一种骨提取物的制备方法及对骨质疏松和骨关节炎的应用

摘要

本公开涉及生物材料提取领域，具体提供一种骨提取物的制备方法及对骨质疏松和骨关节炎的应用。所述骨提取物的制备方法包括如下步骤：将骨粉置于水中煮沸，不停的吸弃上层油脂，降温，将木瓜蛋白酶加入溶液体系，搅拌均匀，再加入中性蛋白酶，保温搅拌，静置后，加热灭酶，减压浓缩，冷冻干燥后即得骨提取物。解决现有技术中关节炎、骨折患者对酶解骨提取物的吸收效果较差的问题，本公开骨提取物的制备方法，不仅降低工艺能耗、缩短时间、提高收率，还获得了低分子量胶原蛋白肽和硫酸软骨素螯合钙组合物，成分比例接近人体中骨的组成，更容易消化吸收，促进骨的增殖，并提高了资源的综合利用，提高其的附加值，具有较高的经济和社会效益。

说明书

技术领域

本公开涉及生物材料提取领域，具体提供一种骨提取物的制备方法及对骨质疏松和骨关节炎的应用。

背景技术

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

骨提取物(骨膏)是牛骨为原料，经蒸煮、酶解和浓缩等工艺而成的产品，其氨基酸含量高，比例均衡。如以牛骨膏为原料制备的蛋白胨，是一种优质的微生物培养基组分，可为微生物生长、发育、繁衍提供良好的氮源。我国很早就以骨汤、骨髓作为关节炎、骨折等辅助治疗食品。

现有技术中骨提取物的制备通常直接将骨破碎，加入其它成分，水煮，干燥，过滤、离心等工序，但上述工序对氨基酸的提取效率过低，为此，现有技术中采用蛋白酶对骨提取物进行酶解提取，但发明人发现，酶解提取虽然效率更高，但存在的骨中提取物成分单一、资源浪费、加工困难等问题，且患者对提取物的吸收效果较差，骨提取物对骨关节炎辅助治疗效果不明显。

发明内容

针对现有技术中关节炎、骨折患者对酶解骨提取物的吸收效果较差的问题，本公开提供一种骨提取物的制备方法及应用，不仅降低工艺能耗、缩短时间、提高收率，还获得了低分子量胶原蛋白肽和硫酸软骨素螯合钙组合物，成分比例接近人体中骨的组成，更容易消化吸收，促进骨的增殖，并提高了资源的综合利用，提高其的附加值，具有较高的经济和社会效益。

本公开一个或一些实施方式中，提供一种骨提取物的制备方法，包括如下步骤：将骨粉置于水中煮沸，不停的吸弃上层油脂，降温，将木瓜蛋白酶加入溶液体系，搅拌均匀，再加入中性蛋白酶，保温搅拌，静置后，加热灭酶，浓缩，干燥后即得骨提取物。

本公开一个或一些实施方式中，提供上述骨提取物的制备方法得到的骨提取物。

本公开一个或一些实施方式中，提供上述骨提取物在制备骨关节炎辅助治疗药物或保健品中的应用。

上述技术方案中的一个或一些技术方案具有如下优点或有益效果：

1)本公开方法所述的骨提取物的制备方法的胶原蛋白肽组合物，含有胶原蛋白肽、硫酸软骨素及钙和各种无机盐等组分，能够通过口服高效的被人体骨骼吸收；且产品成分组成更接近骨成分，利于成骨细胞的增殖、骨中无机物和有机物形成。本公开提取的胶原蛋白肽组合物，提高了资源的综合利用，提高其附加值，具有较高的经济和社会效益。

2)本公开所述的骨提取物的制备方法方法简单，易于操作，成本低，适用于工业化生产。不需要调节pH的大小，减少了操作步骤，节约了时间。

3)本公开直接在煮沸过程中吸弃上层油脂，与现有技术中通常先对骨粉进行脱脂相比，即省略了脱脂的制备工艺，从效果来看，本公开所述的骨提取物更有利于人体吸收。

4)本公开将骨粉作为原料进行提取，与传统采用骨头原料进行提取相比，骨粉在水中分散性更好，方便酶将有效组分酶解提取，从效果来看，采用骨粉提取较骨头原料效果更好。

具体实施方式

下面将对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本公开的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本公开的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本公开保护的范围。

针对现有技术中关节炎、骨折患者对酶解骨提取物的吸收效果较差的问题，本公开提供一种骨提取物的制备方法及应用，不仅降低工艺能耗、缩短时间、提高收率，还获得了低分子量胶原蛋白肽和硫酸软骨素螯合钙组合物，成分比例接近人体中骨的组成，更容易消化吸收，促进骨的增殖，并提高了资源的综合利用，提高其的附加值，具有较高的经济和社会效益。

本公开一个或一些实施方式中，提供一种骨提取物的制备方法，包括如下步骤：将骨粉置于水中煮沸，不停的吸弃上层油脂，降温，将木瓜蛋白酶加入溶液体系，搅拌均匀，再加入中性蛋白酶，保温搅拌，静置后，加热灭酶，浓缩，干燥后即得骨提取物。

优选的，所述骨粉为鱼骨粉或牛骨粉。

优选的，所述骨粉与水的比例为450-550:2-3，单位g:L；

优选的，所述骨粉与水的比例为500:2.5，单位g:L。

优选的，浓缩方式为纳滤或减压浓缩；

或，所述的干燥方式为喷雾干燥、鼓风干燥、真空干燥或冷冻干燥，优选为冷冻干燥；

或，浓缩得15％～95％的猪牛羊骨提取物，喷雾干燥得含有胶原蛋白肽、硫酸软骨素及钙和各种无机盐等成分的骨提取物。

优选的，吸弃上层油脂后，降温至50-60℃，优选为55℃。

优选的，按6500-8000U/g骨粉的标准加入木瓜蛋白酶；

或，按5000-20000U/g骨粉的标准加入中性蛋白酶。

优选的，所述骨粉为鱼骨粉，按8000U/g骨粉的标准加入木瓜蛋白酶，按8000U/g骨粉的标准加入中性蛋白酶；

或，所述骨粉为牛骨粉，按6500U/g骨粉的标准加入木瓜蛋白酶，按9000U/g骨粉的标准加入中性蛋白酶；

优选的，中性蛋白酶的保温搅拌时间为3-5h，优选为4h；

或，中性蛋白酶静置时间为1.5-3h，优选为2h；优选的，加热灭酶温度为85-100℃，优选为90℃；

或，加热灭酶时间为10-20min，优选为15min。

本公开一个或一些实施方式中，提供上述骨提取物的制备方法得到的骨提取物；

优选的，所述的骨提取物包括以下重量百分量的成分：胶原蛋白肽23～30％，硫酸软骨素0.5～4.5％，钙含量20～30％；

进一步优选的，所述的胶原蛋白肽的分子量为小于20000Da，硫酸软骨素的分子量小于20000Da。

本公开一个或一些实施方式中，提供上述骨提取物在制备骨关节炎辅助治疗药物或保健品中的应用。

实施例1

本实施例提供一种骨提取物的制备方法，包括如下步骤：

取500g鱼骨粉，加入2.5L的水，煮沸，不停的吸弃上层油脂，待温度降至55℃，按8000U/g骨粉加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀，按照8000U/g骨粉加入中性蛋白酶，保温搅拌4h，静置2h，加热至90℃，灭酶15min，减压浓缩，经冷冻干燥得到骨提取物，骨提取物中各成分比例见表1。

实施例2

本实施例提供一种骨提取物的制备方法，包括如下步骤：

取500g牛骨粉，加入2.5L的水，煮沸，不停的吸弃上层油脂，待温度降至55℃，按6500U/g骨粉加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀，按照9000U/g骨粉加入中性蛋白酶，保温搅拌4h，静置2h，加热至90℃，灭酶15min，减压浓缩，经冷冻干燥得到骨提取物，骨提取物中各成分比例见表1。

实施例3

本实施例提供一种骨提取物的制备方法，包括如下步骤：

取450g鱼骨粉，加入2L的水，煮沸，不停的吸弃上层油脂，待温度降至55℃，按8000U/g骨粉加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀，按照8000U/g骨粉加入中性蛋白酶，保温搅拌3h，静置1.5h，加热至85℃，灭酶10min，减压浓缩，经冷冻干燥得到骨提取物，骨提取物中各成分比例见表1。

实施例4

本实施例提供一种骨提取物的制备方法，包括如下步骤：

取550g牛骨粉，加入3L的水，煮沸，不停的吸弃上层油脂，待温度降至55℃，按6500U/g骨粉加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀，按照9500U/g骨粉加入中性蛋白酶，保温搅拌5h，静置4h，加热至100℃，灭酶20min，减压浓缩，经冷冻干燥得到骨提取物，骨提取物中各成分比例见表1。

对比例1

本实施例提供一种骨提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)取500g牛骨粉，放入10％的盐酸溶液中浸泡12小时，进行脱钙处理，且每隔3h更换一次盐酸溶液，再次用清水反复清洗干净盐酸溶液，完后滤除水分；

(2)将脱钙处理后的牛骨粉倒入酶解反应罐中，并加入牛骨粉重量0.1倍的去离子水(0.5Kg)，以及加入牛骨粉重量0.1％的胃蛋白酶，搅拌均匀，温度升至30℃，酶解2h，同时控制酶解反应罐中的pH值为2.5；待酶解完毕后，将解反应罐升温至100℃，灭酶；

(3)灭酶完毕后，将酶解反应罐降温至50℃，过滤去除滤渣，得到胶原蛋白肽溶液；

(4)滤液真空浓缩，得到固体牛骨胶原蛋白肽，骨提取物中各成分比例见表1。

对比例2

本实施例提供一种骨提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)取500g鱼骨粉，加入鱼骨粉重量15％的0.5mol/L NaOH溶液和鱼骨粉重量200％的15％NaCl溶液，形成悬浊液；

(2)50℃浸提悬浊液，浸提8h，过滤得滤液，将滤液pH调至7.0，加入浸提滤液1％的中性蛋白酶，45％，酶解3h；待酶解完毕后，将酶解反应罐升温至100℃，灭酶；

(3)将(2)得到的酶解液，加无水乙醇至乙醇体积分数为60％，0℃静置18h，离心，收集沉淀，真空冷冻干燥得硫酸软骨素产品，骨提取物中各成分比例见表1。

对比例3

本实施例提供一种骨提取物的制备方法，包括如下步骤：

取500g牛骨粉，加入2.5L的水，煮沸，不停的吸弃上层油脂，待温度降至55℃，按8000U/g骨粉加入木瓜蛋白酶，保温搅拌4h，静置2h，加热至90℃，灭酶15min，减压浓缩，经冷冻干燥得到骨提取物，骨提取物中各成分比例见表1。

对比例4

本实施例提供一种骨提取物的制备方法，包括如下步骤：

取500g牛骨粉，加入2.5L的水，煮沸，不停的吸弃上层油脂，待温度降至55℃，按照8000U/g骨粉加入中性蛋白酶，保温搅拌4h，静置2h，加热至90℃，灭酶15min，减压浓缩，经冷冻干燥得到骨提取物，骨提取物中各成分比例见表1。

对实施例中得到的骨提取物中的成分分析

骨中提取物钙含量的测定均采用国标方法(GB/T5009.92-2003)。操作参数：混合酸消化液(硝酸：高氯酸混合比例为4：1)，消化样品至无色透明后使用去离子水定容；波长设定为422.7nm，光源为可见光，火焰为空气-乙炔；标准溶液系列浓度范围为0.25μg/mL～2μg/mL，稀释溶液20g/L氧化镧溶液。

骨中提取物胶原蛋白肽测定均采用国标方法(GB 31645-2018)。

骨中提取物硫酸软骨素测定均采用国标方法(GB/T 20365-2006)。

表1骨提取物中各成分比例

骨提取物的功能测试

1.骨提取物对骨密度、骨钙含量、血清生化指标及骨中有机物和无机物含量的影响

通过卵巢切除造成雌激素缺乏大鼠模型，将全部动物适应性喂养后，随机分为假手术组和去卵巢手术组。大鼠以30mg/kg bw的剂量腹腔注射1％戊巴比妥钠溶液,麻醉后进行双侧卵巢切除,术后连续3d肌肉注射2万单位的青霉素。假手术组打开腹腔后仅切除0.5g左右的脂肪,保留双侧卵巢。将去卵巢手术组随机分为8组(n＝10)：卵巢切除+溶剂对照组、卵巢切除+碳酸钙对照组，卵巢切除+对比例1组、卵巢切除+对比例2组、卵巢切除+对比例3组、卵巢切除+对比例4组，卵巢切除+实施例1组、卵巢切除+营养组合物组，样品浓度为0.5g/kg bw，分别给予灌胃，每天灌胃一次，假手术组和卵巢切除+溶剂组给予等体积的生理盐水，卵巢切除+碳酸钙对照组灌胃0.5g/kg bw碳酸钙(相当于200mg/kg bw的钙含量)，卵巢切除+实施例1组灌胃实施例1中骨提取物，卵巢切除+实施例2组灌胃对比例2中骨提取物，卵巢切除+实施例1组灌胃实施例1中骨提取物，卵巢切除+营养组合物组灌胃营养组合物(市售产品包括28％胶原蛋白，27.3％D-氨基葡萄糖盐酸盐，13.11％钙和少量硫酸软骨素)。所有大鼠均摄食低钙饲料，饮用去离子水。实验期间每周称量体重2次，记录体重变化，连续灌胃4周。检测大鼠股骨骨密度、骨钙含量血液、血清中碱性磷酸酶(ALP)与肿瘤坏死因子(TNF-α)生化指标、肱骨中有机物和无机物的含量。

大鼠股骨骨密度(BMD)测定方法：将大鼠股骨样本取出，将保持湿润的股骨样本放于测试台水膜之上，使用双能射线骨密度仪对样品进行扫描，扫描结束后使用配套软件对股骨样本的骨矿物质密度(BMD)进行分析。股骨钙含量的测定按照国标方法(GB/T5009.92-2003)，碱性磷酸酶(ALP)与肿瘤坏死因子(TNF-α)检测参照试剂盒说明书，骨中有机物与无机物(灰分)的比测定方法：取所检测大鼠肱骨风干粉碎称重，灰分(无机物)检测参照国标方法(GB/T5009.4-1985)，有机物含量＝1-无机物含量。

表2样品对大鼠股骨骨密度(BMD)的影响

BMD是指平均每平方厘米的骨矿物质含量，是测定骨质疏松的一种有效筛选手段。表2结果表明，骨中点处骨密度和远心端的骨密度中，与卵巢切除+溶剂组相比，各组中大鼠股骨骨密度虽然还没有达到假手术组的水平，但是均有恢复的趋势，与其他剂量组相比，卵巢切除+实施案例1组的股骨骨密度(P<0.05)恢复最明显。市售的营养物中含有胶原蛋白大分子物质，而本申请的骨提取物中含有的胶原蛋白肽小分子，更容易被吸收利用，从而促进骨形成。

表3样品对大鼠股骨骨钙含量的影响

表3结果表明，与卵巢切除+溶剂组相比，各剂量组都具有提高骨钙含量的趋势，但是卵巢切除+对比例1组(P>0.05)与卵巢切除+对比例2组(P>0.05)，作用的效果并不显著；卵巢切除+碳酸钙组(P<0.05)，卵巢切除+对比例3组，卵巢切除+对比例4组，卵巢切除+营养组合物组(P<0.05)和卵巢切除+实施例1组(P<0.05)能增加股骨中钙的含量，但是与其他剂量组相比，卵巢切除+实施案例1组的股骨骨钙含量(P<0.05)有明显的作用效果。这是由于市售的营养组合物中，钙含量比本申请的骨提取物中少，并且市售的营养组合物中含有胶原蛋白大分子物质，本申请的骨提取物中含有天然钙质，并且含有小分子的胶原蛋白肽，更容易被骨吸收利用促进自身骨钙形成。

表4样品对大鼠血清生化指标的影响

ALP是一种磷酸单酯酶，在骨骼中由成骨细胞所分泌，能够反映成骨细胞的功能和活性，反应骨的吸收。TNF-α主要来源于单核巨噬细胞破骨细胞等，具有刺激破骨细胞形成和促进骨吸收的作用，能够反映骨的吸收。

表4结果表明，与假手术组相比，卵巢切除+溶剂组大鼠ALP(P<0.05)与TNF-α(P<0.05)指标均显著性提升，说明去卵巢后骨形成与骨吸收功能均增强，骨代谢处于高转换的状态，这表明去卵巢手术能够诱导高骨转换型骨质疏松症的形成。对于ALP，各剂量组中活性都有下降的趋势，其中本申请骨提取物(实施例1)具有明显的抑制作用(P<0.05)。对于TNF-α，各剂量组中活性也都有下降的趋势(P<0.05)，根据抑制作用的大小，可以推测本申请骨提取物有助于降低去卵巢所导致的高骨转换状态，相应减缓骨吸收的速度，使大鼠的骨重建水平向正平衡状态恢复，从而降低骨量的丢失。

表5大鼠肱骨中有机物与无机物含量

正常人骨骼中，有机物与无机物的比例约为0.5，表5中可以看出，与卵巢切除+溶剂组相比，各剂量组中，有机物的含量都有增加的趋势(P<0.05)，卵巢切除+实施例1组与其他各剂量组相比，有机物含量有明显的增加(P<0.05)，并且卵巢切除+实施例1组与假手术组相比，有机物含量高于假手术组(P<0.05)，由此可以说明本申请的骨提取物能够提高骨中有机物的含量，改善骨骼柔韧性，有助于降低骨折发生的风险。

2.骨提取物对骨关节炎疼痛的影响

骨性关节炎大鼠模型采用关节内注射碘乙酸钠(MIA)来造模，以MIA诱导骨性关节炎疼痛。大鼠以30mg/kg bw的剂量腹腔注射1％戊巴比妥钠溶液,麻醉后切除膝盖周围的皮肤，从从大鼠左后腿膝关节初带处进入膝关节腔，朝髁间窝推进，到达股骨髁后将注射器回抽2mm，然后向左膝注射50μL碘乙酸钠盐溶液(MIA为30mg)，诱导骨性关节炎模型。将骨性关节炎疼痛大鼠模型随机分为7组(n＝10)：模型组+溶剂对照组、模型组+对比例1组、模型组+对比例2组、模型组+对比例3组、模型组+对比例4组，模型组+实施例1组、模型组+营养组合物组，正常健康大鼠为空白对照组(n＝10)，样品浓度为0.5g/kg bw，分别给予模型组灌胃，空白对照组和模型组+溶剂组给予等体积的生理盐水，模型组+实施例1组灌胃实施例1中骨提取物，模型组+实施例2组灌胃对比例2中骨提取物，模型组+实施例1组灌胃实施例1中骨提取物，模型组+营养组合物组灌胃营养组合物(市售产品包括28％胶原蛋白，27.3％D-氨基葡萄糖盐酸盐，13.11％钙和少量硫酸软骨素)。每天灌胃一次，连续灌胃4周。测试大鼠机械刺激缩足反应阈值(PWT)。

机械刺激缩足反应阈值(PWT)以Von Frey纤维针丝刺激针von Frey hair测痛仪检测大鼠的PWT值，测定采用up-down的方法，将大鼠放置于底部为金属网的有机玻璃箱内待其安静后，选用9种不同强度的Von Frey纤维丝(3.61g、3.84g、4.08g、4.17g、4.31g、4.56g、4.74g、4.93g)，选取初始刺激强度为4.31g，分别对大鼠两侧足心部进行机械性刺激，测试时纤维丝垂直或微弯，在大鼠足心部停留6s，当大鼠出现快速缩足或搔抓反应为阳性反应。若缩足反应为阳性，则选择依次相邻递减的刺激强度给予剌激；若缩足反应为阴性，则选择相邻递增的刺激强度给予刺激。如此反复，记录出现缩足反应的最小刺激强度为机械性缩足阈值(PWT)。连续3次测定持续阳性为最终的缩足反应阈值。左后肢PWT值计算公式如下：左侧PWT％＝左侧PWT/(左侧PWT+右侧PWT)。

表6骨提取物对鼠机械刺激缩足反应阈值(PWT)的影响

表6中Von Frey纤维丝测试结果显示，关节内注射MIA诱导的骨性关节炎模型组大鼠与正常对照组相比较，PWT显著性的降低；模型组与正常对照组相比较，在给模型组灌胃骨提取物后，症状具有显著性的缓解(P<0.05)。与其他剂量组相比，模型组+实施案例1组的PWT值(P<0.05)恢复最明显。该结果表明，本申请发明的骨提取物可以增加MIA诱导的骨性关节炎疼痛中的PWT值，减少MIA诱导的骨性关节炎中的疼痛反应。

以上所揭露的仅为本公开的优选实施例而已，当然不能以此来限定本公开之权利范围，因此依本公开申请专利范围所作的等同变化，仍属本公开所涵盖的范围。