一种中期因子Midkine生物分析方法及检测试剂盒

摘要

本发明公开一种中期因子Midkine生物分析方法及检测试剂盒。所述方法包括：将Midkine抗体包被于微孔酶标板形成固相化载体；使用生物基质配制质控品、标准品和待测样品，分别加入酸化液在室温孵育酸化，以使Midkine‑肝素结合的复合物在酸性条件下充分解离；将酸化处理后的质控品、标准品和待测样品以及中和/检测抗体工作液置于酶标板对应的反应孔中上样孵育，以中和质控品、标准品和待测样品中的酸化液并回复到偏碱性环境，同时其中的检测抗体与质控品、标准品和待测样品中的rhMidkine以及固相化载体表面的抗体形成抗体‑抗原‑抗体三明治复合物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物分析、药代动力学研究、毒代动力学研究、药物安全评价和临床研究领域，具体涉及一种适用于生物基质的中期因子Midkine生物分析方法及检测试剂盒。

背景技术

中期因子(Midkine，MK)又称为神经轴突生长促进因子2 (Neurite growthpromoting factor 2)，是1988年发现的分泌性肝素结合生长因子。中期因子与另外一种肝素结合性生长因子pleiotrophin (PTN)构成了Midkine家族。其结构与组成性质为，Midkine是高碱性、非糖基化的多肽，含有5个链内二硫键。具体地，人的Midkine由121个氨基酸组成，分子量为大约13.3KD；鼠的Midkine由118个氨基酸组成。另外，Midkine的C端半部分含有最主要的肝素结合位点以及分子的抗原性和促神经轴突序列。同时，C端和N端对该分子的神经营养效应都是必要的。

近年发现MK在多种实体瘤中过表达，在癌前病变和肿瘤潜伏期也呈高表达，因此MK可作为潜在的肿瘤标记物。还有研究表明老年痴呆患者血清中的中期因子表达水平显著增加，这说明中期因子可能与老年痴呆症的病理进程有一定相关性。另外，MK通过两种不同的行为参与到炎症作用，首先MK直接或通过诱导趋化因子的表达增强中性粒细胞和巨噬细胞的迁移能力；其次，MK可以部分抑制机体必需的耐受性树突细胞的分化。MK也有抗微生物活性而被认为是先天免疫系统的组成部分。以上可知，MK参与到很多生理和病理学过程中，因此MK本身及靶向MK的药物被认为对许多疾病具有治疗价值。

许多公司已经开始对人MK分子感兴趣，并着手开发MK相关的药物产品，如国外公司开发重组的MK蛋白有望用于心肌缺血引起心脏病方面的治疗，国内也有公司开始开发用于制备治疗骨关节炎疾病药物的重组MK产品。基于重组人中期因子（rh MK）作为药物的研发，在临床前和临床阶段离不开药物分子的检测分析，尤其需要进行药代动力学分析。在申报新药临床试验的安全性评价阶段还需要进行毒代动力学分析。而基于药代动力学和毒代动力学的生物分析是检测过程中最关键的技术环节，也是在相关药物研发阶段预先需要解决的技术问题。

目前市售试剂盒多数属于学术科研用试剂盒，在制备标准曲线时标准液通常采用纯Buffer缓冲液配制，仅需标准曲线能够拟合即可。但是食品药品监督管理局关于生物分析指导原则以及中国药典关于生物分析方法验证指导原则中明确指出，标准液应该使用与待测样品相同的基质（例如药物分析中通常使用血清等生物样品基质）配制。因此，上述学术科研用试剂盒无法满足生物基质样品的分析，也不符合食品药品监督管理局的生物分析指导原则要求。不仅如此，上述学术科研用试剂盒没有考虑到Midkine是肝素结合生长因子这一主要特征，且在检测方法上没有排除肝素与其结合而对的检测干扰，仅能用于rh MK样品的内源性检测，无法真正解决重组表达的rh MK作为外源性药物时如何被准确定量的问题，甚至没有解决rh MK作为药物的药代动力学和毒代动力学分析问题，因此并不适合药物开发的工业应用。

李瑾（肝素-ELISA 法检测血清中期因子及其对肝癌诊断的初步应用，第二军医大学学报，2006, 26(7):631-633）设计了肝素作为包被进而捕获血液中MK分子并建立ELISA方法检测MK。该血清中期因子检测体系在buffer体系中进行，仅能用于内源性的游离态MK检测，而且不能识别结合态MK。该方法运用肝素与Midkine可结合的特点，使用肝素作为捕获Midkine的试剂，但并没有排除机体内肝素与Midkine结合形成的结合态Midkine对Midkine检测产生的干扰。结合态Midkine由于预先和肝素结合，因而无法被包被至96孔板的肝素捕获，于是测得的Midkine含量与实际值具有较大差异。该方法在早期科研领域以及满足相对定量的要求情况下可参照使用，但对于需要绝对精准定量的、且要对药代动力学参数、毒代动力学参数精准计算的医药工艺领域里作为外源性药物的Midkine检测却远远不能满足要求。故此，上述方法在实际工业应用中仍需改进。

基于此，开发一种适用于血清或血浆基质的中期因子Midkine生物分析方法及检测试剂盒，能够在血清或血浆基质中排除肝素与Midkine结合及其它检测干扰，实现对Midkine药物浓度的精准定量分析，满足药物报批对于药代动力学和毒代动力学分析的系列要求，已经迫在眉睫。

发明内容

如前所述，Midkine是重要的肝素结合分子。人体血液中肝素含量浓度约为9ug/mL，这大大超出通过外源给药进入到血液循环中的rh MK的浓度。鉴于药代动力学分析的检测限和灵敏度必须达到ng/mL级别，血液中肝素与药物rh MK的结合会严重干扰药物rh MK的浓度检测，甚至会导致药代动力学和毒代动力学分析结果存在较大偏差，从而为药物的研发和应用带来潜在风险。

针对上述缺陷，本发明提供一种适用于生物基质的中期因子Midkine生物分析方法及检测试剂盒，满足MK药物检测的药代动力学/毒代动力学生物分析的相关要求。其中，本发明的检测方法和检测试剂盒通过对血清或血浆基质进行酸化解离，将结合态Midkine与肝素解离，避免MK与内源性肝素结合从而对实际检测结果造成影响或偏差，利于获得更为真实准确的检测结果，实现绝对定量。

第一方面，本发明提供一种适用于生物基质的中期因子Midkine生物分析方法，包括以下步骤：

步骤A：将Midkine抗体包被于微孔酶标板形成固相化载体；

步骤B：使用生物基质配制质控品、标准品和待测样品，分别加入酸化液在室温孵育酸化，以使Midkine-肝素结合的复合物在酸性条件下充分解离；

步骤C：将酸化处理后的质控品、标准品和待测样品以及中和/检测抗体工作液置于酶标板对应的反应孔中上样孵育，所述中和/检测抗体工作液由碱性缓冲溶液和检测抗体工作液组成，以中和质控品、标准品和待测样品中的酸化液并回复到偏碱性环境，并使被分析物Midkine在碱性环境下复性保存，同时其中的检测抗体与质控品、标准品和待测样品中的rhMidkine以及固相化载体表面的抗体形成抗体-抗原-抗体三明治复合物；

步骤D：步骤C反应结束后，弃去反应孔中剩余溶液，加入辣根过氧化物酶与链霉亲和素偶联物，密封并在室温孵育；

步骤E：孵育结束后，弃去反应孔中剩余溶液，加入TMB溶液避光孵育；随后加入终止液，使用酶标仪在450nm读取OD值；

步骤F：以Midkine浓度的log为横坐标，以OD值为纵坐标，对标准曲线各浓度点的仪器响应值及理论浓度的关系进行回归从而确定标准曲线。

较佳地，所述Midkine抗体是单克隆Hunan Midkine Mab。捕获抗体使用单克隆抗体，如此可保证检测方法的特异性。

较佳地，所述检测抗体是生物素标记的多克隆抗体Human Midkine Biotinylatedaffinity Purified Pab。检测抗体使用生物素标记的多克隆抗体，这样有利于提高检测信号，以获得高的检测灵敏度。

本发明基于双抗夹心的方法进行设计，以Hunan Midkine Mab作为捕获抗体和Human Midkine Biotinylated affinity Purified Pab作为检测抗体，以捕获抗体（单抗）保证方法的特异性，以检测抗体（多抗）提高抗原抗体的反应性，且生物素标记进一步增强信号，而且相对容易提升灵敏度。上述方式的双抗夹心设计与常规的“肝素作为捕获试剂，用无标记的多抗作为检测抗体，肝素与多抗形成双夹心相比”，有效排除了生物体内肝素与Midkine结合形成的结合态Midkine对Midkine检测产生的干扰。且本发明的双抗夹心设计相较于“多抗与多抗对midkine的双夹心”，可以用于血清和/或非肝素相关的抗凝剂制备的血浆，拓宽了中期因子Midkine生物分析方法的检测范围。更重要的是，本发明结合“Midkine分子是富含碱性氨基酸的高碱性分子”这一特性，通过酸化促进Midkine与肝素形成的复合物的解离，后续使用碱性溶液中和，一方面中和掉酸化结束后残留酸化液的酸性，另一方面碱性中和液的添加也有利于Midkine分子复性并保持在偏碱性环境中。如此本发明的检测方法和检测试剂盒通过对血清或血浆基质进行酸化解离，将结合态Midkine与肝素解离，避免MK与内源性肝素结合从而对实际检测结果造成影响或偏差，利于获得更为真实准确的检测结果，实现绝对定量。

较佳地，所述酸化液为pH3-3.5的醋酸。作为示例，所述酸化液的浓度为100-500mM，优选为300 mM。

较佳地，所述质控品、标准品或待测样品、与酸液的体积比为1:（1~10）。

较佳地，所述酶标板是96孔酶标板或384孔酶标板。

较佳地，所述碱性缓冲溶液的pH 可为8.5-9.0。进一步优选地，所述碱性缓冲溶液为 Tris-HCl溶液。

较佳地，步骤C上样孵育前在所有反应孔中均铺垫Assay Buffer。

较佳地，所述待测样品为血清和/或非肝素相关的抗凝剂制备的血浆。

较佳地，检测抗体工作液为检测抗体使用Assay buffer按体积比1:2000~1:5000进行稀释的稀释液。

较佳地，步骤D中辣根过氧化物酶标记链霉亲和素用Assay Buffer按体积比1:20000~1:50000进行稀释。

较佳地，使用四参数方程或者五参数方程以及Fixed权重因子对标准曲线各浓度点的仪器响应值及理论浓度的关系进行回归。

较佳地，步骤B、步骤C和步骤D中孵育的时间独立地设定为1 h±5 min。

较佳地，步骤A中将Midkine抗体包被于酶标板形成固相化载体的具体过程为：用PBS溶液稀释Midkine抗体至浓度为1-2 µg/mL，充分混匀后加入到酶标板中于2-8℃孵育至少15h；包被结束后，弃去酶标板中残余液体，洗涤酶标板；向酶标板中加入封闭液在室温孵育2 h±15 min完成封闭。

第二方面，本发明提供一种中期因子Midkine的ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：

A：将Midkine抗体包被于酶标板形成的固相化载体；

B：校准品稀释液：动物或人的血清，或者动物或人的非肝素抗凝血浆；

C：Assay Buffer；

D：酸化液，为pH 3-3.5的醋酸；

E：中和/检测抗体工作液，优选为pH 8.5-9.0的碱性缓冲溶液和检测抗体工作液以体积比1:2组成的混合液；其中检测抗体工作液为Human Midkine Biotinylated affinityPurified Pab使用Assay buffer按体积比1:2000~1:5000进行稀释的稀释液；

F：辣根过氧化物酶与链霉亲和素偶联物或其稀释液；

G：TMB显色剂；

H：终止液，2M的硫酸溶液；

I：标准品储备液，rhMidkine（2 ug/mL）。

有益效果：

1. 区别于使用纯Buffer体系设置的Midkine生物分析方法以及试剂盒，本发明构建一种可以直接用于鼠、猴、人等生物基质的Midkine检测方法，不仅适用于内源性Midkine检测，还可以用于重组Midkine的检测，更重要的是可以直接用于临床和临床前药代动力学或毒代动力学样品的检测，具有工业实用价值。

2. 本发明的生物检测方法和试剂盒通过化学试剂酸化并中和的方式对真实的生物基质样品进行预处理从而解决肝素干扰的科学性问题，不仅经济节约，而且能够排除肝素与Midkine结合的影响进而更加科学准确地测得Midkine的总量，这是本发明首次提出并实现。

3. 本发明的生物检测方法和试剂盒可以兼顾不同种属的动物及人的血清、非肝素抗凝血浆样品检测，在实际检测过程中只需相应更换配制标准曲线和QC的基质即可投入使用，大大节约了时间和经济成本。

4. 本发明的生物分析方法和试剂盒检测的灵敏度可以达到1pg级别以下，无论是内源性Midkine检测还是外源性Midkine检测均可以实现优异的灵敏度。

附图说明

图1是本发明中期因子Midkine生物分析方法的标准曲线，其中Std1 为纯Buffer中配制的标准曲线，Std2为 在10%血清配制的标准曲线，Std3为 100%血清配制的标准曲线。

具体实施方式

以下示例性说明本发明运用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中rhMidkine的方法。

该分析方法的建立是基于双抗夹心法测定基质中药物含量的技术。例如将HumanMidkine Mab包被于96微孔酶标板上，形成固相化抗体，结合在固相载体表面的抗体仍保持其免疫学活性。配制在基质中的标准品、QC样品及血清样本中的rhMidkine经过孵育与固相载体表面的抗体发生反应形成抗原抗体复合物。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与反应液中的其他物质分开，然后加入Human Midkine Biotinylated affinityPurified Pab，继续孵育反应形成双抗夹心复合物。洗涤去掉未结合抗体后，再加入Streptavidin-HRP，通过孵育，检测抗体与固相载体上的复合物反应并形成新的复合物。此时固相载体上，酶的量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶促底物（TMB），底物被酶催化成为有色产物，加入终止液可以终止颜色的发展。产物颜色的深浅与标本中受检物质的量正相关，故可根据显色的深浅进行定量分析，质控样品及受试血清样本中的rhMidkine或内源性midkine浓度值可以根据标准品回归拟合的标准曲线进行计算。

材料和仪器设备

1）酶标仪；

2）96孔酶标板；

3）移液器；

4）纯水仪；

5）天平；

6）pH计；

7）涡旋仪；

8）≤-10℃冰箱；

9）2 -8℃冰箱；

10）≤-60℃冰箱。

生物和化学试剂

生物试剂

1）rhMidkine（R&D或自制，≤-60℃）；

2）Hunan Midkine Mab，（R&D，Cat#2284A，≤-60℃）；

3）Human Midkine Biotinylated affinity Purified Pab，也可以称为“人Midkine生物素亲和纯化抗体Pab”（R&D，Cat# BAF258，≤-60℃）；

4）Streptavidin HRP Conjugate，也可以称为“辣根过氧化物酶与链霉亲和素偶联物”（MERCK，Cat# 18-152或其它来源，2-8℃）；

5）血清；

6）BSA，也可以称为“小牛血清白蛋白”（Sigma，Cat# A7030，2~8℃）；

7）脱脂奶粉（室温）。

化学试剂

1）PBS；

2）Tween-20；

3）TMB；

4）浓硫酸。

溶液的配制

1）PBS（10×）溶液：将一袋PBS粉末溶于1000 mL去离子水中，混匀备用。

2）PBS（1×）溶液：取100 mL的10×PBS溶液加入到900 mL去离子水中，混匀备用。

3）洗涤液（0.05% PBST）：将100 mL PBS（10×）溶液加入到900 mL去离子水中，再加入0.5 mL Tween-20，混匀备用。

4）Assay Buffer：将1.000 g BSA和1.0 mL Tween-20 加入到1000 mL 的PBS溶液中，混匀备用。

5）封闭液（5% non-fat milk in PBS）：将5.0000g脱脂奶粉加入到100 mL PBS，混匀备用。

6）300 mM醋酸溶液（酸化液）：量取冰醋酸17.16 mL，用去离子水定容至1000 mL，混匀备用。

7）1M Tris-HCl缓冲液（pH 8.5，中和液）：称取Tris 60.56 g，溶于400 mL去离子水中，用浓盐酸调pH至8.50±0.1，定容至500 mL，混匀备用。

8）终止液（2 M H

以下为示例说明该实施步骤。

准备固相化载体

（1）包被：用PBS（1×）稀释Hunan Midkine Mab到1-2µg/mL，混匀，加入到96微孔酶标板中，100 µL/孔，置于2 -8℃冰箱，过夜孵育（至少15h）；

（2）封闭：包被结束后，甩掉酶标板中残余液体，使用Wash Buffer洗板三次（300 µL/孔），然后加入封闭液，200 µL/孔，置于数显型酶标板振荡器500±50 rpm，室温孵育2 h±15 min；

（3）洗板：甩掉封闭液，用Wash Buffer洗板三次（300 µL/孔），拍干即用或用封板膜封上，置于2-8℃冰箱，一周内使用。

标准品、质控品的配制

1）标准品的配制：利用稀释液（同一种属来源的混合或单个血清）将rhMidkine配制成200，10，5，2.5，1.25，0.625，0.313，0.156，0.078ng/mL。

2）质控品（即内标样）的配制：利用稀释液（同一种属来源的混合或单个血清）将rhMidkine配制成7.5，0.4，1 ng/mL。

质控及样品的酸化解离

将质控品、标准品和待测样品，按微孔板样品排布表加入96孔V底稀释板中或者eppendorf管中，75µL/孔或管，然后再加入300mM醋酸酸化液（样品与300 mM醋酸溶液按比例1:2进行酸化），置于数显型酶标板振荡器500±50 rpm，室温孵育1 h±5 min，使抗原抗体复合物充分解离。酸液和样品的实际体积可根据需要进行同比例调整。

中和/检测抗体工作液的配制

300 mM 醋酸溶液与中和/检测抗体工作液（1 M Tris-HCl缓冲液）按实际酸碱体积比2:1进行中和。酸化后样品与中和/检测抗体工作液按体积比1:2上板孵育。依此计算，最终中和/检测抗体工作液组成为：1/3 体积1 M Tris-HCl 缓冲液+2/3体积Assay Buffer+1:2000 Human Midkine Biotinylated affinity Purified Pab），待用。

上述酸化解离的目的是使得Midkine-肝素结合复合物充分解离，而中和的作用是在酸化完成后将酸除去。中和后反应液的pH以达到7.2-7.6为宜。应理解，Tris-HCl溶液可以使用其他的碱性缓冲溶液替换。

中和及捕获

将封闭好的96孔酶标板取出，加入上述配制好的中和/检测抗体工作液，75 µL/孔，然后再加入酸化好的质控品、待测样品和标准品，75 µL/孔，用封板膜封好，置于数显型酶标板振荡器500 ± 50 rpm，室温孵育1 h±5 min。

加入酶检测复合物

中和及抗体捕获结束后，甩掉板中溶液，用Wash Buffer洗板三次（300 µL/孔），拍干，加入用Assay Buffer按比例1:20000稀释的Streptavidin-HRP，100 µL/孔，然后用封板膜封好，置于数显型酶标板振荡器500±50 rpm，室温振荡孵育1 h±5 min。该过程的目的是促进更好的反应。

显色

上述孵育结束后，甩掉板中液体，用Wash Buffer洗板三次（300 µL/孔），拍干，然后加入提前平衡至室温的TMB，100 µL/孔，避光孵育30±10min。

终止与读板

加入终止液，100 µL/孔，然后置于酶标仪上，波长450nm，读数。

样品前处理

待测样品均应在无外力影响下室温解冻并且平衡至室温，可无需稀释直接上样，如需要稀释，则稀释的倍数不能超过本方法验证的最大稀释倍数。

酶标仪参数设定

数据分析

每一个分析批的数据将用SoftMax® Pro 软件(Molecular Devices)或其他软件版本进行处理，以4参数方程及Fixed权重因子对标曲各浓度点仪器响应值及理论浓度的关系进行回归从而确定标准曲线。质控样品和/或待测样品的测量值可以由标准曲线计算得出，若QC和/或待测样品被稀释过，可以将测量值乘以相应的稀释倍数得到最终的测量浓度。

数据分析

标准曲线动力学范围：0.156 ng/mL ~ 10.000 ng/mL。

定量范围：0.156 ng/mL ~ 10.000 ng/mL。

试剂盒构成

基于此方案，我们同步构建了Midkine的ELISA检测试剂盒，其组分为：

A: 酶标板，包被有Human Midkine Mab到1-2 µg/mL的96孔ELISA板，可直接上样使用；

B: 校准品稀释液，动物血清或人血清（可以根据具体的实验需要配备）；

C: Assay Buffer，其组分为PBS（pH 7.4），并含有1/1000质量体积比的BSA及1/1000体积比的Tween20；

D：酸化液， pH 3-3.5的醋酸（可为300 mM ）；

E：中和/检测抗体工作液，1M Tris-HCl缓冲液（pH 8.5-9.0），含有直接使用的检测抗体；

F: 直接使用的稀释好的SA-HRP；

G：显色剂，TMB；

H：终止液（2 M的 H

I：标准液储备液，rhMidkine（2 ug/ml）。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。在实施例的部分表格中出现大于100%的数据，这是是原始实验数据的呈现，由软件对标准曲线自动拟合产生。例如实施例1的数据表格是为了展示和说明标准曲线配制在Assay Buffer、10%血清及100%血清中的检测信号。三种环境中标准曲线拟合是有差异的。在10%血清和100%血清中的标准曲线上的浓度点是信号值趋平或差异很小，甚至有低浓度点信号（OD）高于浓度比其高的点，影响标准曲线拟合的精确度，出现偏高或偏低的情况。相应地，标准曲线所测量的质控样品也会有偏高或偏低的现象。在整个说明书中，以系列的实施例递进式说明本发明的方法和试剂盒条件优化的过程，以全面体现本发明的实施价值和实施效果。目前行业对精确度（或称准确度、回收率）的要求是75%~125%。部分实施例的试验数据超出该范围，这进一步说明若不进行后续的改造优化，而是按照该试验条件直接执行，是很难达到最终优异效果的。

实施例1

分别使用Assay Buffer、10%血清（即血清和Assay Buffer的体积比为1：9）、以及血清制备标准曲线，并比较检测信号的差异。详情见下表：

可以看出，标准品配制在Buffer中的信号比在血清高得多，而且随着血清浓度增加信号降低越大。这再次证实目前试剂盒将标准品直接配制在buffer中所得血清样品的测量结果将会偏低。故而本发明的检测方法和试剂盒最终标准曲线和质控及待测样品是保持一致的，而不能如常规的检测方法直接用Buffer配制标曲测量血样。

图1是本发明中期因子Midkine生物分析方法的标准曲线，其中Std1 为纯Buffer中配制的标准曲线，Std2为 在10%血清配制的标准曲线，Std3为 100%血清配制的标准曲线。拟合结果如下所示。拟合方程为五参数方程，具体为y=(A-D)/（1+（x/C）

实施例2：设置没有进行酸化的对照试验以确定酸化对去除肝素的影响。详情见下表：

我们分别用Assay Buffer，10%的血清配制标曲，因为Assay Buffer里的信号很高，在这个实验里用作阳性对照，10%血清配制的标曲分别用醋酸和盐酸进行酸化处理，根据实验结果的数据可以发现，运用300mM醋酸进行酸化处理时能很明显促进Assay的信号，最高信号与Buffer持平，说明这样能消除肝素的干扰，而盐酸的酸化效果不是很理想，故此发明中保护的方法为醋酸作为酸化液。

实施例3：基于上述摸索试验条件，标准曲线各浓度点用血清配制，QC的各浓度点也用血清配制，如此配制标准曲线和QC进行回收率试验。详情见下表：

（NA为此实验中不参与拟合）

以下的两组QC是不同个体血清配制得到。详情见下表：

从该组实验数据可以看出，经过酸化处理后信号正常，1个血清配制的QC回收率都很好在70-125%以内，另一个却波动很大，说明方法也还要处理一下不同基质波动的问题，基质干扰的问题。

实施例4：在上样前，即将酸化后的质控品、标准品和待测样品置于酶标板对应的反应孔中孵育前，所有反应孔铺上75uL的Assay Buffer。所有质控品和标准品配制在纯血清中。详情见下表：

当在加样前，反应孔铺上75微升的Assay Buffer，所有的QC回收率都回到可接受范围，说明这一步有助于改善基质中其它成分干扰。

实施例5：利用基于酸化和预铺Assay buffer的方式，利用不同来源血清配制QC，确认回收率是是否正常。详情见下表：

综上：综合利用改进的措施和Assay的流程后解决了Assay在真实基质中受到肝素干扰的信号减小而不能进行下去以及基质中其它干扰回收率的问题；灵敏度基本上保证在0.781pg/mL甚至可以检测到更低的浓度水平。