一种基于等温扩增技术的检测微囊藻毒素合成基因mcyG的试剂盒及其方法

摘要

本发明公开了一种基于等温扩增技术的检测微囊藻毒素合成基因mcyG的试剂盒及方法，其特征是基于重组酶介导的等温扩增技术并结合侧向层析试纸技术开发的。所述试剂盒包括酶冻干粉末，引物，探针，反应缓冲液，硫酸镁溶液，侧向层析试纸，上样缓冲液，双蒸无菌水和mcyG的DNA。所述的方法为利用冻裂法或微波法快速提取DNA，反应体系置于37℃‑45℃，反应15min以上，产物稀释100‑200倍后，取5‑10μL上样试纸，试纸直立于PBST缓冲溶液中5‑10min，即可读取结果。本发明所述的试剂盒及方法灵敏度高，特异性强，操作简单，耗时短，可用于实际水体中产毒蓝藻的快速检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于等温扩增技术的检测微囊藻毒素合成基因mcyG的试剂盒及其方法，其特征是基于重组酶介导的等温扩增技术，可用于微囊藻毒素合成基因mcyG的野外现场快速检测，可实现对产毒蓝藻水华的监测和预警，属于水质监测技术领域。

背景技术

近年来,湖泊水库富营养化日趋常态化,进而导致蓝藻水华的频发.微囊藻是最常见的一种水华蓝藻,有些微囊藻会分泌微囊藻毒素，这类微囊藻被称为产毒微囊藻，如铜绿微囊藻、鱼害微囊藻。微囊藻毒素一旦进入水体中，会污染水源，微囊藻毒素可通过消化道途径进入人体，引起肝脏等器官的损伤，严重者中毒甚至死亡。

目前，产毒微囊藻的检测方法分为两类，一类通过检测微囊藻毒素来检测，方法包括液相色谱法、液相色谱质谱联用法、飞行时间质谱法、酶联免疫法、磷酸蛋白酶抑制法等，另一类通过检测微囊藻毒素合成基因（mcyA、mcyB、mcyE、mcyG等），如常规的PCR法、定量PCR法、环介导等温扩增技术（LAMP）法等。这些方法能够满足高灵敏检测微囊藻毒素的需要，对于微囊藻毒素的检测具有重要参考意义。但是这些方法中大多数对操作的人员和检测设备要求都很高，只有酶联免疫法和环介导等温扩增技术法可以应用于对产毒微囊藻的快速鉴定。酶联免疫法过于灵敏，检测结果假阳性概率很高，环介导等温扩增技术引物设计复杂，反应需在65℃孵育60min完成，耗时长，两种方法皆存在不足之处。因此，开发一种可适用于野外现场快速检测水中微囊藻毒素合成基因mcyG的试剂盒及其方法是十分必要的。

重组酶聚合酶扩增反应(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是一种基于重组酶介导的等温扩增技术，该反应能在37℃-45℃的温度范围进行（人体腋下温度就可以反应），能够在15-40分钟内进行单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，可用于微囊藻毒素合成基因mcyG的快速检测。本发明提供的一种检测微囊藻毒素合成基因mcyG试剂盒及其方法，是基于RPA技术并结合侧向层析试纸（lateral flow strips，LF）开发的，可实现对微囊藻毒素合成基因mcyG的野外现场快速检测。

发明内容

本发明的目的是针对现有微囊藻毒素及其产毒藻类快速检测技术的不足，提供一种基于等温扩增技术的检测微囊藻毒素合成基因mcyG的试剂盒及其方法，是基于重组酶介导的等温扩增技术并结合侧向层析试纸开发的，可适用于野外对微囊藻毒素合成基因mcyG的现场快速检测。

一种基于等温扩增技术的检测微囊藻毒素合成基因mcyG的试剂盒，所述试剂盒包括酶冻干粉末，正反向引物, 探针，RPA反应缓冲液，硫酸镁溶液，侧向层析试纸，上样缓冲液，双蒸无菌水和微囊藻毒素合成基因mcyG的DNA。

所述的RPA反应引物如表1所示，所设计的2对引物组合M1、M2均可以现实对微囊藻毒素合成基因mcyG的特异性扩增，所有反向引物的5’端均用Biotin（生物素）标记。

所述的反向引物的标记方式不限于Biotin标记，也可以用其他标记物代替，如DIG、FITC、FAM等。

所述的RPA反应探针如表1所示，探针mcyG-P在5’端用FAM标记，用THF（四氢呋喃碱基）代替第33个碱基，用SpacerC3封闭3’端。

所述的RPA反应探针mcyG-P对于M1和M2引物组合都适用，均可以特异性地检测微囊藻毒素合成基因mcyG。

所述的RPA反应探针的标记方式不限于FAM标记，也可以用其他标记物代替，如Biotin、FITC、FAM等。

所述的RPA反应探针3’端的封闭方式可以不限于SpacerC3，也可以用其他封闭方式代替，如磷酸盐、双脱氧核苷酸等。

表1-引物和探针序列

所述的RPA酶冻干粉末包括了噬菌体重组酶UvsX,辅助因子UvsY，DNA聚合酶，单链 DNA结合酶和dNTPs。

所述侧向层析试纸前端包被有FAM抗体修饰的纳米金粒子，检测线上包被有Biotin抗体，质控线包被有固定抗体（可以与带抗体的纳米金粒子结合显色）。

所述的侧向层析试纸前端包被的纳米金粒子上修饰的抗体不限于FAM抗体，可以用其他探针修饰的标记物的抗体代替。

所述的侧向层析试纸的检测线上包被的抗体可以不限于Biotin抗体，可以用其他反向引物修饰的标记物的抗体代替。

一种基于等温扩增技术的检测微囊藻毒素合成基因mcyG的方法，其实验原理如下：

本发明以微囊藻毒素合成基因mcyG的一段通用保守基因序列设计了RPA反应引物，对引物进行了组合，通过RPA反应实验筛选出了可特异性扩增微囊藻毒素合成基因mcyG的最优引物组合，并通过多次优化实验确定了最优的RPA反应体系。将实验室培养的产微囊藻毒素的蓝藻或含产毒蓝藻的实际水华样品通过冻裂法或微波法快速裂解细胞，释放DNA，高速离心后取上清液作为DNA实验样品。将DNA样品利用带有Biotin标记的引物组合和FAM标记的探针进行RPA反应，扩增出的产物同时带有Biotin和FAM标记。侧向层析试纸前端包被有带FAM抗体修饰的纳米金粒子，检测线上包被有Biotin抗体。当反应液进入试纸条时，带有Biotin和FAM标记的扩增产物就会通过抗原抗体结合作用，在检测线上形成生物素抗体-核酸金粒子复合物并显色，质控线上包被的定抗体可以直接与带FAM抗体的纳米金粒子结合显色。当质控线和检测线两条带同时显色时，就说明有特异性扩增产物生成，证明检测的样品中含有产微囊藻毒素的蓝藻。

一种基于等温扩增技术的检测微囊藻毒素合成基因mcyG的方法，按照以下操作步骤进行

（1）快速裂解蓝藻细胞提取DNA（以下两种方法均可）

冻裂法：取1mL蓝藻水样移至1.5 mL离心管，通过高速离心（15000rpm/min，5-10 min）收集蓝藻细胞，弃上清液，保留沉淀，加入50μL双蒸水或细胞裂解液，重悬蓝藻细胞，将置于液氮或-80℃冰箱3-5 min，取出样品，于38-45℃水浴锅或金属浴中恒温放置1-2min，重复冻融操作3次，高速离心样品（15000rpm/min，10 min），取上清液作为后续实验DNA样品；

微波法：取1mL蓝藻水样移至1.5 mL离心管，通过高速离心（15000rpm/min，5-10 min）收集蓝藻细胞，弃上清液，保留沉淀，加入50μL细胞裂解液，重悬蓝藻细胞，将重悬的蓝藻样品置于一个带盖的微波炉专用盒中，盖上盖子，放进微波炉中750 W功率或中高温，加热1-3min。取出样品，放入离心机中，高速离心样品（15000rpm/min，10 min），取上清液作为后续实验DNA样品；

（2）准备反应体系：

RPA酶冻干粉末中加入RPA反应缓冲液25-30μL,10 μmol/L正向引物1-2.4 μL，10 μmol/L反向引物1-2.4 μL，10 μmol/L探针0.1-0.6μL, 280 mmol/L醋酸镁2.5 μL, DNA模板0.5-1 μL，加双蒸无菌水补足体积至50 μL，以上操作均放置在冰盒进行，快速离心混匀；

（3）反应过程：反应体系置于37-40℃恒温环境（恒温水浴或金属浴）孵育15-30min。取出放置在冰盒上，将反应产物加入上样缓冲液按50-200倍稀释，取5-10μL直接加在侧向层析试纸的前端，将侧向层析试纸置于100-200μL的上样缓冲液孵育5-10min，取出，即可通过肉眼直接读取结果；

（4）结果判定：当侧向层析试纸上只有上端的质控线显色时，结果为阴性，说明检测的样品中不存在微囊藻毒素合成基因mcyG；当侧向层析试纸上质控线和检测线同时显色时，结果为阳性，说明检测的样品中存在微囊藻毒素合成基因mcyG；当侧向层析试纸上质控线不显色时，说明本次检测无效，需要重新检测。

与现有技术相比，本发明具有如下进步和效果:（1）本发明利用冻裂法或微波法快速提取微囊藻毒素合成基因mcyG的DNA，15分钟内就可以获得蓝藻DNA样品，缩短了DNA的提取时间；（2）本发明利用侧向层析试纸对RPA的扩增产物进行可视化定性和半定量检测，整个扩增反应在37℃-45℃范围的恒温条件下进行， 15-30分钟内即可通过肉眼观察试纸上的条带，直接读取结果，反应和检测过程均无需依赖特殊仪器。本发明所述的试剂盒及其检测方法，具有灵敏度高，特异性强，操作简单，检测时间短，可应用于水源地及其他水体中微囊藻毒素合成基因mcyG的现场快速检测，有助于对产毒蓝藻水华的防控和监测。

附图说明

图1，方法特异性验证结果，1-4为不产毒的蓝藻，5-12为产毒蓝藻。

图2，反应工作时间验证：以10

图3，方法灵敏度验证结果: 利用建立的方法对10倍梯度稀释的mcyG基因标准样品进行检测，浓度分别为10

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式做进一步的详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例

1.实验材料：RPA酶冻干粉末、硫酸镁溶液，RPA反应缓冲液，侧向层析试纸及其上样缓冲液，M1引物组合和探针mcyG-P。

2.反应体系：RPA酶冻干粉末中加入RPA反应缓冲液（Rehydration Buffer）29.5 μL, 10 μmol/L正向引物2μL，10 μmol/L反向引物2μL，10 μmol/L探针0.2μL， DNA模板 1 μL，280 mmol/L醋酸镁2.5 μL，加双蒸无菌水补足体积至50 μL，以上实验过程中试剂和酶均放置于冰盒上操作，离心混匀。

3.反应过程：反应体系置于37℃金属浴15min。取出，放置于冰盒上。

4.显色：将反应产物稀释100倍，即取1 μL反应产物与99 μL上样缓冲液混匀，取10μL直接加在侧向层析试纸的上样反应区，将侧向层析试纸垂直放置于100μL的上样缓冲液孵育10min后取出，即可通过肉眼直接读取结果。

5. 特异性实验：为了验证本检测试剂盒及其检测方法的特异性，取了几株产毒蓝藻DNA样品和几株非产毒蓝藻样品DNA，进行了检测，结果如图1所示。

6. 反应工作时间范围验证：为了验证本检测试剂盒及其检测方法的检测产物所需的反应扩增时间，以10

7.灵敏度实验：为了验证本检测试剂盒及其检测方法的检测限和灵敏度，将标准的微囊藻毒素合成基因mcyG的DNA按10倍梯度稀释作为模板，进行了检测，结果如图3所示。

结果分析：图1中，1-4为不产毒蓝藻，5-12为产毒蓝藻，5-12检测时质控线（Control）和检测线（Test）两条带均显色，阴性对照组1-4只有质控线（Control）一条带显色。图2中，以10