一种基于拉曼光谱技术检测桑椹中花色素苷的方法

摘要

本发明公开了一种基于拉曼光谱技术检测桑椹中花色素苷的方法，包括以下步骤：采用拉曼光谱仪分别采集矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷、矢车菊素‑3‑O‑芸香糖苷、天竺葵素‑3‑O‑葡萄糖苷、混合花色素苷标准溶液及桑椹样品的拉曼谱图；分析得到花色素苷的光谱信息，并确定拉曼特征峰；采集的桑椹样品拉曼光谱经过预处理和波长变量筛选并结合数学模型建立花色素苷含量预测模型。本发明提供的方法可以实现矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷、天竺葵素‑3‑O‑葡萄糖苷两种花色素苷的快速鉴别，并能对桑椹样品中的花色素苷进行定性及定量检测；本发明提供的预处理方法适用性较好，建立的桑椹花色素苷定量模型预测精度较高，具有检测速度快、操作简单、结果准确等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及光谱学、果品品质快速检测领域，尤其涉及一种基于拉曼光谱技术检测桑椹中花色素苷的方法。

背景技术

花色素苷是一种天然的水溶性黄酮类色素，最常见的是以矢车菊素、天竺葵素、飞燕草素、芍药素、牵牛素和锦葵素等6种花青素为苷元与糖和有机酸结合形成的花色素苷，具有保护人体心血管、降血糖、护肝脏、抗癌和提高视力等功能。桑椹因含有丰富的花色素苷而成为加工食品、保健品和药品的良好原料。花色素苷不稳定，易受PH值的变化、光照、热以及某些金属离子的影响致使颜色变淡，生理功能降低，给食品加工制品的品质保持造成困难，而某些产品宣称含有丰富的花色素苷以此欺骗消费者。因此，对花色素苷的检测研究，引起了越来越多研究者的重视。

目前花色素苷的常用检测方法有高效液相色谱法、紫外-可见光谱法，一般需要对样品中的花色素苷进行提取，检测步骤繁琐，具有耗时长、破坏性大的缺点，难以满足样本快速检测的需求，且无法实现花色素苷的分子结构分析，检测过程还会造成大量样品的损耗。因此需要建立一种快速、准确、简单的花色素苷检测方法。

拉曼光谱是以拉曼效应为基础建立的分子结构表征技术，光波被散射后频率发生变化，频率位移与发生散射的分子结构有关，从而完成对不同结构分子的检测。拉曼光谱无需样品前处理，样品可通过光线测量，方法快速、简单、可重复性强。目前已经广泛应用于食品中糖类、蛋白质、脂肪、DNA、维生素和色素等成分的定性和定量分析。但是国内外采用拉曼光谱技术对花色素苷的应用研究较少，未见有拉曼光谱技术对花色素苷含量检测的文献报道。

发明内容

本发明的主要目的在于解决传统检测方法操作复杂、检测速度慢，难以实现花色素苷结构分析及快速鉴别，及现有快速检测技术的预测精度有待提高的问题，提供了一种基于拉曼光谱技术检测桑椹中花色素苷的方法。本发明提供的方法可以快速对矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷进行鉴别，并且能实现桑椹中花色素苷的定性定量预测。本发明不需要样品前处理过程，不损耗样品，具有检测速度快、成本低、操作简单及预测精度较高等优点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于拉曼光谱技术检测桑椹中花色素苷的方法，包括以下步骤：

1)采用拉曼光谱仪分别采集矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷及混合花色素苷的标准溶液拉曼谱图；

2)采用拉曼光谱仪采集桑椹样品的原始拉曼光谱图；

3)将桑椹样品的拉曼光谱图与4种标准溶液拉曼谱图进行比对，确定拉曼特征峰；

4)测定桑椹样品的花色素苷含量，作为参考值；

5)对桑椹样品的原始拉曼光谱图进行预处理得到样品预处理谱图，并对桑椹样品预处理谱图进行特征波长筛选，筛选出特征光谱变量；

6)结合特征光谱变量与参考值采用支持向量机回归(SVR)或偏最小二乘回归(PLSR)的方法建立定量预测模型；

利用拉曼光谱仪和定量预测模型对桑椹中的花色素苷进行定量检测。

采用上述技术方案的有益效果：本发明将拉曼光谱结合谱图预处理及波长筛选方法的适用性较好，能够实现对桑椹样品花色素苷含量的快速、准确预测。

优选的，所述步骤1)标准溶液均采用纯水配制，且纯度均大于95％；

所述步骤1)中混合花色素苷标准溶液中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷与天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的含量比为45：45：10。

采用上述技术方案的有益效果：为了准确的使用拉曼光谱对桑椹中的花色素苷进行定性分析，本发明中的混合花色素苷标准溶液是模拟桑椹中主要花色素苷的含量比例进行配制的。

优选的，其特征在于，所述拉曼光谱仪的采集参数为激发波长785nm，激光功率300-350mW，平均次数1-5次，积分时间1000-5000ms。

采用上述技术方案的有益效果：为了降低仪器本身对样品光谱采集的影响，需要对仪器的采集参数进行优化。本发明中选择拉曼光谱仪的参数时采用控制变量法，在保证其他参数不变的情况下改变其中一个参数，观察参数变化对拉曼特征峰的影响，并确定了最佳采集参数，即激光功率350mW、平均次数2次、积分时间3000ms。

优选的，其特征在于，采用拉曼光谱仪采集拉曼图谱时将标准溶液或样品溶液置于石英比色皿中，石英比色皿与拉曼探头的间距为3-5mm。

采用上述技术方案的有益效果：标准溶液或样品溶液置于石英比色皿中可避免样品池对光谱采集产生的影响。

优选的，其特征在于，所述步骤3)中桑椹总花色素苷拉曼特征峰的位置为545cm

采用上述技术方案的有益效果：本发明对四种标准溶液拉曼图谱进行分析，发现矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷及混合花色素苷在545cm

将桑椹样品基线校正谱图与花色素苷标准溶液的拉曼谱图进行比较，根据花色素苷标准溶液的拉曼光谱峰位特征可实现桑椹中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的鉴别。

具体的，花色素苷在1400-1650cm

优选的，将799cm

优选的，其特征在于，所述步骤4)采用pH示差法测定桑椹样品的总花色素苷含量。

优选的，其特征在于，所述步骤5)中图谱预处理方法为多元散射校正(MSC)、基线校正(airPLS)、归一化(Normalized)中的一种或几种的组合。

优选的，所述步骤5)中图谱预处理方法为多元散射校正(MSC)与基线校正(airPLS)和归一化(Normalized)三种的组合，即airPLS+MSC+Normalized。

优选的，所述步骤5)采用竞争性自适应重加权算法(CARS)对桑椹样品预处理谱图进行特征波长筛选，且波长范围选择400-1800cm

采用上述技术方案的有益效果：采用多元散射校正(MSC)、基线校正(airPLS)、归一化(Normalized)及其组合方法进行光谱预处理可以消除基线漂移、噪音、散射的影响，其中最佳预处理方法为airPLS+MSC+Normalized，经过预处理的光谱采用CARS算法在400-1800cm

优选的，所述步骤6)采用支持向量机回归(SVR)建立花色素苷的定量预测模型，所述支持向量机回归采用RBF核函数，且惩罚因子C为32.0，核系数g为0.001。

与现有技术相比，本发明提供了一种基于拉曼特征峰的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷鉴别方法及桑椹花色素苷的定性分析和定量预测方法，为桑椹花色素苷的检测提供了新的研究方向。

通过优化仪器参数，避免了采集参数对光谱采集产生的影响；本发明中提供的处理方法适用性较好，基于已有数据建立的预测模型的决定系数达到0.94，预测性能较高。该方法操作简单、检测速度快，解决了传统方法中需要样品前处理、操作繁琐、不能快速检测的问题；相比于红外光谱，拉曼光谱不受水分子的影响，更适合于桑椹的花色素苷检测。此外，该方法也可能适用于其他水果，为其他水果花色素苷的检测提供了一定参考。

附图说明

图1为基于拉曼光谱技术的桑椹花色素苷的检测方法流程图；

图2为不同激光功率下混合花色素苷标准溶液拉曼光谱图；

图3为不同积分时间下混合花色素苷标准溶液拉曼光谱图；

图4为不同平均次数下混合花色素苷标准溶液拉曼光谱图；

图5为三种单品花色素苷标准溶液的原始拉曼谱图；

图6为基线校正以后三种单品花色素苷标准溶液的拉曼光谱图；

图7为基线校正以后2mg/mL混合花色素苷标准溶液的拉曼光谱图；

图8为桑椹样品的原始拉曼光谱图；

图9为基线校正以后桑椹样品的拉曼光谱图；

图10为桑椹样品的airPLS+MSC+Normalized预处理拉曼光谱图；

图11为CARS算法筛选出的波长变量在桑椹样品原始拉曼光谱中的分布图；

图12为经过airPLS+MSC+Normalized预处理及CARS波长筛选后采用支持向量机回归建立的定量预测模型的建模集及预测集效果图；

其中，C3G为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷；C3R为矢车菊素-3-O-芸香糖苷；P3G为天竺葵素-3-O-葡萄糖苷。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所用的拉曼光谱仪为拉曼光谱仪为实验室自行搭建，主要包括QE-Pro光谱仪(OceanOpticis公司)、Laser-785nm激光器、传输光纤、拉曼检测探头和置物台五个部分。785nm激光束通过传输光纤经拉曼检测探头聚焦样品表面并激发拉曼散射光，检测探头捕获拉曼信号汇集到光纤送入光谱仪，经分光聚焦于CCD阵列，实现对探测样品拉曼散射光的高效收集，波长检测范围为200～2870cm

本发明所用的桑椹样品为“大十”，购买于杭州下沙超市，并用冰盒运输至实验室。挑选大小均匀的无机械损伤桑椹510个，去除果柄，用纯水清洗干净，每取10个桑椹作为一个样本采集完光谱之后立即榨汁并过滤，共计51个样本，将制得的样本溶液暂存于4℃冰箱中用于花色素苷的理化检测。

本发明所用的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，矢车菊素-3-O-芸香糖苷，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷三种标准品的纯度均大于95％，模拟桑椹中的花色素苷含量按矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，矢车菊素-3-O-芸香糖苷，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷为45％、45％、10％的比例配制成2mg/mL混合标准溶液，用于提取桑椹总花色素苷拉曼光谱特征峰，溶液配制所用水均为纯水。

针对上述样本，本实施例的具体步骤如下：

(1)拉曼光谱仪的参数优化

每次采集光谱时，提前将拉曼光谱仪打开并预热15分钟，然后将待采集样品放在拉曼探头之下，溶液样品置于1mL石英比色皿中，探头与样品的距离保持在3-5mm之间。

激光功率选择：取2mg/mL混合标准溶液6份，积分时间选定3000ms，固定平均次数2次，分别设置激光功率为300、310、320、330、340、350mW，重复三次，考察不同激光功率下花色素苷拉曼特征峰强度大小。

如图2所示，当激光功率从300mW增加到350mW时，拉曼光谱特征峰呈小幅增加，背景噪声逐渐降低，350mW时特征峰强最大，为了避免功率过大对样品中的花色素苷造成损失，最佳功率为350mW。

积分时间选择：取2mg/mL混合标准溶液5份，固定平均次数2次，激光功率选择350mW，分别设置积分时间为1000、2000、3000、4000、5000ms，重复三次，考察不同积分时间下的花色素苷拉曼特征峰强度大小。

如图3所示，随着积分时间的增加，拉曼光谱的特征峰呈现先升高后下降的趋势，积分时间为3000ms时光谱特征峰最强。分析其原因可能是由于3000ms之前随着积分时间的增加，拉曼效应越明显，光谱特征峰越强；3000ms之后由于积分时间过长，破坏了样品中部分花色素苷的结构，造成了花色素苷的损失，从而降低了光谱的峰强，其中最佳积分时间为3000ms。

平均次数选择：取2mg/mL混合标准溶液5份，积分时间选定3000ms，激光功率选定350mW，分别设置积分次数为1、2、3、4、5次，重复三次，考察不同平均次数下花色素苷拉曼特征峰强度大小。

如图4所示，随着平均次数的增加，不同平均次数的拉曼光谱特征峰基本重合，说明平均次数对拉曼光谱的影响较小，为了提高拉曼光谱的采集效率，最佳平均次数为2次。

最终确定的采集参数为积分时间3000ms，激光功率350mW，平均次数为2次。

(2)桑椹花色素苷的定性分析及矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的鉴别

采集矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和混合花色素苷标准溶液的拉曼光谱时采用(1)中确定的参数，重复采集三次，取均值作为最后的原始光谱。原始光谱及基线校正以后的花色素苷标准溶液的拉曼光谱如图5、图6所示，花色素苷在1400-1650cm

对比桑椹样品的原始拉曼光谱，如图8所示，某些拉曼峰的位置与混合花色素苷相比发生了偏移，其在545cm

如图6、图7所示，除545cm

其中桑椹样品采集时每个桑椹取不同部位采集两次，每采集10个桑椹作为一个样本进行花色素苷理化测定，最后取均值作为一个样本的原始光谱。

(3)花色素苷含量参考值的获取

获取完桑椹样品的拉曼光谱之后立即将桑椹榨汁并过滤，然后采用常规pH示差法进行总花色素苷含量测定。测定方法为：取1mL适当稀释的桑椹汁样液，分别用pH1.0的氯化钾缓冲溶液和pH4.5的乙酸钠缓冲溶液定容至10mL，混匀，于20℃水浴中平衡90min，用紫外-可见分光光度计分别在510nm和700nm处测定吸光值，以纯水做空白，重复三次。

采用KS算法将桑椹样本按4:1划分为建模集和预测集，结果如下表1-2：

表1桑椹花色素苷数据划分

表2桑椹样本集的统计信息

(4)光谱预处理

本实施例中光谱预处理及建立预测模型均采用MATLABR2018b软件，采用多元散射校正(MSC)、基线校正(airPLS)、归一化(Normalized)及其组合方法对桑椹样品原始拉曼光谱进行预处理。多元散射矫正能够有效地消除光谱散射的影响，增强与成分含量相关的光谱信息；基线校正能够消除背景噪声以及基线漂移；归一化的作用是消除数据量纲的影响，提高模型的运行速度。其中最佳预处理为airPLS+MSC+Normalized，结合PLSR的建模结果如表3。

表3不同预处理方式的PLSR建模效果

由于拉曼光谱中变量信息较多，变量之间存在较多冗余及无用信息，降低了模型的精度及速度，因此在建模之前采用CARS算法对光谱进行光谱变量筛选，筛选时波长范围选取400-1800cm

表4 CARS波长筛选出的特征波长(cm

(5)定量预测模型的建立

本实施例采用偏最小二乘回归(PLSR)，支持向量机回归(SVR)两种方法建立了花色素苷的定量预测模型，采用决定系数(R

PLSR和SVR模型的输入变量为经过airPLS+MSC+Normalized预处理及CARS波长筛选后的拉曼位移处的拉曼强度。其中支持向量机回归采用RBF核函数，选择最佳参数惩罚因子C为32.0，核系数g为0.001，两种模型的输出变量均为pH示差法测得的桑椹总花色素苷含量。建模集及预测集的数据均一致，建模集含40个样本数据，预测集含11个样本数据。

表5两种模型建模结果

综合对比两种模型的预测精度来看，采用airPLS+MSC+Normalized预处理及CARS波长筛选后的偏最小二乘回归和支持向量机回归模型的预测精度均较高，支持向量机回归模型预测效果最好，如图12所示，偏最小二乘回归模型次之。

试验表明拉曼光谱结合airPLS+MSC+Normalized预处理及CARS波长筛选方法的适用性较好，能够实现对桑椹样品花色素苷含量的快速、准确预测。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。