针对MASP-2、冠状病毒N蛋白或其结合的物质在制备冠状病毒所致疾病药物中的应用

摘要

本发明提供针对MASP‑2、冠状病毒N蛋白或其结合的物质在制备冠状病毒所致疾病药物中的应用。本发明通过对N蛋白与MASP‑2相互作用及相关分子机制的研究，证实了SARS‑CoV N蛋白与MASP‑2存在相互作用，且其相互作用区域与MERS‑CoV N蛋白、SARS‑CoV‑2 N蛋白高度同源；发现N蛋白能促进凝集素途径下游补体活化加剧；Masp2基因敲除小鼠感染后死亡率明显下降并更快恢复；通过体内感染实验证实靶向MASP‑2或N蛋白或两者的结合用药，均可有效降低小鼠死亡率。证明针对MASP‑2、N蛋白或MASP‑2和N蛋白结合的抑制物有在作为类SARS‑CoV病毒感染防治候选药物中应用的价值。

说明书

技术领域

本发明涉及针对MASP-2、冠状病毒N蛋白或其结合的物质在制备冠状病毒所致疾病药物中的应用。

背景技术

冠状病毒是属于巢状病毒目的一种基因组长度约3万碱基的正链RNA病毒。其中，引起严重急性呼吸综合征(SARS)的SARS冠状病毒(SARS-CoV)，引起中东呼吸道综合征(MERS-CoV)的MERS冠状病毒，以及2019年爆发流行的2019新型冠状病毒引起的肺炎(COVID-19)其病原体新型冠状病毒(SARS-CoV-2)均可引起严重急性呼吸道传染病。虽然SARS-CoV已消失多年，但由于蝙蝠体内类SARS冠状病毒库的存在，且RNA病毒本身较易突变，存在类似病毒发生宿主改变从而感染人类的可能性。经基因组测序分析SARS-CoV-2与SARS-CoV同源性约80％，可能来源于同一种蝙蝠冠状病毒。加之SARS及类似冠状病毒飞沫传播的特性，且缺少特效药物，一旦爆发流行较难控制，威胁人类健康。提高对该病毒及类似病毒感染的防控能力，研制和储备针对SARS冠状病毒的防治药物具有重要意义。

SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV-2均属于冠状病毒科β冠状病毒属，为单股正链RNA病毒，外覆包膜，因棘突蛋白呈现皇冠状而得名。其基因组大小约29kb，表达4个结构蛋白和数个非结构蛋白。其结构蛋白包括表面棘突(S)蛋白，包膜(E)蛋白，膜(M)蛋白，核衣壳(N)蛋白。其中N蛋白包裹在病毒基因组RNA外侧形成核衣壳，在病毒复制过程中可保护病毒RNA不被宿主攻击并辅助病毒基因组复制，同时发挥促使细胞凋亡、抑制干扰素产生等多种作用。该蛋白由于位于病毒内部，比起包膜蛋白更为保守。

甘露糖结合凝集素结合相关丝氨酸蛋白酶-2(MASP-2)是补体凝集素活化途径的关键酶，由686个氨基酸残基构成(王倩等.甘露糖结合凝集素结合相关丝氨酸蛋白酶2的研究进展.细胞与分子免疫学杂志2015,31(1))。MASP-2由MASP2基因编码，主要功能是结合底物C4将其水解成C4a和C4b两个片段，并在结合C4b的条件下结合C2，将其水解成C2a和C2b，最终形成C4b2a即C3转化酶，启动下游补体系统一系列级联激活过程，激发天然免疫反应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备预防和/或治疗冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染的药物，和/或如何制备冠状病毒抑制剂。

为了解决以上技术问题，本发明提供了抑制MASP-2的活性和/或降低MASP-2的基因的表达量和/或降低MASP-2的含量的物质在制备预防和/或治疗冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染的药物中的应用。

本发明还提供了抑制MASP-2的活性和/或降低MASP-2的基因的表达量和/或降低MASP-2的含量的物质在制备冠状病毒抑制剂中的应用。

上述应用中，所述冠状病毒为其N蛋白与SARS-CoV N蛋白107-125位氨基酸残基氨基酸同源性在75％以上的β冠状病毒属病毒，具体可为SARS-CoV和/或MERS-CoV和/或SARS-CoV-2。

上述应用中，所述冠状病毒所致疾病可为呼吸系统感染和/或消化系统感染。所述呼吸系统感染为呼吸道感染和/或肺部感染，所述呼吸道感染可为鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎，所述肺部感染可为肺炎。所述消化系统感染可为腹泻。冠状病毒感染的患者表现出非典型病毒性肺炎症状，特征为高烧，呼吸困难，淋巴细胞减少，胸片可见肺部阴影进展迅速，病毒会引起细胞因子风暴导致急性肺损伤，重症患者出现急性呼吸窘迫综合征，甚至呼吸衰竭。

上述应用中，所述物质可为试剂。

上述应用中，所述试剂可只为抑制MASP-2的活性和/或降低MASP-2的基因的表达量和/或降低MASP-2的含量的有机分子，如C1INH(补体C1酯酶抑制剂，Complement C1-Esterase Inhibitor)，也可还含有载体或赋形剂。

这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中具体的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。

上述应用中，所述试剂还可只为抑制MASP-2的活性和/或降低MASP-2的基因的表达量和/或降低MASP-2的含量的抗体或其抗原结合片段，如抗MASP-2的抗体，也可还含有上述载体或赋形剂。

上述应用中，所述试剂可只为靶向MASP-2的基因的多核苷酸，也可还含有上述载体或赋形剂。

本发明还提供了抑制MASP-2和冠状病毒的N蛋白结合的物质在预防和/或治疗冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染的药物中的应用。

本发明还提供了抑制MASP-2和冠状病毒的N蛋白结合的物质在制备冠状病毒抑制剂中的应用。

上述应用中，所述冠状病毒为其N蛋白与SARS-CoV N蛋白107-125位氨基酸残基氨基酸同源性在75％以上的β冠状病毒属病毒，具体可为SARS-CoV和/或MERS-CoV和/或SARS-CoV-2。

上述应用中，所述物质为试剂。

上述应用中，所述试剂可只为抑制MASP-2和冠状病毒的N蛋白结合的有机分子，也可还含有上述载体或赋形剂。

上述应用中，所述试剂可只为MASP-2和冠状病毒的N蛋白结合的抗体或其抗原结合片段，也可还含有上述载体或赋形剂。

上述应用中，所述试剂可只为靶向MASP-2和冠状病毒的N蛋白结合的多核苷酸，也可还含有上述载体或赋形剂。

本发明提供了抑制冠状病毒的N蛋白的活性和/或降低冠状病毒的N蛋白的基因的表达量和/或降低冠状病毒的N蛋白的含量的物质在制备预防和/或治疗冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染的药物中的应用。

本发明提供了抑制冠状病毒的N蛋白的活性和/或降低冠状病毒的N蛋白的基因的表达量和/或降低冠状病毒的N蛋白的含量的物质在制备冠状病毒抑制剂中的应用。

上述应用中，所述冠状病毒为其N蛋白与SARS-CoV N蛋白107-125位氨基酸残基氨基酸同源性在75％以上的β冠状病毒属病毒，具体可为SARS-CoV和/或MERS-CoV和/或SARS-CoV-2。

上述应用中，所述物质为试剂。

上述应用中，所述试剂可只为抑制冠状病毒的N蛋白的活性和/或降低冠状病毒的N蛋白的基因的表达量和/或降低冠状病毒的N蛋白的含量的有机分子，也可还含有上述载体或赋形剂。

上述应用中，所述试剂可只为抑制冠状病毒的N蛋白的活性和/或降低冠状病毒的N蛋白的基因的表达量和/或降低冠状病毒的N蛋白的含量的抗体或其抗原结合片段，如抗N蛋白的抗体，也可还含有上述载体或赋形剂。

上述应用中，所述试剂可只为包含靶向冠状病毒的N蛋白的基因的多核苷酸，也可还含有上述载体或赋形剂。

本申请中，所述MASP-2为人的甘露糖结合凝集素结合相关丝氨酸蛋白酶-2，或与人MASP-2具有70％以上同源性的来源于其它动物的MASP-2。

上述同源性是指氨基酸序列的同源性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同源性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同源性进行计算，然后即可获得同源性(identities)的值(％)。所述70％以上的同源性可为至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同源性。

本发明通过对SARS-CoV N蛋白与宿主蛋白MASP-2相互作用及相关分子机制进行研究，发现了N蛋白造成宿主过激免疫反应的分子机制：通过免疫沉淀和免疫印迹实验证实SARS-CoV N蛋白与MASP-2存在相互作用，并发现其相互作用区域与MERS-CoV N蛋白、SARS-CoV-2 N蛋白高度同源，且MERS-CoV N蛋白也有同样的效应；通过补体沉积实验发现SARS-CoV N蛋白及MERS-CoV N蛋白均能促进凝集素途径激活，并导致下游补体活化加剧；Masp2基因敲除小鼠感染病毒后死亡率明显下降并更快恢复；通过体内感染实验证实靶向MASP-2用药，如应用MASP-2抑制物C1INH或抗体，或靶向N蛋白如应用N蛋白单抗，均可有效降低SARS-CoV鼠适应株感染小鼠的死亡率。以上结果提示MASP-2和N蛋白相互作用可作为治疗靶点。利用MASP-2抑制剂或抗体、及N蛋白抗体，可作为SARS-CoV及类SARS-CoV病毒感染的防治候选药物。本发明对感染SARS-CoV及类似病毒的治疗具有应用价值。

附图说明

图1为实施例1中Masp2基因敲除小鼠感染SARS-CoV

图2为实施例2中不同感染及治疗处理后小鼠的存活率与体重恢复情况的折线图。图2中的A为小鼠存活率，其左图为感染当日注射治疗，右图为感染后2天注射治疗；图2中的B为存活小鼠体重占原始体重的比重，其左图为感染当日注射治疗，右图为感染后2天注射治疗；图中n.s.的含义为差异不显著(P≥0.05)，*的含义为差异显著(P<0.05)，**的含义为差异极显著(P<0.01)。

图3为机理实验1中免疫印迹的结果图。图3中的A为SARS-CoV N蛋白与MASP-2免疫共沉淀后的免疫印迹，图3中的B为MERS-CoV N蛋白与MASP-2免疫共沉淀后的免疫印迹。图中每条条带上的表中“+”表示添加有该物质，“-”表示不添加该物质。

图4为SARS-CoV N蛋白、MERS-CoV N蛋白、SARS-CoV-2N蛋白三者与MASP-2相互作用核心区的同源性比较示意图。

图5为SARS-CoV N蛋白补体沉积折线图。图5中的左图为C4b沉积结果，图5中的中图为活化的C3沉积结果，图5中的右图为C5b-9沉积结果，图中SARS N表示添加SARS-CoV N蛋白的处理，Control表示不加SARS-CoV N蛋白的对照，229E N表示人类冠状病毒229EN蛋白处理。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。

1细胞株与质粒、基因

HEK293细胞(人胚胎肾细胞293，ATCC CRL-1573)、VeroE6细胞(非洲绿猴肾细胞，ATCC CRL-1586)公众可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pEGFPC1-NP为北京义翘神州科技有限公司产品，货号VG40143-ACGLN。pCDNA3.0为Invitrogen公司产品。

MASP2基因(HG18035-UT)、SARS-CoV N蛋白的全长基因、SARS-CoV N蛋白(40143-V08B)、MERS-CoV N蛋白的全长基因均可从北京义翘神州科技有限公司购买。

下述实施例中所有的引物合成和测序均由北京奥科鼎盛公司完成。

2分子生物学试剂与抗体

C1INH(货号SRP3318)为默克公司产品；转染试剂Lipofectamine3000Transfection Kit为Invitrogen公司产品,货号L3000-015；补体C4(货号80295-48-3)，补体C4b(货号204897)，及C1q缺失血清(货号234401)均为Sigma公司产品；补体沉积试剂盒(人MBL/MASP-2 assay kit，Hycult，HK327-02)为HBT公司产品；蛋白酶抑制剂Cocktail(EDTA-free，货号04693132001)为罗氏公司产品；DMEM培养基(货号11965-092)、Opti-MEM

HRP标记的anti-Flag抗体(货号A8592)、HRP标记的anti-GFP抗体(货号AB16901)为Sigma公司产品；anti-MASP-2抗体(货号sc-17905，为山羊多抗，可用于人小鼠大鼠MASP-2检测)、anti-NP抗体(货号sc-52906，鼠单抗，可用于人SARS冠状病毒N蛋白检测)、抗C4b抗体(货号sc-25815，兔多抗，可用于人小鼠C4检测)、抗活化的C3抗体(sc-47687)均为SantaCruz公司产品；anti-Flag琼脂糖珠(货号F2426)为Sigma公司产品。

4小鼠

野生型SPF级BALB/c小鼠为标准品系，购自维通利华及斯贝福公司。

下述实施例中的所有数据均采用IBM SPSS 22进行显著性分析。

下述实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1 SARS-CoV病毒感染敲除Masp2基因的小鼠

1材料与方法

以下实验在BSL-3及ABSL-3实验室进行。

1.1病毒

毒种为SARS-CoV鼠适应株，为SARS-CoV(strainv2163)(C.W.Day et al.,Virology395,210(Dec20,2009))，以下简称SARS-CoV

1.2小鼠

敲除Masp2基因的C57小鼠(MASP-2

1.3感染方法

两组均采用滴鼻方式接种含SARS-CoV

2结果

具体结果见图1，其中图1中的A为小鼠存活率，图1中的B为存活小鼠体重占原始体重的比重。从图1可知敲除Masp2基因的小鼠比同窝阴性鼠感染病毒后死亡率明显下降并更快恢复。

实施例2SARS-CoV病毒感染小鼠及治疗

1材料与方法

1.1实验室

以下实验在BSL-3及ABSL-3实验室进行。

1.2病毒

毒种为SARS-CoV鼠适应株，为SARS-CoV(strain v2163)(C.W.Day et al.,Virology 395,210(Dec20,2009))，以下简称SARS-CoV

1.3抑制剂和抗体

C1INH、anti-MASP-2抗体、anti-NP抗体。

1.4小鼠

所用小鼠为维通利华及斯贝福公司的野生型SPF级BALB/c小鼠。实验分两批进行。

1.4.1感染当天治疗药效评价(感染初期治疗)：

选用10-12周龄，体重约20g的雌性小鼠，随机分为4组，每组8-10只：Medium+saline感染当天治疗组(健康对照)，SARS-CoV

1.4.2感染2天治疗药效评价(感染后急性发作期治疗)：

选用10-12周龄，体重约20g的雌性小鼠，随机分为5组，每组8-10只：Medium+saline感染后第2天治疗组(健康对照)，SARS-CoV

1.5感染及治疗

1.5.1治疗时间

9组小鼠共设置5种感染及治疗方式与2种治疗时间。除SARS-CoV

1.5.2感染及治疗方法

Medium+saline感染当天治疗组：小鼠乙醚麻醉后每只滴鼻100μL不接种病毒的VeroE6细胞培养上清(传代培养基为含2％(w/v)胎牛血清的高糖DMEM培养基)，30分钟后，每只小鼠注射100μL生理盐水。

Medium+saline感染后第2天治疗组：小鼠乙醚麻醉后每只滴鼻100μL不接种病毒的VeroE6细胞培养上清(传代培养基为含2％(w/v)胎牛血清的高糖DMEM培养基)，2天后，每只小鼠注射100μL生理盐水。

SARS-CoV

SARS-CoV

SARS-CoV

SARS-CoV

SARS-CoV

SARS-CoV

SARS-CoV

SARS-CoV

注射采用尾静脉注射法，用生理盐水稀释后注射，每只注射100μL，共给药一次。之后每1-2天观察小鼠存活情况并监测体重。

2结果

具体结果见图2，图2中的A为小鼠存活率，其左侧为感染当天治疗，右侧为感染后第2天治疗；图2中的B为存活小鼠体重占原始体重的比重，其左侧为感染当天治疗，右侧为感染后第2天治疗。从图2可知：

①感染当日注射anti-MASP-2抗体或C1INH的小鼠，与染病对照相比，极显著地降低了致死率，且体重恢复良好，其中注射anti-MASP-2抗体的小鼠在感染后第8天体重恢复至与健康对照无显著差异。具体而言，在当天治疗组的实验中，Medium+saline感染当天治疗组的存活率(生存率)是100％，SARS-CoV

②感染后2天(急性发病期)注射anti-MASP-2抗体、anti-NP抗体、C1INH中任一种的小鼠，与染病对照相比，可将小鼠集中死亡时间(1天内小鼠死亡数达到该组死亡总数的50％以上)推迟1-4天，并有效降低感染小鼠的死亡率，其中注射anti-NP抗体或C1INH的小鼠体重恢复良好。具体而言，Medium+saline感染后第2天治疗组的存活率是100％，SARS-CoV

机理实验1免疫沉淀与免疫印迹检测MASP-2与N蛋白的相互作用

1材料与方法

1.1试剂

细胞裂解液：50mmol/L Tris-HCl pH7.4，150mmol/L NaCl，2mmol/L CaCl

不含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液：50mmol/L Tris-HCl pH7.4，150mmol/L NaCl，2mmol/L CaCl

1×转膜缓冲液：Tris-HCl 24mM，甘氨酸5mM，20％(v/v)甲醇。

1.2质粒

pcDNA3.0-MASP-2-Flag为表达蛋白质MASP-2-Flag的表达载体，MASP-2-Flag是人MASP-2和Flag的融合蛋白。

冠状病毒N蛋白及其突变体表达质粒具体为：pcDNA3.0-Flag-SARS N(WT)、pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ321-323)、pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ116-124)、pcDNA3.0-Flag-MERS N(WT)、pcDNA3.0-Flag-MERS N(Δ104-112)共5种。其中，pcDNA3.0-Flag-SARSN(WT)为表达蛋白质Flag-SARS N(WT)的表达载体，Flag-SARS N(WT)是SARS N(WT)和Flag的融合蛋白，其余表达载体以此类推。SARS N(WT)为SARS-CoV N蛋白的全长，Flag是蛋白标签；SARS N(Δ321-323)为缺失SARS-CoV N(WT)蛋白321-323位氨基酸残基的突变体蛋白质，SARS N(Δ116-124)为缺失SARS-CoV N(WT)蛋白116-124位氨基酸残基的突变体蛋白质，MERS N(WT)为MERS-CoV N蛋白的全长，MERS N(Δ104-112)为缺失MERS-CoV N(WT)蛋白104-112位氨基酸残基的突变体蛋白质。

1.2.1质粒pcDNA3.0-MASP-2-Flag

在人MASP-2蛋白的编码基因(即MASP2基因)的3’端终止密码子前连入Flag基因片段(gattacaaggacgacgatgacaag)得到名称为MASP-2-Flag基因的DNA，用该DNA替换pCDNA3.0(Invitrogen)载体的限制性核酸内切酶HindIII和KpnI识别位点间的片段(包括HindIII的识别位点和KpnI识别位点在内的小片段)，保持pCDNA3.0载体的其它序列不变，得到MASP-2-Flag蛋白的重组表达载体，命名为pcDNA3.0-MASP-2-Flag。

1.2.2质粒pcDNA3.0-Flag-SARS N(WT)

在SARS-CoV N蛋白的全长基因5’端起始密码子之后插入Flag基因片段(gattacaaggacgacgatgacaag)得到名称为Flag-SARS N(WT)基因的DNA，用该DNA替换pCDNA3.0(Invitrogen)载体的限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI识别位点间的片段(包括BamHI的识别位点和EcoRI识别位点在内的小片段)，保持pCDNA3.0的其它序列不变，得到Flag-SARSN蛋白(又称SARSN(WT))的重组表达载体，命名为pcDNA3.0-Flag-SARS N(WT)。

1.2.3质粒pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ321-323)

在SARS N(Δ321-323)基因5’端起始密码子之后插入Flag基因片段(gattacaaggacgacgatgacaag)得到名称为Flag-SARS N(Δ321-323)基因的DNA，用该DNA替换pCDNA3.0(Invitrogen)载体的限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI识别位点间的片段(包括BamHI的识别位点和EcoRI识别位点在内的小片段)，保持pCDNA3.0的其它序列不变，得到SARSN蛋白缺失321-323位氨基酸的缺失突变体(又称SARS N(Δ321-323))的重组表达载体，命名为pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ321-323)。

1.2.4质粒pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ116-124)

在SARSN(Δ116-124)基因5’端起始密码子之后插入Flag基因片段(gattacaaggacgacgatgacaag)得到名称为Flag-SARS N(Δ116-124)基因的DNA，用该DNA替换pCDNA3.0(Invitrogen)载体的限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI识别位点间的片段(包括BamHI的识别位点和EcoRI识别位点在内的小片段)，保持pCDNA3.0的其它序列不变，得到SARSN蛋白缺失116-124位氨基酸的缺失突变体(又称SARS N(Δ116-124))的重组表达载体，命名为pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ116-124)。

1.2.5质粒pcDNA3.0-Flag-MERS N(WT)

在MERS-CoV N蛋白的全长基因5’端起始密码子之后插入Flag基因片段(gattacaaggacgacgatgacaag)得到名称为Flag-MERSN(WT)基因的DNA，用该DNA替换pCDNA3.0(Invitrogen)载体的限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI识别位点间的片段(包括BamHI的识别位点和EcoRI识别位点在内的小片段)，保持pCDNA3.0的其它序列不变，得到MERSN蛋白的重组表达载体，命名为pcDNA3.0-Flag-MERS N(WT)。

1.2.6质粒pcDNA3.0-Flag-MERS N(Δ104-112)

在MERSN(Δ104-112)基因5’端起始密码子之后插入Flag基因片段(gattacaaggacgacgatgacaag)得到名称为Flag-MERSN(Δ104-112)基因的DNA，用该DNA替换pCDNA3.0(Invitrogen)载体的限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI识别位点间的片段(包括BamHI的识别位点和EcoRI识别位点在内的小片段)，保持pCDNA3.0的其它序列不变，得到MERSN蛋白缺失104-112位氨基酸的缺失突变体(又称MERS N(Δ104-112))的重组表达载体，命名为pcDNA3.0-Flag-MERS N(Δ104-112)。

1.3转染

1.3.1 HEK293/pcDNA3.0-MASP-2-Flag细胞的制备

HEK293细胞培养至细胞汇合度70-90％时进行转染。使用Thermo公司Lipofectamine

1.3.2 HEK293/pcDNA3.0-Flag-MERS N(WT)细胞的制备

以pcDNA3.0-Flag-MERS N(WT)质粒替代1.3.1中的pcDNA3.0-MASP-2-Flag质粒，按上述同样的步骤转染，得到HEK293/pcDNA3.0-Flag-MERS N(WT)细胞。

1.3.3 HEK293/pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ321-323)细胞的制备

以pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ321-323)质粒替代1.3.1中的pcDNA3.0-MASP-2-Flag质粒，按上述同样的步骤转染，得到HEK293/pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ321-323)细胞。

1.3.4 HEK293/pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ116-124)细胞的制备

以pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ116-124)质粒替代1.3.1中的pcDNA3.0-MASP-2-Flag质粒，按上述同样的步骤转染，得到HEK293/pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ116-124)细胞。

1.3.5 HEK293/pcDNA3.0-Flag-MERS N(WT)细胞的制备

以pcDNA3.0-Flag-MERS N(WT)质粒替代1.3.1中的pcDNA3.0-MASP-2-Flag质粒，按上述同样的步骤转染，得到HEK293/pcDNA3.0-Flag-MERSN(WT)细胞。

1.3.6 HEK293/pcDNA3.0-Flag-MERS N(Δ104-112)细胞的制备

以pcDNA3.0-Flag-MERS N(Δ104-112)质粒替代1.3.1中的pcDNA3.0-MASP-2-Flag质粒，按上述同样的步骤转染，得到HEK293/pcDNA3.0-Flag-MERS N(Δ104-112)细胞。

1.4裂解

将得到的HEK293/pcDNA3.0-MASP-2-Flag细胞加入500μL细胞裂解液冰上裂解10min后，4℃、16000rpm离心10min；将上清转移至新的1.5mL离心管中，得到HEK293/pcDNA3.0-MASP-2-Flag细胞的裂解液。

按上述同样的方法分别裂解5种含有冠状病毒N蛋白细胞(即HEK293/pcDNA3.0-Flag-SARS N(WT)细胞、HEK293/pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ321-323)细胞、HEK293/pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ116-124)细胞、HEK293/pcDNA3.0-Flag-MERS N(WT)细胞、HEK293/pcDNA3.0-Flag-MERS N(Δ104-112)细胞)，得到5种含有冠状病毒N蛋白细胞的裂解液(即HEK293/pcDNA3.0-Flag-SARS N(WT)细胞的裂解液、HEK293/pcDNA3.0-Flag-SARSN(Δ321-323)细胞的裂解液、HEK293/pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ116-124)细胞的裂解液、HEK293/pcDNA3.0-Flag-MERS N(WT)细胞的裂解液、HEK293/pcDNA3.0-Flag-MERS N(Δ104-112)细胞的裂解液。

1.5免疫共沉淀

在HEK293/pcDNA3.0-MASP-2-Flag细胞的裂解液中加入20μL anti-Flag琼脂糖珠，4℃旋转孵育2h进行免疫共沉淀，之后4℃、3000rpm离心5min，使用1mL不含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液洗涤珠子3次，离心去上清后分装保存于-70℃备用，得到结合有MASP-2的琼脂糖珠。

向含有冠状病毒N蛋白细胞的裂解液(上述HEK293/pcDNA3.0-Flag-SARS N(WT)细胞的裂解液、HEK293/pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ321-323)细胞的裂解液、HEK293/pcDNA3.0-Flag-SARS N(Δ116-124)细胞的裂解液、HEK293/pcDNA3.0-Flag-MERS N(WT)细胞的裂解液、HEK293/pcDNA3.0-Flag-MERS N(Δ104-112)细胞的裂解液中的任一种)中加入结合有MASP-2的琼脂糖珠于4℃旋转孵育2h进行免疫共沉淀。之后4℃、3000rpm离心5min，收集沉淀，使用1mL不含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液洗涤珠子3次，离心去上清后加入40-60μL 1×SDS上样缓冲液，100℃煮样5min，4℃、16000×g离心10min，最后取适量上清样品进行SDS-PAGE电泳及免疫印迹。

取10μL上清样品加入到SDS-PAGE胶孔中进行电泳，待溴酚蓝迁移至分离胶底部时，停止电泳，准备进行转膜操作。将PVDF膜用甲醇激活30s，然后将PVDF膜和滤纸一起浸泡在1×转膜缓冲液中30min。电泳结束后从下往上按照滤纸-PVDF膜-SDS胶-滤纸的顺序放置在半干转膜仪上，20V转膜约1.5小时。转膜完成后将PVDF膜用含5％(质量百分含量)脱脂奶粉的1×TBST封闭液室温封闭1h，之后用1×TBST封闭液洗涤3次，每次5min；分别加入HRP标记的anti-Flag抗体、HRP标记的anti-GFP抗体常温孵育PVDF膜1h，洗涤3次后以ECL化学发光显色液进行ECL显影分析。

2结果

结果见图3，SARS-CoV N蛋白(即图3的A图中的SARS N(WT)、SARS N(Δ321-323)、SARS N(Δ116-124))及MERS-CoV N蛋白(即图3的B图中的MERS N和MERS N(Δ104-112))均与MASP-2相互作用。

而SARS-CoV-2 N蛋白与SARS-CoV N蛋白、MERS-CoV N蛋白在与MASP-2相互作用区高度同源，具体见图4，且SARS-CoV-2 N蛋白与MASP-2相互作用。

机理实验2SARS-CoV N蛋白促进补体沉积实验

1材料与方法

1.1试剂

高盐结合缓冲液：10mM Tris-HCl pH 7.4，1M NaCl，0.5mM MgCl

结合缓冲液：10mM Tris-HCl pH 7.4，150mM NaCl，0.5mM MgCl

1.2补体沉积

C4b沉积实验，使用HBT公司的补体沉积试剂盒进行。使用人C1q缺失血清，用高盐结合缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.4，1M NaCl，0.5mM MgCl

C3沉积实验，将人C1q缺失血清用结合缓冲液稀释后加入预包被甘露聚糖的ELISA板中，4℃孵育1小时后，不洗板，于37℃孵育1.5h。洗板三次后加入抗活化的C3抗体(SantaCruz，sc-47687)和对应HRP二抗孵育1h，洗板三次后加入TMB显色液，15-30min后加入2MH

C5b-9沉积实验参照上述C3沉积实验的方法进行，仅将抗C3抗体替换为抗C5b-9抗体。

2结果

具体结果见图5，通过补体沉积实验发现SARS-CoV N蛋白能促进凝集素途径激活，并导致下游补体活化加剧。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。