的作用通路以及下游应答靶基因(图7)。

17.单细胞测序(Single cell RNA-seq)

利用流式分选出脾脏中的Treg细胞，以及皮下脂肪中的CD45

18.染色质开放区域可及性测序(ATAC-seq)

通过流式分选收集不同处理条件下的各敲除组与野生型小鼠的脾脏Treg细胞，利用转座酶切割DNA获得染色质开放区域片段，对裸露的DNA片段进行测序，根据注释信息获得差异区域的基因列表与转录因子结合motif序列情况，以获得NCoR1调控的基因网络(图8)。

三、实验结果

(1)缺失NCoR1基因的Treg细胞对小鼠能量代谢水平的影响。结果揭示，敲除NCoR1基因后的小鼠呼吸代谢率和能量消耗比野生型显著增强(图2A-D)，并且在高脂诱导的肥胖模型(HFD)中，NCoR1缺失小鼠依然保持着同样的趋势(图2E-H)，说明Treg细胞在调节小鼠能量代谢方面发挥了重要作用。

(2)在Treg细胞缺失NCoR1基因后，小鼠的体重不易随着年龄的增长而增加(图3A-B)，小鼠体脂显著降低(图3C-E)并且在高脂诱导的肥胖模型中仍能保持一致的趋势(图3F-J)，说明NCoR1基因可通过Treg细胞调节机体的脂肪代谢过程。

(3)在冷刺激处理后，NCoR1缺失的小鼠表现出更高的存活率(图4A)，并且小鼠的皮下白色脂肪呈现出明显的褐化现象，与白脂褐化相关的基因(Cidea、CytoC、Pdk4)表达量也显著升高(图4B-C)，说明缺乏NCoR1基因的Treg细胞提高了小鼠的冷适应能力。

(4)流式分析显示NCoR1敲除的Treg细胞和对照组间的差异，敲除组小鼠的脂肪Treg标记明显增多(图5A-B)，说明敲除NCoR1后Treg细胞倾向于调控脂肪组织的免疫状态。

(5)体内用细胞因子IL33诱导刺激后，Treg细胞缺失NCoR1的小鼠脾脏和肠淋巴结中会出现更多的脂肪Treg细胞(图6)。

(6)对Treg细胞进行转录组测序，数据显示，NCoR1敲除后，EPAS1基因及脂肪Treg细胞的标记基因表达量显著上升(图7)，提示NCoR1基因的缺失可能影响Epas1，Klrg1及Il1rl1等基因的表达调控。

(7)NCoR1缺失后Treg细胞的染色质开放水平测序。结果显示敲除NCoR1后，Epas1基因区域开放性增加，而脂肪Treg相关的标记基因染色质开放区域则并无变化(图8)，提示Epas1基因可能受到NCoR1的调控并指示脂肪组织的代谢变化。

(8)皮下脂肪组织的免疫细胞类群单细胞测序，与对照组相比，Treg细胞敲除NCoR1后，会更倾向于向皮下脂肪组织聚集，同时T细胞比例也有显著提高(图9)。说明NCoR1缺失后可能通过Treg细胞影响脂肪组织的代谢调控。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。