大气污染物质导致的皮肤损伤防止及抗老化用肽及其用途

摘要

本发明涉及具有污染物质导致的皮肤损伤防止活性，皮肤的抗老化及皱纹改善活性的新肽及与由污染物质诱发的疾病的预防或治疗或者皮肤老化的改善关联的所述肽的用途，具体而言，本发明的新肽具有作为通过抑制如二噁英，微细尘，香烟烟这样的污染物质的皮肤细胞内流入，调节与皮肤老化关联的基因的表达，预防或治疗由污染物质发生的癌，皮肤疾病，肺疾病等或皮肤老化关联疾病的药物组合物的有效成分使用，作为用于污染物质导致的皮肤损伤防止或皮肤老化改善效果的化妆品组合物的的有效成分有用的优点。

说明书

【技术领域】

本发明涉及具有污染物质导致的皮肤损伤防止活性和抗老化效果的新肽及其用途。

【背景技术】

在现代社会中，伴随大城市的形成和产业化的大气污染成为严重的社会问题，关于大气中污染物质对以呼吸器官为首的人的全面健康产生不良影响的各种研究结果被报告出。尤其是近年来韩国的大气中微细尘的浓度比历年显著增加，随着对此持续的言论报道，大众对于大气污染的严重性的关心和忧虑也在增大。

大气中污染物质对人体的内部器官中的呼吸器官产生最大影响，直接暴露于污染物质的表面积最广且发生持续暴露的皮肤成为污染物质的主要攻击器官之一。一般而言，外部环境导致的皮肤健康恶化问题集中于由包含在阳光中的紫外线诱发的问题，但无法忽视与越来越恶化的大气污染问题和空气中污染物质的增加现象进一步关联的研究，需要研究和开发可防止大气污染物质和恢复皮肤的物质或包含其的化妆品等。

芳烃受体(AhR，aryl hydrocarbon receptor)是大气污染物质与皮肤接触时在细胞内传递有害信号而发挥诱导皮肤损伤的作用的核心受体，当人体的皮肤暴露于如2,3,7,8-四氯二苯并-p-二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)这样的二噁英类和多环芳烃(PAHs，polyaromatic hydrocarbons)等时，与所述AhR结合而如同甾类激素的作用机理向细胞核移动而引发毒性机理。与AhR结合的二噁英复合体与存在于核内的Arnt(AhR nuclear translocator)蛋白结合，AhR/Arnt复合体与包含细胞色素P450s(P450或cyps；CYP1A1，CYP1A2，而且，CYP1B1)在内的目标基因的处于转录调节区域的被称为DRE或XRE(药物/异生物反应元件，drug/xenobiotic responsive element)的碱基序列结合而诱导诸基因群的转录，并由此导致毒性。

另一方面，皮肤细胞可因各种原因发生老化现象，可分为因皮肤细胞的老化而可发生皱纹。作为随着生物学过程而经时发生的自然老化的年龄性老化(内生性老化)和在暴露于阳光的部位发生的退行性变化与所述年龄性老化复合而发生的光老化(光因性老化)。当与细胞的生长关联的各种因子的表达或活性受到阻碍时，可发生自然的细胞老化，由包含在阳光中的280nm～400nm波长的光而可发生皮肤细胞的光老化。在其中，尤其是如具有280nm～320nm范围的波长的UVB这样的紫外线照射可造成皮肤或纤维的损伤，可发生皮肤被晒黑的现象。UVB照射可促进皮肤细胞内的ROS及自由基的蓄积，自由基刺激细胞内信号传递体系而可对如DNA，蛋白，脂质这样的活体分子诱发氧化应激，由此可发生皮肤组织的损伤。

当皮肤细胞的氧化应激增加时，发生对表皮的角质细胞或真皮的成纤维细胞的刺激，经连续的细胞内信号传递过程，如作为胶原分解酶的MMP(基质金属蛋白酶，matrixmetalloproteinase)这样的基因的表达可增加，诱发作为皮肤的主要构成成分的占真皮的90％且对皮肤赋予强度，张力而防止外部刺激或力的作用的胶原(collagen)的减小，由此可形成皮肤的老化或皱纹。从而，通过与如所述胶原这样的纤维蛋白的合成或分解关联的基因的表达调节，可期待防止皮肤细胞的老化和皱纹的改善效果。

包含在阳光中的紫外线照射导致的细胞的老化作用或如上所述的大气污染物质的细胞内流入不仅在美容侧面引发皮肤损伤的问题，细胞的DNA损伤可诱发癌或引发中枢及末梢神经系统的损伤，免疫系统破坏，生殖器官障碍，婴幼儿发育障碍，而且，氯痤疮等的皮肤疾病，还可发生严重的健康问题，急需对此的解决方案。

为了解决如上所述的问题，诸种类的物质被开发，也有利用从多样的种类的植物或微生物得到的提取物克服如上所述的问题的尝试。但是，在许多情况中，无法确认从自然物得到的提取物中具体哪种物质可引发皮肤细胞的保护或自老化现象的恢复效果，无法知晓精确的构成，从而不得不利用一同含有未知的物质的提取物组合物。在向人体直接接触或适用而使用的特性上，应使副作用最小化并确保对人体的安全性，有精确弄清具有可解决如上所述的问题的效果的单一物质而适用于人体的皮肤细胞等的必要性。

【发明详述】

【技术课题】

本发明旨在提供通过阻碍如二噁英，微细尘，香烟烟等这样的污染物质的细胞内流入来防止由污染物质发生的皮肤损伤而可作为保护皮肤细胞的用途利用的肽。

另外，本发明旨在提供可作为用于减少自然发生或者由阳光的紫外线发生的皮肤细胞的老化现象，由此改善皮肤皱纹的用途利用的肽。

另外，本发明旨在提供包含如上所述的肽作为有效成分而可预防或治疗由污染物质诱发的疾病，或改善皮肤老化的药物组合物。

另外，本发明旨在提供包含如上所述的肽作为有效成分而可防止污染物质导致的皮肤损伤及改善皮肤老化的化妆品组合物。

【课题解决手段】

为了达成上述的目的，本发明的一个侧面提供包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的污染物质导致的皮肤损伤防止用肽。

本发明的另一侧面提供包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的皮肤抗老化用肽。

本发明的另一侧面提供包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的由污染物质诱发的疾病的预防或治疗用药物组合物。

本发明的另一侧面提供包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的皮肤老化改善用药物组合物。

本发明的另一侧面提供含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽作为有效成分的污染物质导致的皮肤损伤防止或皮肤老化改善用化妆品组合物。

【发明的效果】

本发明中提供的肽具有可作为通过防止大气中存在的如二噁英，微细尘，香烟烟等这样的污染物质的细胞内流入，抑制皮肤细胞的老化现象，预防或治疗可由污染物质诱发的癌，皮肤疾病，肺疾病等或改善皮肤老化的药物组合物的有效成分有用地使用，可作为保护皮肤免于污染物质及改善皮肤老化及皱纹的化妆品组合物的有效成分使用的效果。

但是，本发明的效果不限于如上提及的效果，本领于技术人员可从如下的记载明确理解未提及的其他效果。

【附图简述】

图1a～1c是确认并呈现对于经包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理的HaCaT细胞各自处理TCDD，PM，CSE的情况的AhR核移动量的蛋白印迹结果。以下，Con表示对照，NC表示阴性对照。

图1d是确认并呈现用CSE处理经包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理的A549细胞的情况的AhR核移动量的蛋白印迹结果。

图2a～2c是确认并呈现对于经包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理的HaCaT细胞各自处理TCDD，PM，CSE的情况的CYP1A1及COX-2基因的表达量的RT-PCR结果。

图3a及3b是确认并呈现对于经包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理的HaCaT细胞各自处理TCDD，PM的情况的MMP-1及COX-2的蛋白量的蛋白印迹结果。

图4a及4b是确认包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽各自吸附PM，CSE而沉淀与否的照片。

图5a是确认并呈现经包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理的HaCaT细胞的p-Akt，p-ERK的蛋白量的蛋白印迹结果。

图5b是确认并呈现经包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理的HaCaT细胞的SIRT1基因的表达量的RT-PCR结果。

图6a是确认并呈现经包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理的NIH3T3细胞的p-Akt，p-ERK的蛋白量的蛋白印迹结果。

图6b是确认并呈现经包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理的NIH3T3细胞的胶原(Col1a1)，纤连蛋白(纤连蛋白)，弹性蛋白(弹性蛋白)基因的表达量的RT-PCR结果。

图7是确认并呈现照射UVB且经包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理的HaCaT细胞的SIRT1及AQP3基因的表达量的RT-PCR结果。

图8a是确认并呈现照射UVB且经包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理的NIH3T3细胞的胶原(Col1a1)，纤连蛋白(纤连蛋白)，弹性蛋白(弹性蛋白)基因的表达量的RT-PCR结果。

图8b是确认并呈现照射UVB且经包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理的NIH3T3细胞的MMP-1蛋白的量的蛋白印迹结果和确认并呈现MMP-2蛋白的量的明胶酶谱法结果。

【具体实施方式】

接下来，详细说明本发明。

【1.污染物质导致的皮肤损伤防止或皮肤抗老化用肽】

本发明的一个侧面提供可防止污染物质导致的皮肤损伤的新肽。

本发明的另一侧面提供可抑制皮肤的老化的新肽。

所述肽是指由经肽键连接的2个以上的氨基酸构成的聚合物，由于存在肽自身尺寸太大而无法有效流入目标组织或细胞或半衰期短而短时间内在体内消失的缺点，本发明的所述肽是具有污染物质的细胞流入抑制活性的由20个以下，例如，15个以下，或者，10个以下的氨基酸构成的肽。

本发明的肽可包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，在不对在所述肽的污染物质导致的皮肤损伤抑制活性及皮肤的抗老化活性产生影响的范围内，可为具有氨基酸残基的缺失，插入，取代或这些的组合导致的不同的序列的氨基酸的变异体或片段。本领域公知在不整体上变更所述肽的污染物质导致的皮肤损伤抑制活性及皮肤的抗老化活性的肽水平的氨基酸置换。根据情况，可变形为磷酸化(phosphorylation)，硫化(sulfation)，丙烯基化(acrylation)，糖化(glycosylation)，甲基化(methylation)，法呢基化(farnesylation)等。从而，本发明包括包含与包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽实质相同的氨基酸序列的肽及其变异体或其活性片段。所述实质相同的蛋白是指与所述SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有各自75％以上，例如，80％以上，90％以上，95％以上的序列同一性的氨基酸序列。另外，所述肽可还包含标记序列，标签(tag)，被标记的残基，用于增加半衰期或肽稳定性的以特定目的制造的氨基酸序列。

另外，本发明的所述肽可由本领域广泛公知的多样的方法获得。作为一例，利用多核苷酸重组和蛋白表达系统制造或可由通过如肽合成这样的化学合成在试管内合成的方法及无细胞蛋白合成法等制造。

另外，为了获得更好的化学稳定性，强化的药理特性(半衰期，吸水性，效价，功效等)，变更的特异性(例如，广谱的生物学活性谱)，减小的抗原性，可在肽的N-末端或C-末端结合保护基。例如，所述保护基可为乙酰基，芴基甲氧基羰基，甲酰基，棕榈酰基，肉豆蔻基，硬脂基或聚乙烯二醇(PEG)，只要是可实现肽的改性，尤其是，肽的稳定性增强的成分，可无限制地包含。所述'稳定性'不仅是指保护本发明的肽免于活体内蛋白切断酶的攻击的在体内的稳定性，还包括储藏稳定性(例如，常温储藏稳定性)。

本发明的所述污染物质可为二噁英(dioxin，TCDD)，微细尘(particulatematter，PM)，或者，香烟烟提取物(Cigarette smoke extract，CSE)，但不限于此，只要是具有可从外部流入细胞内而抑制细胞的生长和正常代谢过程的毒性的异生物(xenobiotics)，可无限制地包含。污染物质导致的皮肤损伤防止可为不使污染物质流入细胞内部，由此，污染物质无法在细胞内呈现毒性。

另外，本发明的肽可通过吸附所述污染物质而阻碍污染物质的细胞内流入。所述二噁英这样的污染物质一旦流入细胞内部，则与AhR结合而可诱导诸基因群的表达，由此CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，COX-2，MMPs等的表达可增加，可通过确认如上所述的基因的表达量的变化来确认通过所述污染物质的细胞内流入抑制的本发明的所述肽的细胞保护效果。

本发明的所述皮肤抗老化是指抑制皮肤细胞的老化现象的效果。所述老化可为随时间流逝而在细胞自然发生的老化，也可为因阳光发生的光老化，尤其是可为因紫外线发生的光老化。另外，所述老化可由可因多样的原因发生的细胞内氧化应激现象诱导，由此可发生细胞生长抑制或细胞死亡，在皮肤细胞中，构成其的各种纤维蛋白的合成受到阻碍，分解酶的表达可增加。尤其是，随着紫外线照射而在皮肤细胞中如SIRT1，AQP3，Col1a1，纤连蛋白，弹性蛋白这样的基因的表达被抑制，MMP-1，MMP-2基因的表达被促进而可诱发皮肤细胞的光老化及皱纹发生。

本发明的肽在皮肤细胞内使与细胞增殖关联的途径的基因表达增加，或可诱导纤维蛋白合成基因的表达增加，纤维蛋白分解基因的表达抑制。从而，所述肽可随着使纤维蛋白的合成增加而改善皮肤的皱纹及弹力，并随着改善皮肤屏障而具有皮肤的抗老化活性。随着皮肤的老化进行而确认在皮肤细胞内表达量变化的与细胞增殖关联的蛋白或抗老化基因，纤维蛋白及其分解酶关联基因的表达量，由此可确认本发明的所述肽的抗老化及皮肤皱纹改善效果。

为了确认本发明的所述肽所具有的污染物质导致的皮肤损伤防止效果，在本发明的具体实施例中，向角质形成细胞和成纤维细胞与包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽一同处理二噁英，微细尘，香烟烟提取物，并确认AhR的核移动量，CYP1A1，COX-2及MMP-1的表达量的结果，确认如所述二噁英，微细尘，香烟烟提取物这样的污染物质的细胞内流入受到抑制，随着污染物质的流入的AhR的核移动量和CYP1A1，COX-2及MMP-1的表达量随着本发明的肽处理依赖性地减小(参考图1a至图3b)。

另外，为了确认本发明的所述肽吸附污染物质与否，在本发明的具体实施例中，将微细尘和香烟烟提取物与本发明的包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽混合而肉眼观察的结果，可确认本发明的肽通过吸附如所述微细尘，香烟烟提取物这样的污染物质而沉淀，确认随所述肽的量依赖性地发生吸附(参考图4a及图4b)。

另外，为了确认本发明的所述肽所具有的皮肤细胞的自然老化抑制效果，在本发明的具体实施例中，将角质形成细胞和成纤维细胞用包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理，确认磷酸化的形态的Akt及ERK的量，SIRT1，胶原，纤连蛋白，弹性蛋白的表达量的结果，确认磷酸化的形态的Akt，ERK的量，SIRT1蛋白的量，及如胶原，纤连蛋白，弹性蛋白这样的纤维蛋白的表达量随本发明的肽处理依赖性地增加的(参考图5a至6b)。

此外，为了确认本发明的所述肽所具有的紫外线(UV)照射导致的皮肤细胞的光老化现象的恢复效果，在本发明的具体实施例中，将角质形成细胞和成纤维细胞用包含SEQID NO：1的氨基酸序列的肽处理，确认减小的SIRT1，AQP3，胶原，纤连蛋白，弹性蛋白的表达量再次增加与否，而且，增加的MMP1，MMP2的表达量再次减小与否的结果，确认SIRT1，AQP3，胶原，纤连蛋白，弹性蛋白的表达量随着本发明的肽处理依赖性地增加，因紫外线照射而减小的表达量恢复(参考图7及图8a)，确认MMP-1，MMP-2的表达量随着本发明的肽处理依赖性地减小而因紫外线照射而增加的表达量恢复(参考图8b)。

从而表明，本发明的所述肽通过抑制如TCDD，PM，CSE这样的污染物质的细胞内流入而防止皮肤损伤，调节与皮肤细胞的自然老化现象或因紫外线发生的光老化现象关联的基因的表达，由此具有可通过抗老化活性而改善皮肤的皱纹的活性，从而，本发明的所述肽可作为用于污染物质导致的皮肤损伤防止，抗老化及皮肤皱纹改善的组合物的有效成分有用地使用。

【2.由污染物质诱发的疾病的预防或治疗用，皮肤老化改善用药物组合物】

本发明的再另一侧面提供含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽作为有效成分的由污染物质诱发的疾病的预防或治疗用药物组合物。

本发明的再另一侧面提供含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽作为有效成分的皮肤老化改善用药物组合物。

所述包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽与上述'1.污染物质导致的皮肤损伤防止或皮肤抗老化用肽'项目中说明的肽相同，具体说明援引上述'1.污染物质导致的皮肤损伤防止或皮肤抗老化用肽'项目，以下仅对由污染物质诱发的疾病的预防或治疗用，皮肤老化改善用药物组合物的特有的构成进行说明。

本发明的所述肽具有阻碍污染物质的细胞内流入，抑制皮肤细胞的老化的效果，含有所述肽作为有效成分的药物组合物可预防由污染物质诱发的疾病或作为治疗的用途利用，可作为改善皮肤细胞的老化而使皱纹减小及改善皮肤的弹力的用途利用。

所述由污染物质诱发的疾病是指可由污染物质，例如，二噁英，微细尘，香烟烟这样的大气污染物质诱发的疾病，包含皮肤疾病，肺疾病，神经系统疾病，生殖系统疾病，心血管系统疾病等，包含癌，特应性皮肤炎，接触性皮肤炎，脂溢性皮肤炎，痤疮，皮肤干燥症，银屑病，致死，免疫毒性，末梢神经系统损伤，中枢神经系统损伤，内分泌腺异常，生殖器官障碍，婴幼儿的发育障碍，贫血，支气管炎，肺气肿，肺功能下降，哮喘，慢性支气管炎，心律失常，心脏麻痹，心绞痛，或者，心肌梗塞症。

本发明的所述药物组合物可作为通过阻碍污染物质的细胞流入而预防由所述污染物质诱发的疾病发生，抑制进一步流入所述疾病的患者的细胞的污染物质而缓和症状，阻碍病情的恶化而治疗疾病的用途使用。

所述皮肤老化是指可由皮肤细胞的自然老化或光老化诱发的皮肤状态的负面变化，可为皮肤的皱纹，细纹，皮肤弹性及/或张力减小，发皱，变薄，光润减小等生理学及/或化学老化，也可为暴露于紫外线而真皮变薄的内部皮肤劣化(internal skindegradation)，尤其是，胶原纤维的劣化等老化导致的皮肤的外形变化。

本发明的所述药物组合物可通过抑制可在皮肤细胞中发生的老化现象，与自然或光诱发的所述皮肤老化关联而使皮肤弹力恢复正常水平等修复为医学良好的皮肤状态而作为改善皮肤老化的用途使用。

另一方面，通过将含有本发明的所述肽作为有效成分的药物组合物根据本发明所属的技术领域中的普通技术人员可容易实施的方法，利用药学容许的载体及/或赋形剂来制剂化而制造为单位容量形态，或可放入多容量容器内而制造。此时，剂型可为油或水性介质中的溶液，悬浮液或乳液形态或提取剂，粉末剂，颗粒剂，片剂，胶囊剂或凝胶(例如，氢凝胶)形态，也可还包含分散剂或稳定化剂。

另外，所述药物组合物所包含的所述肽可运载在胶体悬浮液，粉末，盐水，脂质，脂质体，微球体(microspheres)，或者，纳米球形粒子这样的可药学容许的载体上。这些可与运载体形成复合体或缔合，可使用脂质，脂质体，微粒，金，纳米粒子，聚合物，缩合反应剂，多糖类，聚氨基酸，树状聚体，皂苷，吸附增强物质或脂肪酸这样的本领域公知的运载系统在活体内运载。

此外，药学容许的载体可包含制剂时常规利用的乳糖，右旋糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露糖醇，淀粉，金合欢，橡胶，磷酸钙，藻酸盐，明胶，硅酸钙，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，水，糖浆，甲基纤维素，甲基羟基苯甲酸酯，丙基羟基苯甲酸酯，滑石粉，硬脂酸镁及矿物油等，但不限于此。另外，在上述成分之外，可还包含润滑剂，湿润剂，甜味剂，香味剂，乳化剂，悬浮剂，保存剂等。

本发明的药物组合物在临床施用时能经口或非经口施用，可作为一般的药品制剂的形态使用。即，本发明的药物组合物可作为实际临床施用时经口及非经口的诸种剂型施用，在制剂化的情况中，使用一般使用的填充剂，增量剂，结合剂，湿润剂，崩解剂，表面活性剂等的稀释剂或赋形剂来制剂。用于经口施用的固形制剂中包含片剂，丸剂，散剂，颗粒剂，胶囊剂等，这样的固形制剂是向生药提取物或生药发酵物混合至少一种以上的赋形剂，例如，淀粉，碳酸钙，蔗糖或乳糖，明胶等而制剂。另外，在简单的赋形剂之外，还使用硬脂酸镁、滑石这样的润滑剂。作为用于经口施用的液态制剂，有悬浮剂，内容液剂，乳剂，糖浆剂等，除了作为常用的简单稀释剂的水，液体石蜡之外，可包含诸种赋形剂，例如，湿润剂，甜味剂，芳香剂，保存剂等。用于非经口施用的制剂中包含灭菌的水溶液，非水性溶剂，悬浮剂，乳剂，冷冻干燥制剂，栓剂。作为非水性溶剂，悬浮溶剂，可使用丙二醇，聚乙烯二醇，橄榄油这样的植物性油，油酸乙酯这样的可注射酯等。作为栓剂的基材，可使用Witepsol，聚乙二醇，吐温61，可可脂，月桂精黄油，甘油，明胶等。

本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，'药学有效量'是指对于以能适用于医学治疗的合理的收益/危险比率治疗疾病而言充分的量，有效容量水平可根据包含患者的疾病的种类，严重度，药物的活性，对药物的敏感度，施用时间，施用途径及排出比率，治疗期间，同时使用的药物的要素及其他在医学领域熟知的要素决定。根据本发明的药物组合物可作为个别治疗剂施用，或与别的由污染物质诱发的疾病的治疗剂或用于皮肤老化改善的治疗剂联用施用，与以往的治疗剂可同时，另外或者依次施用，可单一或多重施用。考虑全部所述要素而无副作用地可以最小的量获得最大效果的量施用是重要的，这是本领于技术人员可容易确定的。

具体而言，本发明的药物组合物的有效量因患者的年龄，性别，状态，体重，在体内活性成分的吸收度，失活率，排泄速度，疾病种类，联用的药物而异，可根据施用途径，肥胖的严重度，性别，体重，年龄等而增减，作为一例，本发明的肽可每个患者每1kg体重施用约0.0001μg～500mg，例如，0.01μg～100mg。另外，可根据医生或药剂师的判断，以一定时间间隔1天数次，例如，1天2次至3次分次施用。

【3.污染物质导致的皮肤损伤防止或皮肤老化改善用化妆品组合物】

本发明的再另一侧面提供含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽作为有效成分的污染物质导致的皮肤损伤防止或皮肤老化改善用化妆品组合物。

所述包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽与上述'1.污染物质导致的皮肤损伤防止或皮肤抗老化用肽'项目中说明的肽相同，具体说明援引上述'1.污染物质导致的皮肤损伤防止或皮肤抗老化用肽'项目，以下仅对污染物质导致的皮肤损伤防止或皮肤老化改善用化妆品组合物的特有的构成进行说明。

本发明的所述肽具有阻碍污染物质的细胞内流入，抑制皮肤细胞的老化的效果，含有所述肽作为有效成分的化妆品组合物可作为防止可由污染物质发生的皮肤损伤的用途利用，可作为改善皮肤细胞的老化而使皱纹减小，并改善皮肤的弹力的用途利用。

所述肽可以化妆品组合物全体100重量％中0.001～30重量％含有，可以例如，0.1～20重量％，0.1～10重量％，1～10重量％或2～5重量％含有，但不限于此。

在含有本发明的所述肽作为有效成分的化妆品组合物在不对所述肽的污染物质的细胞流入抑制活性及皮肤细胞的老化改善活性产生影响的范围内，可还含有例如，具有对所述肽的活性赋予上升效果的特征的别的成分。可含有例如，脂肪物质，有机溶剂，溶解剂，浓缩剂及凝胶化剂，软化剂，抗氧化剂，悬浮化剂，稳定化剂，发泡剂(foaming agent)，芳香剂，表面活性剂，水，离子型或非离子型乳化剂，填充剂，金属离子封锁剂及螯合物化剂，保存剂，维生素，阻断剂，湿润化剂，必需油，染料，颜料，香料，亲水性或亲脂性活性剂，脂质小囊或常规用于化妆品的任意的别的成分等这样的在化妆品或皮肤科学领域常规使用的佐剂，上述成分可以在化妆品或皮肤科学领域一般使用的量含有。

本发明的所述化妆品组合物可以本领域常规制造的任何剂型制造，例如，可以溶液，悬浮液，乳液，凝胶，洗液，精华液，霜，粉末，皂，洗发水，护发素，面膜，含表面活性剂的清洁剂，清洁泡沫，清洁水，油，液体底料，霜底料或喷雾剂等的化妆品剂型化。

在所述剂型是溶液或乳液的情况中，作为载体成分，可利用溶剂，增溶剂或乳化剂，例如，可利用水，乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苄基醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1,3-丁基二醇油，甘油脂肪族酯，聚乙烯二醇或山梨糖醇酐的脂肪酸酯。在所述剂型是悬浮液的情况中，作为载体成分，可利用水，乙醇或丙二醇这样的液态的稀释剂，乙氧基化异硬脂基醇，聚氧乙烯山梨糖醇酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯这样的悬浮剂，偏氢氧化铝，微晶纤维素，膨润土，琼脂或黄蓍胶等。在所述剂型是霜或凝胶的情况中，作为载体成分，可利用蜡，石蜡，黄蓍胶，动物性油，淀粉，纤维素衍生物，硅，膨润土，聚乙烯二醇，氧化硅，氧化锌或滑石等。在所述剂型是粉末或喷雾剂的情况中，作为载体成分，可包含氧化硅，滑石，羟基铝，乳糖，硅酸钙，氯氟烃，丙烷/丁烷或二甲基醚这样的促进剂。在所述剂型是含表面活性剂的清洁剂的情况中，作为载体成分，可利用脂肪族醇硫酸酯，脂肪族醇醚硫酸酯，磺基琥珀酸单酯，咪唑啉鎓衍生物，羟乙磺酸盐，甲基牛磺酸盐，肌氨酸盐，脂肪酸酰胺醚硫酸酯，脂肪族醇，烷基酰氨基甜菜碱，脂肪酸甘油酯，脂肪酸二乙醇酰胺，植物性油，羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。

接下来，基于实施例进一步详细说明本发明。

但是，下示实施例仅具体例示本发明，本发明的内容不受实施例的限定。

[制造例]肽的制作

利用自动肽合成机(Milligen 9050，Millipore，美国)合成具有如下表1记载的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，利用C18逆相高效液相色谱(HPLC)(Waters Associates，美国)将这些合成的肽纯净分离。柱利用ACQUITY UPLC BEH300C18(2.1mm×100mm，1.7μm，Waters Co，美国)。

【表1】

[实施例1]肽处理导致的AhR的核移动量减小确认

为了确认污染物质的细胞内流入抑制效果，对细胞处理二噁英(dioxin，以下'TCDD')，微细尘(particulate matter，以下'PM')及香烟烟提取物(Cigarette smokeextract，以下'CSE')后，确认AhR(aryl hydrocarbon receptor)的核移动量。所述AhR是，在存在从细胞外部流入的异生物(xenobiotics)的情况中，可与其结合而发挥转录因子的作用，向细胞内核移动，由此通过确认AhR的核移动量，可确认所述污染物质的细胞内流入量。以HaCaT细胞(human keratinocyte)作为对象而各自用TCDD，PM，CSE处理而进行确认，以A549细胞(human alveolar epithelial cell)作为对象而用CSE处理而进行确认。TCDD，PM，CSE是与本发明的肽混合而在无血清培养基上预先反应1小时后使用。

为了确认用TCDD处理的情况的实验结果，首先，将第74代的HaCaT细胞以3×10

用PM和CSE处理的情况的实验过程也通过用与上述的TCDD处理的情况相同的方法进行，PM以50μg/cm

结果，如图1a至1d的蛋白印迹结果所示，在未经包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理而仅处理TCDD，PM或CSE的阴性对照中，核蛋白中大量存在AhR，与此相比，在用所述肽处理的情况中，确认随着肽的浓度增加，AhR的核内存在的量逐渐减少。

通过如上所述的结果可知，由包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，在HaCaT细胞及A549细胞中TCDD，PM，CSE这样的污染物质的流入受到阻碍，由此AhR的核移动量也减小。

[实施例2]肽处理导致的CYP1A1及COX-2的表达量减小确认

为了通过别的方法确认污染物质的细胞内流入抑制效果，用TCDD，PM及CSE处理HaCaT细胞后，确认CYP1A1及COX-2的表达量。当由TCDD这样的污染物质而AhR的活性被促进时，AhR发挥转录因子的作用而增加CYP1A1及COX-2的表达，由此可通过确认CYP1A1，COX-2的基因表达多少与否来可确认所述污染物质的细胞内流入程度和AhR的活性与否。TCDD，PM，CSE是与本发明的肽混合而在无血清培养基上预先反应1小时后使用。

为了确认用TCDD处理的情况的实验结果，首先，将第78代的HaCaT细胞以3×10

用PM和CSE处理的情况的实验过程也通过用与上述的TCDD处理的情况相同的方法进行，PM以25μg/cm

【表2】

结果，如图2a至2c的RT-PCR结果所示，在不用包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理而仅用TCDD，PM或CSE处理的阴性对照中CYP1A1及COX-2的基因大量表达，与此相比，在用上述肽处理的情况中确认，随着肽的浓度增加而CYP1A1和COX-2的表达量逐渐减少。

通过如上所述的结果可知，由包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，在HaCaT细胞中TCDD，PM，CSE这样的污染物质的流入受到阻碍，由此CYP1A1及COX-2的表达量也减小。

[实施例3]肽处理导致的MMP-1及COX-2的蛋白量减小确认

为了通过别的方法确认污染物质的细胞内流入抑制效果，用TCDD及PM处理HaCaT细胞后，确认MMP-1及COX-2蛋白的量。所述MMP-1是胶原分解酶，当由TCDD这样的污染物质而AhR的活性被促进时，AhR发挥转录因子的作用而增加MMP-1及COX-2的表达，由此，可通过确认MMP-1，COX-2的基因表达多少与否，可确认所述污染物质的细胞内流入程度和AhR的活性与否。TCDD，PM与本发明的肽混合而在无血清培养基上预先反应1小时后使用。

为了确认用TCDD处理的情况的实验结果，首先，将第80代的HaCaT细胞以3×10

为了比较实验中使用的β-肌动蛋白的蛋白总量，利用抗-β-肌动蛋白抗体(Santacruz biotechnology，USA)确认。

用PM处理的情况的实验过程也通过用与上述的TCDD处理的情况相同的方法进行，PM以50μg/cm

结果，如图3a及图3b的蛋白印迹结果所示，在不用包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理而仅用TCDD或PM处理的阴性对照中MMP-1及COX-2的蛋白量是大量的，与此相比，在用上述肽处理的情况中确认，随着肽的浓度增加而MMP-1及COX-2的蛋白量逐渐减少。

通过如上所述的结果可知，由包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，在HaCaT细胞中TCDD，PM这样的污染物质的流入受到阻碍，由此MMP-1及COX-2的蛋白量也减小。

[实施例4]肽吸附环境污染物质的效果确认

为了确认本发明的肽吸附污染物质与否，肉眼观察肽和污染物质混合物的沉淀的模式。

首先，为了确认微细尘的吸附程度，将100μg/ml的PM与各自100，200μM的所述肽混合，观察沉淀的模式，将利用40支香烟的烟制剂的CSE与200μM的肽混合而进行肉眼观察。

结果，如图4a及图4b的结果所示，在不用包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽处理而仅用PM或CSE处理的情况中混合物中PM和CSE向混合而原样存在，与此相比，在用上述肽处理的情况中确认，随着肽的浓度增加，沉淀而向下沉降的程度逐渐增加。

通过如上所述的结果可知，包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽有捕获吸附PM或CSE这样的污染物质分子的效果，具有阻碍所述污染物质分子的皮肤内流入的效果。

[实施例5]自然老化抑制-肽处理导致的角质形成细胞的活性促进确认

以角质形成细胞(keratinocyte)作为对象，为了确认本发明的肽能抑制在细胞自然进行的细胞老化现象与否，确认与自然老化关联的蛋白的量及基因的表达量。

＜5-1＞增殖关联信号蛋白的磷酸化与否确认

Akt及ERK是与细胞的增殖关联的信号传递过程相关联的一种蛋白，以磷酸化的形态(各自p-Akt，p-ERK)呈现活性，在用本发明的肽处理的情况中，磷酸化的Akt，ERK增加，由此确认可抑制细胞老化现象与否。

首先，将第81代的HaCaT细胞以3×10

为了比较实验中使用的β-肌动蛋白的蛋白总量，利用抗-β-肌动蛋白抗体(Santacruz biotechnology，USA)进行确认。

结果，如图5a的蛋白印迹结果所示，在用上述肽处理的情况中确认，随着肽的浓度增加而Akt及ERK的磷酸化程度逐渐增加。

通过如上所述的结果可知，由包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，在HaCaT细胞中Akt及ERK的磷酸化程度增加，这表明细胞的生长被促进，从而通过用上述肽处理，可抑制细胞的自然老化现象。

＜5-2＞SIRT1(抗老化基因)的表达增加确认

通过确认发挥防止老化的作用的SIRT1基因的表达量增加与否，在用本发明的肽处理的情况中，确认可抑制细胞老化现象与否。

将第78代的HaCaT细胞以3×10

【表3】

结果，如图5b的RT-PCR结果所示，在用上述肽处理的情况中确认，随着肽的浓度增加，SIRT1基因的表达量逐渐增加。

通过如上所述的结果可知，由包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，在HaCaT细胞中，作为抗老化基因的SIRT1基因的表达量增加，具有细胞的自然老化现象被抑制的效果。

[实施例6]自然老化抑制-肽处理导致的成纤维细胞的活性促进确认

以成纤维细胞(fibroblast)作为对象，为了确认本发明的肽能抑制在细胞自然进行的细胞老化现象与否，确认与自然老化关联的蛋白的量及基因的表达量。

＜6-1＞增殖关联信号蛋白的磷酸化与否确认

Akt及ERK是与细胞的增殖关联的信号传递过程相关联的一种蛋白，以磷酸化的形态(各自p-Akt，p-ERK)呈现活性，在用本发明的肽处理的情况中，磷酸化的Akt，ERK增加，由此确认可抑制细胞老化现象与否。

首先，将第38代的NIH3T3细胞(mouse fibroblast)以3×10

结果，如图6a的蛋白印迹结果所示，在用上述肽处理的情况中确认，随着肽的浓度增加，Akt及ERK的磷酸化程度逐渐增加。

通过如上所述的结果可知，由包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，在NIH3T3细胞中Akt及ERK的磷酸化程度增加，这表明细胞的生长被促进，从而通过用上述肽处理，可抑制细胞的自然老化现象。

＜5-2＞真皮构成成分(胶原，纤连蛋白，弹性蛋白)的表达增加确认

作为构成真皮的成分的1种，通过确认与纤维形成关联的胶原(collagen)，纤连蛋白(纤连蛋白)及弹性蛋白(弹性蛋白)基因的表达量增加与否，在用本发明的肽处理的情况中确认可抑制细胞老化现象与否。COL1A1是编码胶原I的基因。

将第26代的NIH3T3细胞以3×10

【表5】

结果，如图7的RT-PCR结果所示，在用上述肽处理的情况中确认，因UVB照射而被阻碍的SIRT1及AQP3基因的表达量随着肽的浓度增加而逐渐增加。

通过如上所述的结果可知，由包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，在HaCaT细胞中曾被减少的作为抗老化基因的SIRT1及作为皮肤屏障构成基因的AQP3的表达量增加而再次恢复，具有细胞的光老化现象被抑制的效果。

[实施例8]光老化抑制-因紫外线而被抑制的成纤维细胞的活性恢复确认

＜8-1＞真皮构成成分(胶原，纤连蛋白，弹性蛋白)的表达恢复确认

当照射UV时，构成真皮的胶原，纤连蛋白，弹性蛋白基因的表达受到阻碍，由此在用本发明的肽处理的情况中确认，可通过胶原，纤连蛋白，弹性蛋白基因的表达量再次恢复而增加与否来确认可抑制细胞的光老化现象与否。

首先，将第34代的NIH3T3细胞以5×10

结果，如图8a的RT-PCR结果所示，在用上述肽处理的情况中确认，随着肽的浓度增加，胶原(Col1a1)，纤连蛋白，弹性蛋白基因的表达量逐渐增加。

通过如上所述的结果可知，由包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，在NIH3T3细胞中，因UVA照射而被减少的胶原(Col1a1)，纤连蛋白，弹性蛋白基因的表达量增加而再次恢复，具有随着细胞的光老化现象被抑制而从所述基因表达的蛋白导致皮肤的皱纹改善的效果。

＜8-2＞MMP-1及MMP-2的表达阻碍确认

编码与胶原分解关联的蛋白的MMP-1及MMP-2因紫外线照射而表达增加，在用本发明的肽处理的情况中确认所述MMP-1及MMP-2蛋白的合成再次被抑制而可抑制细胞老化现象与否。

将第31代的NIH3T3细胞以5×10

另外，为了分析MMP-2的而准备如上得到的细胞的溶解物后，施行明胶酶谱法(gelatin zymography)。首先，以明胶(2mg/ml)为底物，施行蛋白电泳(SDS-PAGE)后，用2.5％的Triton X-100处理30分钟后，再次在37℃在缓冲剂(50mM Tris-HCl，0.2M NaCl，5mM CaCl

结果，如图8b的蛋白印迹及酶谱法结果所示，在用上述肽处理的情况中确认，随着肽的浓度增加，MMP-1及MMP-2的蛋白量逐渐减少。

通过如上所述的结果可知，由包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，在NIH3T3细胞中，因UVA照射而被增加的MMP-1及MMP-2的蛋白量再次减少而恢复，胶原的量可再次增加，具有细胞的光老化现象被抑制而皮肤皱纹的改善效果。

以上仅对所记载的实施例详细说明了本发明，但本领于技术人员明晰，在本发明的技术思想范围内的多样的变形及修正是可能的，这样的变形及修正也必然属于随附的权利要求书。

序列表

<110> CAREGEN CO., LTD.

<120> 大气污染物质导致的皮肤损伤防止及抗老化用肽及其用途

<130> 2018DPA3173

<160> 17

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽 1

<400> 1

Ser Tyr Ser Gly Val Leu Phe Phe Leu Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP1A1正向引物序列

<400> 2

ggatctttct ctgtaccctg g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP1A1反向引物序列

<400> 3

agcatgtcct tcagcccaga 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COX-2正向引物序列

<400> 4

atcattcacc aggcaaattg c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COX-2反向引物序列

<400> 5

ggcttcagca taaagcgttt g 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH正向引物序列

<400> 6

ggtgtgaacg gatttggccg tattg 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH反向引物序列

<400> 7

ccgttgaatt tgccgtgagt ggagt 25

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SIRT1正向引物序列

<400> 8

tcagtggctg gaacagtgag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SIRT1反向引物序列

<400> 9

tctggcatgt cccactatca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Col1a1正向引物序列

<400> 10

caccctcaag agcctgagtc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Col1a1反向引物序列

<400> 11

agacggctga gtagggaaca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤连蛋白正向引物序列

<400> 12

ccaggaaccg agtacaccat 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤连蛋白反向引物序列

<400> 13

atacccaggt tgggtgatga 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 弹性蛋白正向引物序列

<400> 14

ggacccctga ctcgcgacct 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 弹性蛋白反向引物序列

<400> 15

ggggaggtgg gactgcccaa 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AQP3正向引物序列

<400> 16

ccttcttggg tgctggaata 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AQP3反向引物序列

<400> 17

acacgataag ggaggctctg 20