一种基于原子力显微术的肿瘤外泌体诱导细胞恶变过程的检测方法

摘要

本发明提供了一种基于原子力显微术的肿瘤来源外泌体诱导细胞恶变的检测方法，属于原子力显微术成像技术领域。该外泌体通过超滤管离心的方法处理得到，将肿瘤来源外泌体与正常细胞共培养得到恶性细胞模型，检测细胞的增殖和迁移能力，同时通过原子力显微术对细胞进行多维信息检测。本发明所提供的检测方法，可在液态环境下对良性细胞转化的恶性细胞模型进行实时成像、定量监测、可视化操作，获得细胞的整体形态、弹性模量、粘附力、表面粗糙度和膜电位(力学特性和电学特性)变化，实现细胞恶性演变动态过程的多维信息检测，为细胞异质性和细胞恶变新理论研究提供技术支持。

说明书

技术领域

本发明涉及原子力显微术成像技术领域，具体涉及一种基于原子力显微术的肿瘤来源外泌体诱导细胞恶变过程的检测方法。

背景技术

外泌体是一种由细胞分泌到胞外形成的具有脂质双层膜结构的微小囊泡，目前认为其直径大小约为30-150nm。外泌体富含核酸、蛋白质和脂质，广泛分布于血液、唾液和尿液等体液中，作为细胞间通讯的媒介，具有多种生物学功能。近年来，多项研究表明，外泌体的分泌和功能异常在恶性肿瘤的发生、发展和治疗中起着至关重要的作用。

肿瘤细胞分泌的外泌体(称为肿瘤来源外泌体)，研究表明，肿瘤来源外泌体通过细胞-细胞间通讯、血管生成和增殖途径的激活，从而增强受体细胞的侵袭和迁移能力，最终诱导细胞发生恶变。

原子力显微术作为纳米尺度上细胞成像与操作的工具，不仅可以对活细胞表面超微形貌进行可视化表征，同时还可通过压痕技术对细胞机械特性(如弹性模量、粘附力)进行定量测量。研究证实，细胞的力学特性可以作为细胞状态监测的一个有效的物理标志。细胞骨架、细胞的粘附特性与细胞运动、分化和转移等关联密切。细胞的病理改变可以导致细胞力学性质的改变，例如细胞形变能力的改变，细胞粘连特性的改变，从而影响细胞生理特性的改变如蛋白表达异常，最后导致癌症的发生和发展。研究发现，通过纳米检测细胞力学特性能够对肿瘤细胞侵袭力进行评估，杨氏模量能定量描述肿瘤细胞侵袭力的改变。恶性程度高低不同的肿瘤细胞骨架分布不同，恶性程度低的细胞，细胞骨架排列相对有序，而恶性程度高的细胞，细胞内部骨架紊乱，细胞较柔软，有利于细胞转移。

然而，传统生物学方法是从外泌体-细胞间的作用机理研究外泌体-细胞间的作用，忽视了外泌体对细胞物理特性的改变，无法直观地对细胞进行多维信息检测。而且尚未有报导通过肿瘤来源外泌体诱导良性细胞转化形成恶性细胞模型的建立。本发明研究细胞恶变过程的多维信息检测，突破传统光学显微技术在不加标记干预的条件下只能在亚微米水平上观测活细胞，膜片钳和MEA只能在微米尺度上测量电信号，光镊和单探针原子力显微镜只能进行单一参数测量，其他方法只能测量死细胞的局限，以生物医学、物理学、化学、信息学、原子力显微术成像与操纵技术为基础，在可控环境条件下对单细胞的形态、力学、电学多维信息进行检测，在正常细胞与肿瘤来源外泌体共培养的环境下，研究细胞恶性演变的动态过程。

发明内容

本发明技术解决的问题：提供了一种基于原子力显微术的肿瘤来源外泌体(或其他致癌物)诱导细胞恶变过程的检测方法，通过对良性细胞转化的恶性细胞模型进行多维信息检测,研究细胞恶性演变的动态过程。

本发明的技术方案为：通过超滤管离心的方法获取肿瘤来源外泌体，对所获取的肿瘤来源外泌体进行验证后，将肿瘤来源外泌体与正常细胞共培养，使用原子力显微术在液态环境下对良性细胞转化的恶性细胞模型进行多维可视化信息的检测与表征。具体包括以下步骤：

(1)用接种液培养肿瘤细胞至铺满培养皿底，取肿瘤细胞上清液，通过高速离心机进行梯度离心，用0.22μm孔径的滤器过滤梯度离心后的上清液，再将过滤后的上清液加入到超滤管中进行离心，最后加入磷酸盐缓冲液再次离心得到肿瘤来源外泌体。

(2)利用扫描电镜对步骤(1)获取的肿瘤来源外泌体进行粒径大小分析，通过蛋白免疫印记法对相关蛋白生物标志物CD9,CD63和CD81进行验证。

(3)利用MTT法筛选肿瘤来源外泌体浓度，将1500μg/mL浓度的肿瘤来源外泌体与正常细胞共培养，检测细胞的增殖和迁移能力。

(4)使用原子力显微术在液态环境下对良性细胞转化的恶性细胞模型进行多维信息检测。

优选的，所述接种液为含有体积分数为10％的无外泌体胎牛血清的DMEM液体培养基。

优选的，步骤(1)中所述的用接种液培养肿瘤细胞至铺满培养皿底，取上清液进行梯度离心，包括以下步骤：

步骤I,取细胞上清液至离心管，放入离心机中，离心参数设定为温度4℃，转速2,000×g，时间10min。

步骤II,取步骤I离心后的上清液至新的离心管，放入离心机中，离心参数设定为温度4℃，转速10,000×g，时间30min。

优选的，步骤(1)中所述的将经滤器过滤后的上清液加入到超滤管中进行离心，然后向超滤管中加入磷酸盐缓冲液再次离心得到肿瘤来源外泌体，离心参数均为温度4℃，转速4,000×g，时间30min。

本发明所具有的有益效果包括：

建立肿瘤来源外泌体(或其他致癌物)促良性细胞转化为恶性细胞的模型，基于原子力显微术检测细胞恶性演变的动态过程，在分子水平上对细胞进行成像、观测、操作，获得细胞的整体形态、物理特性(力学特性和电学特性)、抗原-抗体、配体-受体及特定肿瘤生物标志物等信息，实现细胞恶性演变动态过程的多维信息检测，具有实时、定量、可视化、可操纵等优势，揭示对应介尺度结构的行为主导机制，有助于揭示癌症发生、发展的机理，并为癌症的预防和治疗提供理论与实验基础，使其成为一种新标准，填补生物医学领域的空白。

附图说明

图1为肝癌来源外泌体(HCC-LM3-exos)对肝细胞(HL-7702)存活率的影响，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图2为肝癌来源外泌体(HCC-LM3-exos)对肝细胞(HL-7702)迁移能力的影响。

图3为原子力纳米显微检测肝癌来源外泌体(HCC-LM3-exos)对肝细胞(HL-7702)形貌及物理特性的改变。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明例子做进一步详细说明。

实施例1

将HL-7702细胞以8×10

实施例2

将HL-7702细胞接种于6孔板中。待细胞融合率达到培养皿底面积的90％左右，用200μL黄色无菌枪头于各孔中央垂直划一直线，PBS清洗2次，去除漂浮细胞。实验组加入含1500μg/mL HCC-LM3-exos的培养基，对照组用正常培养基培养。分别在0h、24h和48h对细胞的划痕位置进行拍照。如图2所示，结果表明，实验组细胞的伤口愈合率要明显高于对照组，且随着时间的增加，迁移效果更为显著。

实施例3

利用原子力纳米操纵系统测量细胞的形态、弹性模量、粘附力和表面粗糙度。首先，将HL-7702细胞以适当密度接种在盖玻片上，在37℃，5％CO

以上对本发明提供的一种基于原子力显微术的肿瘤来源外泌体诱导细胞恶变过程的检测方法进行了详细介绍，提供以上实例仅仅是为了帮助理解本发明的方法，而并非要限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定，不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改，均应涵盖在本发明的范围之内。