一种维生素A、D3、E的液相色谱联检方法

摘要

本申请涉及检测领域，具体公开了一种维生素A、D3、E的液相色谱联检方法。包括以下步骤：（1）分别配制维生素A标准储备液、维生素D3标准储备液、维生素E标准储备液；（2）分别从维生素A标准储备液、维生素D3标准储备液、维生素E标准储备液中吸取适量至棕色容量瓶内，甲醇定容，制得标准工作液；（3）将待测试样加入至棕色容量瓶内，加入甲醇，升温、超声提取，然后冷却，定容，制得待测试样溶液；（4）分别对标准工作液和待测试样溶液进行液相色谱变波长检测。本申请的联检方法可同时提取待检测试样中的维生素A、D3、E，通过控制流动相及变波长检测方式，对维生素A、D3、E同时检测含量，提高了检测效率，准确度高。

说明书

技术领域

本申请涉及成分检测领域，更具体地说，它涉及一种维生素A、D3、E的液相色谱联检方法。

背景技术

维生素是人和动物为维持正常的生理功能而从食物中获得的一类微量有机物质，在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。如维生素A可维持正常视觉，可抗干眼病，可维持上皮结构细胞完整性，促进生长发育，并可维持正常免疫功能；如维生素D可促进小肠粘膜对钙的吸收，促进骨组织钙化，促进肾小管对钙磷的重吸收；如维生素E具有较强的抗氧化能力，可延缓衰老，调节血小板的粘附力和聚集作用。因而目前的保健品、动物饲料中往往添加维生素成分，提高营养含量。

但维生素物质性能不稳定，容易被外界光、热、氧气等因素破坏维生素结构，因而导致营养成分损失。对此，市面上有对于维生素进行含量检测的方法，检测保健食物或动物饲料中的维生素含量，但目前对于不同维生素的检测方法相对独立，需要对每种维生素进行单独的提取、检测处理，检测效率低，耗时长。

发明内容

针对现有技术存在不同维生素单独检测效率低的问题，本申请的第一个目的在于提供一种维生素A、D3、E的液相色谱联检方法，该联检方法可同时提取待检测试样中的维生素A、D3、E，通过控制流动相及变波长检测方式，对维生素A、D3、E同时检测含量，提高了检测效率，准确度高。

为实现上述第一个目的，本申请提供了如下技术方案：一种维生素A、D3、E的液相色谱联检方法，包括以下步骤：

（1）配制标准溶液：分别称取维生素A标准品、维生素D3标准品、维生素E标准品，利用甲醇超声溶解、定容，分别配制成维生素A标准储备液、维生素D3标准储备液、维生素E标准储备液；

（2）配制标准工作液：分别从步骤（1）配制得到的维生素A标准储备液、维生素D3标准储备液、维生素E标准储备液中吸取10mL至100mL棕色容量瓶内，甲醇定容，制得标准工作液；

（3）待测试样溶液的配制：将待测试样加入至棕色容量瓶内，加入甲醇，升温、超声提取，然后冷却，定容，制得待测试样溶液；

（4）液相色谱联检：分别将标准工作液和待测试样溶液注入液相色谱柱进行液相色谱变波长检测，测出峰面积，计算出各维生素含量。

通过上述步骤，能对待测试样中的维生素A、D3、E同时提取，并通过控制液相色谱检测的流动相以及变波长检测方式，能同时得到维生素A、D3、E的色谱图，节约色谱检测用料，避免仪器重复工作并造成用料能源的浪费，并提高了检测效率。

其中，通过配制标准工作液，检测出标准工作液中维生素A、D3、E的色谱图，然后利用甲醇及超声提取方式将待检测试样中的维生素A、D3、E同时提取，然后将待测试样注入高效液相色谱柱，用紫外检测器测定，通过色谱分析同时得到维生素A、D3、E的色谱图，与标准工作液的色谱图中的峰面积进行换算、计算，利用外标法计算出各种维生素的含量。

此前的相关技术检测不同维生素含量时，需对不同维生素单独进行提取、单独检测，提取和检测的过程中均需要溶剂的加入，分别处理不同维生素则造成了溶剂的浪费，且每次检测后需流动相冲洗干净后才进行下一检测，再次造成溶液的浪费；同时检测仪器的使用频次较高，影响设备的使用性能，且检测效率低，耗时长，检测人员接触各种试剂时间较长。而本申请的上述处理方法，采用特定的流动相及变波长色谱分析方式，能通过一次色谱分析则能得到维生素A、D3、E的色谱图，然后通过计则能计算得到的含量，分析效率高，准确率高。

进一步地，各种维生素含量分别按下列公式计算：

式中： w是指各维生素的质量分数，单位为毫克每千克(mg/kg)；

m是指试样质量，单位为克(g)；

V是指定容体积，单位为毫升(mL)；

ρ是指各维生素的标准储备液浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

P

P

IU、mg/kg和%之间的单位换算按照换算标准换算。

本申请将待测试样的维生素峰面积值以及标准工作液的峰面积值代入至公式中，通过一次色谱分析同时得到维生素A、D3、E的色谱图，则能通过该色谱图计算出待测试样中的维生素A、D3、E含量，无需对于各种维生素进行单独提取、单独检测，分析效率高。

进一步地，所述步骤（1）中，维生素A标准储备液的配制包括以下步骤：取0.01-0.05g维生素A乙酸酯于100mL棕色容量瓶内，加入甲醇，超声溶解，然后定容，制得维生素A标准储备液。

进一步地，所述步骤（1）中，维生素D3标准储备液的配制包括以下步骤：取0.01-0.05g胆钙化醇于100mL棕色容量瓶内，加入甲醇，超声溶解，然后定容，制得维生素D3标准储备液。

进一步地，所述步骤（1）中，维生素E标准储备液的配制包括以下步骤：取0.01-0.05g DL-α-生育酚乙酸酯于100mL棕色容量瓶内，加入甲醇，超声溶解，然后定容，制得维生素E标准储备液。

本申请通过配制特定浓度的维生素A标准储备液、维生素D3标准储备液、维生素E标准储备液，一方面能提高后续制备的标准工作液浓度准确，另一方面，分别将标准储备液的浓度数值代入至含量计算公式中，根据待测试样的色谱图峰值以及标准工作液的色谱图峰值，则能分别计算出待测试样中维生素A、D3、E的含量，在特定流动相下通过一次变波长色谱检测试样同时得到三种维生素的色谱图，则可分别计算出含量，无需对于各种维生素进行单独提取、单独检测，分析效率高。

进一步地，所述步骤（3）中，配制待测试样溶液的具体操作为：将0.5-1g待测试样加入至100mL棕色容量瓶内，加入60-80mL甲醇，搅拌均匀，升温至55-60℃超声提取30-40min，冷却，定容，制得待测试样溶液。

此前的相关技术对维生素D3的提取中，其提取温度需65℃及以上，但一般的超声仪器中控制的温度最高为60℃，使得对维生素D3难以实现超声提取，使得难以通过一次提取手段达到三种维生素同时提取。而本申请采用甲醇并通过严格控制超声提取的温度和时间，能通过一次提取处理同时提取三种维生素，使得后续色谱检测时，在特定的流动相条件下通过一次变波长检测则能同时检测得到三种维生素的色谱图，进而计算得到各维生素的含量，提高了提取和检测的效率，准确度高。

进一步地，所述步骤（4）中，所述液相色谱柱为C18柱，规格为3.9×150mm，4.6μm粒径。通过采用上述特定规格的色谱柱，能对标准工作液及待测试样中的维生素进行分离，在特定流动相条件下通过一次变波长色谱分析则能分离检测出维生素A、D3、E的色谱图，进而计算出各维生素的含量，检测准确度高。

进一步地，所述步骤（4）中，液相色谱变波长检测的温度为30-40℃，进样量为15-25μL，流速为0.5-1.5mL/min。

通过严格控制上述的检测条件，能使标准工作液及待测试样稳定进样及流通，进而对维生素进行分离、检测，在特定流动相条件下通过一次变波长色谱分析则能分离检测出维生素A、D3、E的色谱图，进而计算出各维生素的含量，检测准确度高。

进一步地，所述步骤（4）中，液相色谱变波长检测的流动相为甲醇和水。

进一步地，所述步骤（4）中，所述流动相中甲醇和水的体积比为95-99:1-5。

通过采用上述特定比例的甲醇和水作为流动相，能使标准工作液及待测试样在色谱柱中稳定进样及流通，进而对维生素进行分离、检测，结合变波长检测方式，能同时检测出维生素A、D3、E的色谱图，通过一次检测则能得到三种维生素的谱图，进而计算出各维生素的含量，检测效率高，准确度高。

进一步地，所述步骤（4）中，液相色谱变波长检测的波长为285-326nm。

进一步地，所述步骤（4）中，液相色谱变波长检测的波长条件为：检测时间为0.01min时，波长为326nm；检测时间为5.70min时，波长为326nm；检测时间为5.71min时，波长为264nm；检测时间为10.0min时，波长为264nm；检测时间为10.01min时，波长为285nm；检测时间为20.0min时，波长为285nm；检测时间为20.01min时停止波长检测。

通过严格控制上述检测时间对应的波长条件，采用变波长的检测方式，能同时检测出维生素A、D3、E的色谱图，结合特定的流动相组成，通过一次检测则能得到三种维生素的谱图，进而结合公式计算出各维生素的含量，检测效率高，准确度高。

综上所述，本申请具有以下有益效果：本申请操作方便，可同时提取待检测试样中的维生素A、D3、E，通过控制流动相及变波长检测方式，同时检测维生素A、D3、E的含量，提高了检测效率，准确度高，减少了对各维生素的单独提纯、单独检测的溶剂浪费及重复操作，减少仪器重复工作，节省能源。

其中，通过分别配制各维生素的标准溶液，再配标准工作液，提高了标准工作液的浓度准确性，进而在检测出待测试样的色谱图峰值后，与标准工作液的色谱图峰值、各维生素标准储备液浓度一并代入至计算公式中则能计算出各维生素的浓度，准确度高。

附图说明

图1是本申请实施例1的标准工作液的色谱图；

图2是本申请实施例1的标准工作液的另一色谱图；

图3是本申请实施例1的待测试样溶液Ⅰ的色谱图；

图4是本申请实施例1的待测试样溶液Ⅰ的另一色谱图；

图5是本申请对比例1的待测试样溶液Ⅱ的色谱图。

具体实施方式

以下结合附图1-附图5和实施例对本申请作进一步详细说明。

实施例1

一种维生素A、D3、E的液相色谱联检方法，包括以下步骤：

（1）配制标准溶液：

维生素A标准储备液的配制包括以下步骤：取0.0688g维生素A乙酸酯于100mL棕色容量瓶内，加入甲醇，超声溶解，然后定容，制得浓度为2000IU/mL的维生素A标准储备液；

维生素D3标准储备液的配制包括以下步骤：取0.025g胆钙化醇标准品于100mL棕色容量瓶内，加入甲醇，超声溶解，然后定容，制得浓度为10000IU/mL的维生素D3标准储备液；

维生素E标准储备液的配制包括以下步骤：取0.5g DL-α-生育酚乙酸酯于100mL棕色容量瓶内，加入甲醇，超声溶解，然后定容，制得浓度为5IU/mL的维生素E标准储备液；

（2）配制标准工作液：分别从步骤（1）配制得到的维生素A标准储备液、维生素D3标准储备液、维生素E标准储备液中吸取10mL至100mL棕色容量瓶内，甲醇定容，制得标准工作液，所述标准工作液中，维生素A的浓度为200IU/mL、维生素D3的浓度为1000IU/mL、维生素E的浓度为0.5IU/mL；

（3）待测试样溶液的配制：称取0.5582g待测试样加入至100mL棕色容量瓶内，加入70mL甲醇，升温至60℃超声提取35min，然后冷却，定容，制得待测试样溶液；所述超声提取的超声频率为60KHz；

（4）液相色谱联检：将标准工作液和待测试样溶液分别注入液相色谱柱进行液相色谱变波长检测，测出峰面积，计算出各维生素含量。

所述步骤（3）中，所述待测试样为成都东方希望动物营养食品有限公司销售的蛋鸡维生素预混合饲料。

所述步骤（4）中，所述液相色谱柱为C18柱，规格为3.9×150mm，4.6μm粒径。优选采用的液相色谱仪为岛津LC-2030高效液相色谱仪。

所述步骤（4）中，液相色谱变波长检测的温度为35℃，进样量为20μL，流速为1.0mL/min。

所述步骤（4）中，液相色谱变波长检测的流动相为甲醇和水；其中，甲醇和水的体积比为98:2。

所述步骤（4）中，液相色谱变波长检测的波长条件为：检测时间为0.01min时，波长为326nm；检测时间为5.70min时，波长为326nm；检测时间为5.71min时，波长为264nm；检测时间为10.0min时，波长为264nm；检测时间为10.01min时，波长为285nm；检测时间为20.0min时，波长为285nm；检测时间为20.01min时停止波长检测。

所述步骤（4）中，各种维生素含量分别按下列公式计算：

式中： w是指各维生素的质量分数，单位为毫克每千克(mg/kg)；

m是指试样质量，单位为克(g)；

V是指定容体积，单位为毫升(mL)；

ρ是指各维生素的标准储备液浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

P

P

IU、mg/kg和%之间的单位换算按照换算标准换算。

本实施例色谱检测出的标准工作液色谱图参见附图1至附图2，附图2为方便观察第2号峰以及第3号峰而调整纵坐标区间距离所得到的另一谱图，色谱峰数值、检测限数值、定量限数值如下表1所示：

表1 实施例1的标准工作液色谱峰数值、检测限数值、定量限数值表

由附图1至附图2以及上表1可知，本实施例在15min的高效液相过程中可准确检测出标准工作液中维生素A、维生素D3、维生素E的浓度，且峰型光滑，检测限及定量限均较低，检测灵敏度较高。

本实施例色谱检测出的待测试样溶液Ⅰ的色谱图参见附图3至附图4，附图4为方便观察第2号峰（接近7.5min时刻）以及第3号峰（12.5-15.0min时刻）而调整纵坐标区间距离所得到的另一谱图，色谱峰数值、检测限数值、定量限数值如下表2所示：

表2 实施例1的待测试样溶液Ⅰ的色谱峰数值、检测限数值、定量限数值表

由附图3至附图4以及上表2可知，本实施例在15min的高效液相过程中可准确检测出待测试样溶液Ⅰ中维生素A、维生素D3、维生素E的浓度，且峰型光滑，在4.213min出现维生素A的对应峰，在7.230min出现维生素D3的对应峰，在13.142min出现维生素E的对应峰，证明本申请的联检方式能对一试样物质中的维生素A、D3、E同时检出，提高了检测效率，减少了对各维生素的单独提纯、单独检测的溶剂浪费及重复操作，减少仪器重复工作，节省能源；且检测限及定量限均较低，检测灵敏度较高，准确度高。而在2.5min之前出现了一峰值，不排除由于标准工作液中没有其他杂质、物质干扰，而试样中存在其他的物质，因而通过联检方法检测出其他物质的峰值。

其中，检测限是指方法能测出该物质时的最低浓度，定量限是至方法能准确定量出该物质时最低的浓度，检测限越低，色谱峰的误差越小，检测灵敏度越高，同理，定量限越低，检测灵敏度越。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于：

流动相为乙腈和甲醇以体积比为8:92混合，其中，所述乙腈的质量分数为10%。

检测的进样量为3μL，流速为0.3mL/min。

液相色谱仪为岛津LC-30AD超高效液相色谱仪。

色谱变波长检测的波长条件为：检测时间为0.01min时，波长为326nm；检测时间为6.00min时，波长为326nm；检测时间为6.01min时，波长为264nm；检测时间为13.50min时，波长为264nm；检测时间为13.511min时，波长为285nm；检测时间为25.0min时，波长为285nm；检测时间为25.01min时停止波长检测。

其中，本对比例的待测试样与实施例1为同一饲料，为成都东方希望动物营养食品有限公司销售的蛋鸡维生素预混合饲料，本对比例的称取量为0.5976g，加入至100mL棕色容量瓶内，加入70mL甲醇，升温至60℃超声提取35min，然后冷却，定容，制得待测试样溶液Ⅱ；所述超声提取的超声频率为60KHz。

本实施例色谱检测出的待测试样溶液Ⅱ的色谱图参见附图5，色谱峰数值、检测限数值、定量限数值如下表3所示：

表3 对比例1的待测试样溶液Ⅱ的色谱峰数值、检测限数值、定量限数值表

由附图5以及上表3可知，对比例1检测同样的物质，需要接近20min才检测出维生素A、D3、E三个峰，且检测出的峰高均较低，出峰的灵敏度较低，检测限和定量限均较高，灵敏度较低。

对比例1中，采用超高效液相色谱，结合超高效液相的检测条件：3μL检测进样量以及0.3mL/min检测流速，且采用乙腈和甲醇作为流动相，其出峰速度及灵敏度均较低，而且峰高也较低，说明本申请采用普通高效液相色谱设备及条件能实现比超高效液相色谱具有更高的灵敏度和准确性，并降低了检测设备成本，缩短检测时长，提高了普通高效液相色谱条件实现多种维生素联检的应用广泛性。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。