一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用

摘要

本发明涉及一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用，包括胰蛋白酶镜像酶(胰蛋白酶N端羧肽酶)酶切甲基化修饰和无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸N端肽键、肽段N末端α氨基的选择性标记、trypsin等酶切无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸C端肽键、氨基活性材料辅助去除无甲基化修饰肽段及LC‑MS/MS分析。本发明的优点是一种不依赖抗体的蛋白质甲基化富集方法，实现赖氨酸单甲基化修饰、赖氨酸二甲基化修饰、赖氨酸三甲基化修饰、精氨酸单甲基化修饰以及精氨酸二甲基化修饰同时富集。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法及应用，实现了蛋白质赖氨酸甲基化修饰和精氨酸甲基化修饰的富集和质谱鉴定。

背景技术

蛋白质甲基化修饰是一种可逆的翻译后修饰，广泛存在于真核和原核生物中，蛋白质甲基化修饰参与了生物体的多种生命过程，与基因的转录调控、RNA剪切、DNA损伤修复、代谢、信号传导等密切相关。蛋白质甲基化修饰的形式具有多样性，可以在多种氨基酸上进行甲基化修饰，如可以发生在赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸以及甲硫氨酸上。蛋白质甲基化修饰不仅发生在多种氨基酸上，在同一种也具有不同的修饰形式，如在赖氨酸上可以发生单甲基化修饰、二甲基化修饰以及三甲基化修饰。尽管甲基化修饰可以发生在多种氨基酸上形成多种形式的甲基化修饰，目前对蛋白质甲基化修饰的研究主要集中在赖氨酸甲基化修饰和精氨酸甲基化修饰，这两种修饰在调控染色体的结构以及基因的表达中发挥着重要作用。蛋白质甲基化修饰的调控异常与多种疾病存在着密切的联系，如蛋白质甲基化修饰调控异常与乳腺癌、肺癌、淋巴癌、艾滋病以及心血管疾病等密切相关，这提示甲基化修饰底物有可能作为疾病的生物标志物存在以及蛋白质甲基化转移酶是很有潜力的药物靶标。因此，解析生物体内的甲基化修饰底物及其相互作用网络对研究疾病发生发展的生理和病理机制具有重要作用，为药物的研发以及防止各种疾病提供有益的信息。

尽管蛋白质甲基化修饰研究已经很久了，与蛋白质磷酸修饰、糖基化修饰以及乙酰化修饰相比，甲基化修饰引起的物理化学性质改变很小，因此蛋白质甲基化修饰的鉴定目前依然存在很大的挑战。为了实现蛋白质甲基化修饰的高通量富集以及鉴定，近些年发展了多种原理的蛋白质甲基化修饰富集手段，结合基于质谱技术的蛋白质组学技术，实现了蛋白质甲基化的底物系统性鉴定。常用的蛋白质甲基化修饰富集原理主要包括抗体亲和富集策略、甲基化识别结构域富集策略以及基于色谱原理的甲基化富集策略。目前，抗体亲和富集策略是甲基化修饰肽段的富集最为成功的研究办法是抗体亲和富集策略，Larsen等(Science signaling 2016,9,rs9)利用抗精氨酸甲基化修饰抗体在人肾上皮293细胞中的3300个蛋白质上鉴定出8030个蛋白质精氨酸单甲基化修饰位点信息。抗体亲和富集在蛋白质精氨酸甲基化修饰研究中取得很大的成功，但是利用抗体亲和富集方法对蛋白质赖氨酸甲基化修饰进行分析还存在很大的挑战。在2013年，Cao等(Epigenetics 2013,8,477-485)开发三种针对赖氨酸甲基化修饰的抗体，结合SCX分级，鉴定出552个蛋白质赖氨酸甲基化修饰位点；于2016年，Cao等(Current protocols in proteinscience 2016,86)进一步优化实验条件，在30mg蛋白质中鉴定出1000多个蛋白质赖氨酸单甲基化修饰位点。生物体内存在多个氨基酸互换以及翻译后修饰与甲基化修饰具有相同元素组成，Cao等没有使用稳定同位素

抗体对底物的识别具有很高的特异性，由于甲基化基团小，引起的底物结构和理化性质改变小，目前开发具有特异性富集蛋白质甲基化修饰的泛抗体非常具有挑战，尤其是抗赖氨酸甲基化修饰抗体，而且一种抗体只富集某单一甲基化修饰类型，无法实现多种蛋白质甲基化修饰的同时富集，不利于蛋白质甲基化修饰状态以及甲基化修饰之间交互作用(cross-talk)的研究。目前开展的基于HILIC和SCX方法也会受到亲水性肽段以及组氨酸的影响，因此同时高效分析多种甲基化修饰存在很大的挑战。

为了实现多种蛋白质甲基化修饰类型同时高效分析，我们建立一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法。利用胰蛋白酶镜像酶(Lysarginase)对蛋白质甲基化修饰和无甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸N端肽键进行酶切，并使用醛对Lysarginase酶切肽段的N端氨基进行选择性封闭，进一步使用胰蛋白酶等对无甲基化修饰的肽段C端肽键进行酶切进而产生一个新的含有N端自由氨基的肽段，利用氨基活性材料与氨基的反应选择性去除无甲基化修饰肽段，从而实现赖氨酸甲基化修饰和精氨酸甲基化修饰肽段的反向富集。

发明内容

为了实现该目的，本发明的技术方案是：

1、采用胰蛋白酶N端羧肽酶(LysargNase)对蛋白质进行酶切

将尿素或者盐酸胍溶解在5-200mM的HEPES中配置成裂解液，使用配置好的裂解液对蛋白质进行提取，使用终浓度为2-20mM的二硫苏糖醇于25-56℃反应15-60min，将蛋白质上的二硫键打开，然后使用终浓度为6-60mM的碘乙酰胺于室温避光反应15-60min，对打蛋白质上的巯基进行烷基化标记，最后使用终浓度为12-120mM的二硫苏糖醇于室温反应15-60min终止过量的碘乙酰胺。

然后使用10kDa的超滤管将过量的试剂去除，具体过程如下；将全细胞裂解液加入至超滤管中，10000-16000g离心10-30min，然后加入100-400μL的2-8M尿素水溶液，10000-16000g离心10-30min，重复该步骤三遍，在使用100-400μL浓度为5-200mM的HEPES洗三遍，最后按照酶用量为蛋白质质量的分别为1/5-1/500，25℃-65℃，酶解2-48h，酶解体系pH为6-9。

将肽段溶液使用TFA进行酸化并进行除盐。使用乙腈活化Oasis HLB除盐柱，然后使用0.05％-1％TFA水溶液对小柱进行平衡，将酸化的酶解产物加入至平衡好的Oasis HLB除盐小柱上，使得酶解产物缓慢通过小柱，然后使用0.05％-1％TFA水溶液清洗小柱，最后使用0.05％-1％TFA/35-80％乙腈将肽段从Oasis HLB小柱上洗脱下来，并使用speed-vac进行干燥。

本发明中胰蛋白酶N端羧肽酶还有其他名称，还可以命名为胰蛋白酶镜像酶。

2、肽段N端α氨基的选择性标记

将干燥的酶解肽段溶于水中，肽段浓度为0.1-1mg/mL，，使用醛基化合物(甲醛、乙醛等)终浓度为5mM-1000mM，反应温度为4℃-37℃，反应时间为10min-48h，pH为1-5。将标记的肽段立刻使用Oasis HLB除盐柱进行除盐，方法如上。

3、采用trypsin等对N端α氨基的选择性标记的肽段进行酶切

将N端α氨基的选择性标记的肽段溶解在5-200mM的HEPES中，加入trypsin等酶用于水解肽段中无甲基化修饰的赖氨酸和精氨酸C端肽键，使得无甲基化修饰肽段因被酶切而产生一个N端自由α氨基，酶用量为蛋白质质量的分别为1/5-1/500，25℃-50℃，酶解2-48h，酶解体系pH为6-9。

此处进行酶切时，通过以下酶进行酶切(1)采用胰蛋白酶进行酶切，(2)或通过将细胞内蛋白酶和梭菌蛋白酶联合使用实现无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸C端肽键的水解，(3)或者通过将细胞内蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶联合使用实现无甲基化修饰赖氨酸和精氨酸C端肽键的水解。

4、甲基化修饰肽段的反向富集

由于无甲基化修饰肽段因为被trypsin等酶酶切产生一个N端自由α氨基，无甲基化修饰肽段进一步使用氨基活材料去除含有N端自由α氨基的无甲基化修饰肽段，实现甲基化修饰肽段的反向富集。氨基活性材料可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖、溴化氰活性琼脂糖、异氰酸树脂、醛基功能化材料等能够与氨基进行共价反应的材料，将氨基活性材料与trypsin等酶切得到的肽段进行抚育，调节pH为3-12，25℃-50℃反应0.16h至24h。根据氨基活性材料的性质，使用离心、亲和色谱、分子筛等去除氨基活性材料，得到甲基化修饰的肽段。

5、LC-MS/MS分析得到的甲基化修饰肽段

利用ESI电离模式电离甲基化修饰的肽段，使用Orbitrap质谱仪等分析，利用目前数据依赖或者从头测序软件，如Mascot、MaxQuant、pFide、SEQUEST，PEAKS等对数据进行分析，解析甲基化修饰位点信息。

本发明中的一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集新方法，其可应用的生物样品包括细胞、组织、体液中的一种或二种以上。

本发明的有益效果为：

1、本发明是一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集方法，不依赖抗体的实验策略，通过甲基化修饰赖氨酸和精氨酸N端肽段的酶切能够对赖氨酸单甲基化修饰、赖氨酸二甲基化修饰、赖氨酸三甲基化修饰、精氨酸单甲基化修饰以及精氨酸二甲基化修饰同时富集。

2、利用超高分别率及超高速度生物质谱对富集得到甲基化修饰肽段，可以实现甲基化修饰的高通量分析。

附图说明

图1、一种基于镜像酶正交原理的蛋白质甲基化修饰反向富集方法的流程图。

图2、将甲基化修饰BSA与正常BSA按照1:1000的比例混合，富集前后的鉴定结果。

图3、Hela细胞蛋白质甲基化修饰鉴定结果。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，将蛋白质进行还原烷基化处理后，使用LysargNase酶对蛋白质进行酶切处理，使用醛对肽段的N端α氨基进行选择性封闭，然后使用胰蛋白酶(trypsin)对封闭的肽段进行酶切，无甲基化修饰肽段经过胰蛋白酶水解会产生一个新的N末端α氨基，然后使用氨基活性材料与非甲基化修饰肽段的N末端α氨基反应，通过进一步分离氨基活性材料实现甲基化修饰肽段的反向富集，利用高效液相反向色谱-超高分别率生物质谱(LC-MS/MS)对富集的甲基化修饰样品进行分析，实现蛋白质甲基化修饰的高通量鉴定。

为了考察基于反向富集策略的蛋白质甲基化修饰分析方法对甲基化修饰的富集能力，我们首先选择简单BSA蛋白质体系对实验方法进行评估。首先将BSA蛋白质进行还原烷基化处理，然后一部分BSA使用

以子宫颈癌Hela细胞为样品，首先使用稳定同位素

实施例2

以子宫颈癌Hela细胞为样品，首先使用稳定同位素

实施例3

以子宫颈癌Hela细胞为样品，首先使用稳定同位素

实施例4

以子宫颈癌Hela细胞为样品，首先使用稳定同位素

实施例5

以子宫颈癌Hela细胞为样品，首先使用稳定同位素

实施例6

以人肝癌组织为样品，使用预冷的PBS清洗组织至无明显血色，加入8M尿素后，使用剪刀将组织剪碎，使用超声进行蛋白质的提取，使用BCA试剂盒对蛋白质进行定量，根据BCA定量结果，取1mg的蛋白质配置成浓度为1mg/mL，加入10μL浓度为1M的二硫苏糖醇，56℃反应30min打开蛋白质中的二硫键，然后加入30μL浓度为1M的碘乙酰胺，室温避光反应30min，将蛋白质上的巯基进行烷基化，最后使用终浓度为30mM二硫苏糖醇终止过量的碘乙酰胺。使用10kDa的超滤管去除蛋白质溶液中的尿素及小分子标记试剂，首先将蛋白质裂解液转移至超滤管中，16000g离心30min，然后加入400μL 8M的尿素水溶液，16000g离心30min，重复尿素清洗三次，然后使用400μL 20mM的HEPES继续洗三遍。将蛋白质重悬于20mM的HEPES中，按照LysargNase与蛋白质的质量比为1:20对蛋白质进行酶切，37℃过夜。使用除盐柱对LysargNase酶切肽段进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在1mL 1.5％的乙酸水溶液中，加入20μL 1M的氰基硼氢化钠，25℃标记1h，然后对标记的肽段立刻进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在20mMHEPES中，按照胰蛋白酶与肽段的质量比为1:30对肽段进行酶切，37℃过夜。然后将胰蛋白酶酶切得到的肽段加入至16mg的超支化多聚醛高分子材料HPG-ALD中，加入氰基硼氢化钠至终浓度为20mM，37℃反应过夜。最后利用10kDa的超滤管将聚合物HPG-ALD分离，过滤得到的溶液既含有甲基化修饰肽段，使用C18对得到的肽段进行除盐和干燥，对干燥得到的肽段进行LC-MS/MS分析以及原始文件的MaxQuant搜索，实现蛋白质甲基化修饰肽段的鉴定。

实施例7

以子宫颈癌Hela细胞为样品，首先使用稳定同位素

实施例8

以血浆为样品，取20μL的血尿，加入1mL 8M尿素后，使用BCA试剂盒对蛋白质进行定量，根据BCA定量结果，取1mg的蛋白质配置成浓度为1mg/mL，加入10μL浓度为1M的二硫苏糖醇，56℃反应30min打开蛋白质中的二硫键，然后加入30μL浓度为1M的碘乙酰胺，室温避光反应30min，将蛋白质上的巯基进行烷基化，最后使用终浓度为30mM二硫苏糖醇终止过量的碘乙酰胺。使用10kDa的超滤管去除蛋白质溶液中的尿素及小分子标记试剂，首先将蛋白质裂解液转移至超滤管中，16000g离心30min，然后加入400μL 8M的尿素水溶液，16000g离心30min，重复尿素清洗三次，然后使用400μL 20mM的HEPES继续洗三遍。将蛋白质重悬于20mM的HEPES中，按照LysargNase与蛋白质的质量比为1:20对蛋白质进行酶切，37℃过夜。使用除盐柱对LysargNase酶切肽段进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在1mL 1.5％的乙酸水溶液中，加入20μL 1M的氰基硼氢化钠，25℃标记1h，然后对标记的肽段立刻进行除盐及干燥。将干燥的肽段溶解在20mM HEPES中，按照胰蛋白酶与肽段的质量比为1:30对肽段进行酶切，37℃过夜。然后将胰蛋白酶酶切得到的肽段加入至16mg的超支化多聚醛高分子材料HPG-ALD中，加入氰基硼氢化钠至终浓度为20mM，37℃反应过夜。最后利用10kDa的超滤管将聚合物HPG-ALD分离，过滤得到的溶液既含有甲基化修饰肽段，使用C18对得到的肽段进行除盐和干燥，对干燥得到的肽段进行LC-MS/MS分析以及原始文件的MaxQuant搜索，实现蛋白质甲基化修饰肽段的鉴定。