多潜能细胞活性物联合富血小板血浆的骨关节炎治疗药物及制法和应用

摘要

本发明涉及干细胞制剂技术领域，特别涉及一种外周血多潜能细胞活性物联合富血小板血浆制备用于骨关节炎治疗的药物的制备方法及其制备方法和应用，包括外周血多潜能细胞活性物冻干粉、富血小板血浆和NSADs。获取外周血多潜能细胞活性物冻干粉，加入富血小板血浆，获得外周血多潜能细胞活性物混悬液，然后向混悬液中逐滴添加NSADs，边加边混合均匀。本发明通过采用外周血多潜能细胞活性物结合富血小板血浆和NSADs，能够阻止炎性介质的释放，减轻炎症反应，从而减轻组织损伤；并且，在减轻患者疼痛的同时提高类风湿性关节炎的治疗效果，不仅缩短了治疗时间，而且不易复发。

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞制剂技术领域，特别涉及一种外周血多潜能细胞活性物联合富血小板血浆制备用于骨关节炎治疗的药物的制备方法及其制备方法和应用。

背景技术

类风湿性关节炎是一种慢性炎症性免疫性疾病，以血管炎和滑膜炎为基本病理特征，随着病情的发展，继而以滑膜增殖和赘生、关节软骨及软骨下骨侵蚀为主要病理改变，最终导致关节强直畸形和功能丧失；目前认为自身抗原介导的超敏反应以及非抗原特异性炎症反应是导致破坏性病变的主要原因。

对于RA的治疗，传统主要使用非甾体类抗炎药物、抗风湿药，但病情复发率高，副作用很明显，而且不能改变病情的进展。更为严重的要进行关节置换，而关节置换有严重的副作用，且人造关节寿命有限，会导致无法修复受损的关节软骨，无法控制这些疾病的进一步发展。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种外周血多潜能细胞活性物联合富血小板血浆制备用于骨关节炎治疗的药物及其制备方法和应用，解决现有技术中类风湿性关节炎治疗效率差等缺陷。

为解决上述的技术问题，具体技术方案：

一种外周血多潜能细胞活性物联合富血小板血浆制备用于骨关节炎治疗的药物，包括外周血多潜能细胞活性物冻干粉、富血小板血浆和NSADs。

所述的外周血多潜能细胞活性物冻干粉在药物中的含量为10～15ng/g；所述的富血小板血浆中的人血白蛋白的在药物中的质量分数含量为0.5～2％；NSADs在药物中的含量浓度为25～40mg/ml。

该用于治疗骨关节炎的药物的制备方法，包括以下步骤：获取外周血多潜能细胞活性物冻干粉，加入富血小板血浆，获得外周血多潜能细胞活性物混悬液，然后向混悬液中逐滴添加NSADs，边加边混合均匀。

其中，所述的外周血多潜能细胞活性物冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

(1)外源因子检测；采用诊断试剂盒对吸取的外周血上清液进行外源因子检测，从而确保外周血不含有外源因子；

(2)外周血干细胞的原代分离、培养和传代；所述的外周血干细胞的原代分离、培养和传代具体过程包括：

首先将外周血稀释，吹散后进行离心，小心抽取底部沉淀物，然后用消化液对抽取得到的底部沉淀物进行消化，所述的消化液为浓度为0.1％～0.3％的胰蛋白酶或浓度为0.5％～2％的胶原酶；

接着再次离心，吸取细胞放入一次性培养皿中，并加入适量间充质干细胞无血清培养基，置于37℃的环境，填充5％的CO

(3)间充质干细胞的鉴定；

(4)上清液的收集；所述的上清液的为P3～P5代次细胞上清液，当细胞生长到密度达到70％～80％时，收集上清液，然后补充到原体积，再进行培养，待细胞长到密度达到70％～80％时再次收集上清液；

(5)冻干粉的制备；所述的冻干粉的制备过程包括以下步骤：

首先将冻干粉保护剂加入到收集到的上清液中，再通过0.22μm滤膜过滤除菌，将过滤液分装到西林瓶中，半加塞，置于冻干机中，按冷冻干燥程序对过滤液进行冷冻干燥，压塞后取出；所述的冻干保护剂为甘露醇、右旋糖酐、蔗糖中的一种或多种混合。

所述的冷冻干燥程序为：首先-50℃预冷，然后抽真空，在-50℃保持6h；然后升温到-35℃，保持20h；逐步升温到-20℃，保持4h；再升温到0℃～10℃，保持4h～6h；再升温10℃～25℃，保持4h；最后25℃，干燥6h。

(6)对所述的冻干粉的干细胞活性物进行检测；对所述的干细胞活性物资进行检测时，用2ml量的上清液冻干后的粉剂加4ml溶媒稀释，然后试剂盒测定干细胞活性因子的含量。溶媒包括甘油和玻尿酸。

该用于治疗骨关节炎的药物在治疗类风湿性关节炎中应用。

本发明提供的一种外周血多潜能细胞活性物联合富血小板血浆制备用于骨关节炎治疗的药物及其制备方法和应用，通过采用外周血多潜能细胞活性物结合富血小板血浆和NSADs，能够阻止炎性介质的释放，减轻炎症反应，从而减轻组织损伤；并且，在减轻患者疼痛的同时提高类风湿性关节炎的治疗效果，不仅缩短了治疗时间，而且不易复发。

具体实施方式

为了使本领域相关技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。

本发明提供的一种外周血多潜能细胞活性物联合富血小板血浆制备用于骨关节炎治疗的药物，包括外周血多潜能细胞活性物冻干粉、富血小板血浆和NSADs。

外周血中存在着少量的多潜能间充质干细胞。它们具有类似骨髓间充质干细胞的生物学特性，可以自我增殖，能多向分化。在体外诱导和体内可以分化形成中胚层及其他胚层组织。外多潜能间充质干细胞在体外能够分化为成骨、软骨、脂肪、腱、肌肉等细胞，能够参与受损组织的再生修复；关节病变能够促进间充质干细胞向病变滑膜聚集，并促使间充质干细胞分化为软骨细胞等，从而修复损伤的关节组织。另外，多潜能间充质干细胞能够分泌多种细胞因子，具有营养作用，能够促进干细胞的增殖和分化；且多潜能间充质干细胞具有独特的免疫调节作用，自体或异体的间充质干细胞加入到有丝分裂原刺激的外周血淋巴细胞培养体系中，均能明显抑制T淋巴细胞的增殖活化，对免疫网络的调节起重要作用，能够从根本上调整患者病态免疫系统。此外，多潜能间充质干细胞分化成其他类型的细胞，也继续保留它的免疫调节作用；除此之外，多潜能间充质干细胞具有趋化作用，可以阻止炎性介质的释放，减轻炎症反应，从而减轻组织损伤，有利于组织病情进展。

NSADs配合人血白蛋白和外周血多潜能细胞使用，用于减轻炎症反应，调节免疫反应，以提高治疗效率；另外，富血小板血浆中人血白蛋白同时能够为多潜能间充质干细胞提供一定的营养支持，以使多潜能间充质干细胞保持其细胞活性，延长其存活时间，并提高药物的生物相容性，减轻免疫排除反应。

其中，所述的外周血多潜能细胞活性物冻干粉在药物中的含量为10～15ng/g；所述的富血小板血浆中的人血白蛋白的在药物中的质量分数含量为0.5～2％；NSADs在药物中的含量浓度为25～40mg/ml。

获取外周血多潜能细胞活性物冻干粉，加入富血小板血浆，获得外周血多潜能细胞活性物混悬液，然后向混悬液中逐滴添加NSADs，边加边混合均匀。

其中所述的外周血多潜能细胞活性物冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

(1)外源因子检测；采用诊断试剂盒对吸取的外周血上清液进行外源因子检测，从而确保外周血不含有外源因子；

(2)外周血干细胞的原代分离、培养和传代；所述的外周血干细胞的原代分离、培养和传代具体过程包括：

首先将外周血稀释，吹散后进行离心，小心抽取底部沉淀物，然后用消化液对抽取得到的底部沉淀物进行消化，所述的消化液为浓度为0.1％～0.3％的胰蛋白酶或浓度为0.5％～2％的胶原酶；

接着再次离心，吸取细胞放入一次性培养皿中，并加入适量间充质干细胞无血清培养基，置于37℃的环境，填充5％的CO

(3)间充质干细胞的鉴定；

(4)上清液的收集；所述的上清液的为P3～P5代次细胞上清液，当细胞生长到密度达到70％～80％时，收集上清液，然后补充到原体积，再进行培养，待细胞长到密度达到70％～80％时再次收集上清液；

(5)冻干粉的制备；首先将冻干粉保护剂加入到收集到的上清液中，再通过0.22μm滤膜过滤除菌，将过滤液分装到西林瓶中，半加塞，置于冻干机中，按冷冻干燥程序对过滤液进行冷冻干燥，压塞后取出；所述的冻干保护剂为甘露醇、右旋糖酐、蔗糖中的一种或多种混合。

冷冻干燥程序为：首先-50℃预冷，然后抽真空，在-50℃保持6h；然后升温到-35℃，保持20h；逐步升温到-20℃，保持4h；再升温到0℃～10℃，保持4h～6h；再升温10℃～25℃，保持4h；最后25℃，干燥6h。

(6)对所述的冻干粉的干细胞活性物进行检测；对所述的干细胞活性物资进行检测时，用2ml量的上清液冻干后的粉剂加4ml溶媒稀释，然后试剂盒测定干细胞活性因子的含量。溶媒包括甘油和玻尿酸。

为验证本发明提供的用于治疗骨关节炎的药物的有益效果，设置以下实验：

选出30名患者，按照1987年美国风湿病学会(ARA)修订的诊断标准选择，具体的为：

(1)晨僵至少1小时(≥6周)；(2)腕掌指关节或近端指间关节肿(≥6周)； (3)3个或者3个以上关节肿(≥6周)；(4)对称性关节肿(≥6周)；(5)皮下类风湿结节；(6)手线变化；(7)类风湿因子阳性；

具有以上四项即可诊断为类风湿性关节炎患者。

按照三组随机分位：

(1)实验组：10例患者.均将本发明提供的药物30ml静脉输注，同时，将药物用生理盐水按1∶4比例稀释，沿脊柱两侧竖脊肌及骶髂关节区域点状注射；

(2)第一对照组：10例患者，只输注的间充质干细胞制剂。

(3)第二对照组：10例患者，只输注的是单纯NSADs制剂。

关节的疾病活动度评分标准为：检查双侧近端指间关节、掌指关节、腕关节、肘关节、肩关节及膝关节共计28个关节；得出关节触痛数(T28)和肿胀关节数(SW28)，并结合红细胞沉降率(ESR)，采用以下公式计算：

DAS28＝[0.56×T28+0.28×SW28+0.70×Ln(ESR)]×1.08+0.16；

DAS28≤2.6分提示病情处于缓解期；

2.6～3.2分之间提示病情处于低活动度；

3.2～5.1分之间提示病情为中活动度；

＞5.1分提示病情为高活动度。

表1各组患者在治疗前的DAS28平均分

以下数据为患者治疗4～14个月内的随访记录，如表2；

表2各组患者平均分

结果显示，实验组患者在治疗第10个月，DAS28≤2.6分，病情即处于缓解期；而第一对照组和第二对照组患者在治疗第14个月时仍未得到缓解，由此说明本发明提供的干细胞制剂缩短了类风湿性关节炎的治疗周期，提高了治疗效率。

以上仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。