负调节番茄叶片光合作用基因的用途

摘要

本发明公开了一种负调节番茄叶片光合作用基因的用途，在番茄中敲除Solyc05g005230基因能增加番茄叶片的光合作用效率；基因Solyc05g005230核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。Solyc05g005230基因敲除株系5230‑KO叶片中叶绿素a、叶绿素b与类胡萝卜素等光合色素的含量均显著增加；Solyc05g005230基因敲除株系5230‑KO叶片的净光合速率、气孔导度和蒸腾作用等光合作用的主要指标均显著上升。

说明书

技术领域

本发明涉及一个增加番茄叶片光合作用效率的基因及其应用，属于作物分子遗传领域。

背景技术

光合作用是绿色植物利用光能将二氧化碳和水合成有机物并释放氧气的过程，植物干物质的90％以上都来自光合作用，是作物产量形成的基础。每年地球上通过光合作用合成的有机物约为2200亿吨，是地球上最重要的化学反应(张立新等，2016)。没有植物对光能的利用，就不可能有人类社会的生存和持续发展。随着现代分子生物学技术的发展，一些调控光合作用效率的新基因被迅速发掘出来，例如植物PGR5与PGRL1两个基因编码的蛋白可以瞬间与其它色素蛋白复合体形成超级蛋白复合体，实现能量在超级复合体内部的直接传递，大大提高了光能的有效利用(Munekage et al.2004；DalCorso et al.2008)；中科院李振声院士团队利用抗强光氧化基因选育出了“小偃81”等高光合效率的小麦新品种；Li等(2011)在水稻中克隆到一个编码叶绿体定位蛋白新基因PHD1，该基因不仅可以提高低光强下作物的光合能力，还促进水稻分蘖和千粒重；Yuan等(2018)发现SlARF10在叶绿素中起重要作用，过表达该基因能增加番茄叶片与果实的光合作用，同时增加果实中淀粉、果糖和蔗糖的积累；Zhang等(2019)发现将编码甜菜碱醛脱氢酶、胆碱氧化酶的基因转入番茄中，可显著提高转基因番茄的光合作用与果实大小。可见，充分发掘植物高光合效率的新基因，促进作物的光能高效利用，是增加作物产量的有效手段。

番茄是一种营养丰富的多果穗浆果，其适应性强、产量高、口感好，是世界第二大蔬菜作物，深受消费者喜爱。叶片是番茄进行光合作用的主要器官，增强番茄叶片的光合效率能够促进植株更好生长，且提高果实产量和品质，从而带来更高的经济和社会效益。因此，通过挖掘新的功能基因，利用基因编辑技术，选育高光合效率番茄新品种，是一种比较快捷的方式。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何有效提高番茄叶片的光合作用效率，促进有机物的合成。

为了解决上述技术问题，本发明提供负调节番茄叶片光合作用基因的用途：在番茄中敲除Solyc05g005230基因能增加(有效增加)番茄叶片的光合作用效率；

所述基因Solyc05g005230核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

作为本发明的负调节番茄叶片光合作用基因的用途的改进：

在Solyc05g005230基因中设计CRISPR/Cas9编辑靶点的sgRNA序列：5'-GATGATCGAGAGGTGCTTAG-3’；根据该sgRNA序列人工合成引物并构建至CRISPR/Cas9载体中。

作为本发明的负调节番茄叶片光合作用基因的用途的进一步改进，所述合成的引物为：

上游5'-TGATTGATGATCGAGAGGTGCTTAG-3’，

下游5'-AAACCTAAGCACCTCTCGATCATCA-3’。

作为本发明的负调节番茄叶片光合作用基因的用途的进一步改进：获得基因Solyc05g005230的敲除植株5230-KO。

所述Solyc05g005230基因敲除株系5230-KO叶片中叶绿素a、叶绿素b与类胡萝卜素等光合色素的含量均增加(显著增加)；Solyc05g005230基因敲除株系5230-KO叶片的净光合速率、气孔导度和蒸腾作用等光合作用的主要指标均上升(显著上升)。

该5230-KO植株中Solyc05g005230基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述。

在本发明中，一个负调节番茄叶片光合作用的基因Solyc05g005230，其编码蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还同时提供了番茄中敲除Solyc05g005230基因的方法，包括以下步骤：

1)、利用CRISPR/Cas9技术设计基因编辑的靶点sgRNA序列：5'-GATGATCGAGAGGTGCTTAG-3’；

2)、利用步骤1)所得的序列合成两条引物，经人工退火后，构建到CRISPR/Cas9载体中；

3)、将步骤2)所得的载体遗传转化野生型番茄品种MicroTom，从而获得相应的转基因植株；从所述转基因番茄植株中鉴定出敲除Solyc05g005230基因的植株。

本发明的技术方案具体如下：

采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，根据Solyc05g005230基因编码蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，合成特异性靶向Solyc05g005230基因的sgRNA序列，构建相应的CRISPR/Cas9载体，并遗传转化到野生型番茄品种MicroTom中，使其对基因组中的Solyc05g005230基因进行定向编辑，获得转基因植株，对转基因植株中Solyc05g005230基因进行PCR扩增与测序，获得了Solyc05g005230基因敲除植株5230-KO(图1)。5230-KO植株中的Solyc05g005230基因突变序列为SEQ ID NO:2。Solyc05g005230基因敲除植株比对照品种MicroTom更加深绿(图3)，其叶片中光合色素的含量显著性高于对照品种(图4)，其叶片的光合作用效率也显著性高于对照品种(图5)。同时，为了验证Solyc05g005230基因参与光合作用调节的功能，发明人构建了该基因的过表达载体，获得转基因植株，鉴定得到过表达Solyc05g005230基因株系5230-OE(图2)，与对照品种MicroTom相比，其植株黄化、叶片光中合色素含量下降、叶片的光合作用效率下降(图3-5)。这些结果充分证明Solyc05g005230基因是负调节番茄叶片的光合作用。

本发明具有如下的技术优势：发现一个负调控光合作用的新功能基因，通过基因编辑技术，可获得只敲除Solyc05g005230基因的植株，且显著提高番茄植株的光合作用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为番茄Solyc05g005230基因敲除突变体的CRISPR/Cas9靶点测序分析；

WT：野生型对照品种MicroTom；5230-KO：MicroTom的Solyc05g005230基因敲除株系，下同。

图2为番茄Solyc05g005230基因的表达量分析；

WT：野生型对照品种MicroTom；5230-OE：MicroTom的Solyc05g005230基因过表达株系。

图3为番茄Solyc05g005230基因敲除株系、过表达株系及其野生型对照的植株叶色比较。

图4为番茄Solyc05g005230基因敲除株系、过表达株系及其野生型对照的叶片光合色素含量的比较；

A：叶绿素a含量，B：叶绿素b含量，C：类胡萝卜素含量。

图5为番茄Solyc05g005230基因敲除株系、过表达株系及其野生型对照的叶片光合作用比较。

A为净光合速率，B为胞间CO

图2、图4与图5中的“**”表示与野生型对照MicroTom比较，t检验存在极显著性(P<0.01)差异。

具体实施方式

步骤1、Solyc05g005230基因敲除突变体的构建

根据Solyc05g005230基因的编码序列(SEQ ID NO:1)，在利用CRISPR/Cas9靶点分析软件(http://crispr.mit.edu/)的基础上经过改进，在Solyc05g005230基因中设计CRISPR/Cas9编辑的sgRNA序列：5'-GATGATCGAGAGGTGCTTAG-3’(第一个碱基原来是T，为了提高基因敲除的效率，强制改为G)；并根据该序列合成相应的引物：

上游5'-TGATTGATGATCGAGAGGTGCTTAG-3’，

下游5'-AAACCTAAGCACCTCTCGATCATCA-3’。

采用CRISPR/Cas9试剂盒(Biogle，China)构建相应的CRISPR/Cas9载体，构建方法按照产品说明进行操作。

步骤2、Solyc05g005230基因敲除载体的番茄遗传转化

将步骤1构建的CRISPR/Cas9载体遗传转化到番茄品种MicroTom，使其对基因组中的Solyc05g005230基因进行定向编辑，转基因方法根据采用Kimura等方法(Kimura S etal,CHS Protoc,2008)，获得相应该的转基因番茄植株。

步骤3、转基因番茄叶片的基因组DNA提取

取番茄叶片0.1g，用液氮研磨后，加600μl提取液(15.76g Tris-cl，29.22g Nacl，15.0g SDS粉末加超纯水定容至1L，调节pH＝8.0)，65℃温育60min；加200μl KAC(5mol/L)，混匀后，冰浴10min；再加500μl氯仿，混匀，10000rpm离心5min；取上清，加入500μl异丙醇，混匀，12000rpm离心3min，弃去上清；用75％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心3min，弃去上清；倒置干燥DNA 15min后，加30μl纯水溶解DNA。

步骤4、Solyc05g005230基因敲除靶点的PCR扩增及测序

合成Solyc05g005230基因PCR扩增的引物：上游5’-GAAAGCAGAATCGAACCC-3’，下游5’-CATAATCCAACCATAAACAA-3’，以转基因番茄植株及其对照品种MicroTom的基因组DNA为模板，采用高保真Taq酶

PCR扩增体系为：PrimeSTAR HS(Premix)25μl，上、下游引物(10μM)各1μl，模板DNA2μl(<200ng)，无菌水21μl；PCR扩增程序为：95℃预变性5min；98℃变性10sec，55℃退火15sec，72℃延伸60sec，30个循环；72℃延伸5min。

PCR产物经测序分析后，成功获得了Solyc05g005230基因的1种敲除株系5230-KO，即在Solyc05g005230基因编码区缺失了14个碱基，而导致该基因发生移码突变。5230-KO植株中Solyc05g005230基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述。

步骤5、番茄叶片的总RNA提取及cDNA反转录

采用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN,德国)，按产品说明提取番茄野生型品种MicroTom叶片的总RNA；并用PrimeScript

步骤6、Solyc05g005230基因的PCR克隆

采用

上游引物：5’-

下游引物：5’-

注：下划线的字母为限制性内切酶切识别序列。

步骤7、Solyc05g005230基因过表达载体的构建

用限制性内切酶Kpn I和Pst I(TaKaRa，日本)对pCAMBIA1300-2×35S载体进行双酶切，反应体系为：Kpn I和Pst I各1μl、4μl Buffer(产品自带)、15μl pCAMBIA1300-2×35S载体质粒、ddH

步骤8、Solyc05g005230基因过表达载体的番茄遗传转化

将步骤7所得为：Solyc05g005230基因的表达载体，遗传转化到番茄野生型品种MicroTom，转基因方法根据采用Kimura等方法(Kimura S et al,CHS Protoc,2008)，获得相应该的转基因番茄植株，即，Solyc05g005230基因过表达植株-----5230-OE。

步骤9、Solyc05g005230基因过表达植株的RT-PCR鉴定

按照步骤5所述方法提取步骤8所得的转基因番茄(5230-OE)叶片组织的总RNA，并反转录成cDNA，为TB cDNA。

合成PCR引物：

上游引物：5’-GTGCTTAGTGGTTGGGATGG-3’

下游引物：5’-CCTTCTCCCAAATCTTGGTTC-3’

Real time PCR扩增：使用TB Green

结果如图2所示，与野生型品种MicroTom相比，在过表达株系5230-OE植株中Solyc05g005230基因的表达量显著性上调。

步骤10、番茄叶片的光合色素测定

将以上获得的Solyc05g005230基因敲除株系5230-KO、过表达株系5230-OE及其野生型对照品种MicroTom种植在温室，25℃，16小时光照，8小时黑暗。待生长45天左右，对每个品种随机选取6株，每株取3个片叶子，去主脉，剪成小碎片，称取0.1g浸泡于3mL 80％(v/w)丙酮，28℃黑暗萃取48小时。取萃取溶液用紫外分光光度计(NanoDrop 2000C)分别测定664nm、647nm、470nm三种波长下的数值。然后根据Amon(1949)的方法计算叶绿素a、叶绿素b与类胡萝卜素的含量，计算公式如下：

叶绿素a＝(13.71×OD

叶绿素b＝(22.39×OD

类胡萝卜素＝(1000×OD

其中：V为提取液体积(3mL)，W为叶片质量0.1g，OD

结果如图4所示，与对照品种MicroTom相比，Solyc05g005230基因敲除株系5230-KO叶片的叶绿素a、叶绿素b与类胡萝卜素都显著增加，而过表达株系5230-OE叶片的叶绿素a、叶绿素b与类胡萝卜素都显著下降。

步骤11、番茄叶片的光合作用测定

按照步骤10的方式种植，待生长45天左右，每个品种随机选取6株，用Li-6400(Li-COR,美国)光合测定仪测定其剑叶的净光合速率、胞间CO

结果如图5所示，与对照品种MicroTom相比，Solyc05g005230基因敲除株系5230-KO叶片的净光合速率、气孔导度和蒸腾作用都显著上升，而过表达株系5230-OE叶片的净光合速率、气孔导度和蒸腾作用都显著下降。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江师范大学

<120> 负调节番茄叶片光合作用基因的用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 312

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 1

atgtatcaac aaaaccagga gtactaccat tttccttgtt tgtgttgcaa ccctcatact 60

tacattagaa tggtacaaaa tatgatcgag aggtgcttag tggttgggat ggatagagat 120

gaatgcatta agacactagc tatacatgcc agaatccgcc cactcgtaac actaacagtg 180

tggagagagc ttataaagga gaacaaggac ttctttcaag catatttcac aaacatatca 240

acaccattac cctccttagg ctttcaaaga gaaccaagat ttgggagaag gaaactatat 300

tattggcagt aa 312

<210> 2

<211> 298

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 2

atgtatcaac aaaaccagga gtactaccat tttccttgtt tgtgttgcaa ccctcatact 60

tacattagaa tggtacaaaa tatgagtggt tgggatggat agagatgaat gcattaagac 120

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