使用前负荷的心脏组织筛选和表征心脏治疗剂的离体方法

摘要

提供了以包含前负荷的心脏组织和/或类器官的一种或多种体外测定形式来测定已知和候选治疗剂的心脏肌力作用的方法和材料。

说明书

按照35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2018年6月20日提交的美国临时专利申请第62/687,706号的优先权权益，该临时专利申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

所公开的材料和方法大体上涉及医学领域和已知或候选治疗剂的评估，并且更具体地涉及心脏生理学领域。

背景技术

心脏药物的发现和开发仍然是低效且昂贵的过程，而心脏毒性是导致消耗的主要原因。尽管可以使用传统的动物模型，但主要物种差异限制了它们预测人药理反应的能力。因此，已经开发了基于人多能干细胞衍生的心肌细胞的各种工程化组织模型，用于研究在真实人心脏细胞情形中的收缩性。尽管这些组织模型是最新技术，但经常观察到明显的变异性。当表型或反应不像单基因疾病患者中常见的那样极端时，这种信噪比问题就尤其成问题。实际上，工程化心脏组织经常报告对正性肌力剂的反应微弱或无效。文献综述表明，工程化人体心脏组织功能的研究是通过非生理被动拉伸进行的，这意味着静息肌节长度短，肌动蛋白和肌球蛋白横桥更少。这可能会低估或误解心脏中真正的生理反应，默认情况下，心脏在拉伸状态下起作用。例如，在被动拉伸下观察到的心脏收缩性对药理化合物的肌力反应，以及基于剂量-反应关系所观察到的效力可能不一定反映在存在前负荷的情况下在天然心脏中所观察到的。困扰心脏的疾病也可能在未拉伸的组织中不准确地建模，使得表型相对于临床观察到的表型被低估。

为了增进我们对人心血管系统和人心脏保健的理解，已经进行了许多努力，但是在本领域中仍然需要可以快速而准确地揭示已知或候选治疗剂(包括心脏治疗剂)的药理作用的生物学模型，和/或可以快速而准确地揭示患有传统上被认为本质上是非心脏疾病的患者的细胞中的心脏作用。

发明内容

基于对肌节收缩的激活依赖于长度的理解，期望获得最佳的前负荷范围，以改善信噪比(即降低结果变异性)，从而提高工程化的心脏组织和腔室用于检测收缩性的表型差异的敏感性。最初检查了人心室心脏组织条(hvCTS)和类器官腔室(hvCOC)的对具有肌力作用的一系列药剂的敏感性。hvCTS表现出可检测到的对正性肌力剂的反应，但与用hvCOC观察到的更显著的效果相比更适中(参见例如图6)。随着前负荷的增加，hvCTS的力和hvCOC的压力-体积环面积相应增加，直到达到平稳状态。至于药理反应，当达到最佳组织长度L

本文公开的研究导致了基于心脏组织条(CTS)或心脏类器官腔室(COC)的体外心脏测定形式的发展。适用于本文公开的测定的心脏组织条包括但不限于人心脏组织条，例如人心室心脏组织条(hvCTS)，例如人多能干细胞衍生的心室心脏组织条。每个包含人心脏类器官的心脏类器官腔室包括但不限于人心脏类器官腔室，例如人心室心脏类器官腔室(hvCOC)，例如人多能干细胞衍生的心室心脏类器官腔室。

本公开的测定形式更紧密地反映了跳动的心脏的体内状况，因此，提供了对所测试的治疗剂(无论是已知还是候选治疗剂，以及显示出至少一种心脏作用的无论是心脏还是非心脏治疗剂)的心脏作用的更真实的测量。本文公开的数据证实，测定形式还提供灵敏、准确和可再现的结果，以有效指导临床医生选择和优化用于治疗包括心脏病在内的多种疾病的治疗剂。该测定形式普遍利用了心脏组织和/或类器官的前负荷，以更紧密地反映心肌细胞前负荷或处于非收缩或静息状态的张力下的体内状况。心脏组织和/或类器官的前负荷通过揭露肌力反应(其可能是正性或负性肌力反应)的全部程度，从而明显增强了心脏组织/类器官对待测试的已知或治疗药物的肌力反应。测定形式中心脏组织/类器官的前负荷还提高了测定对所评估的已知或候选治疗剂的电生理反应的敏感性。

除了评估已知或候选治疗剂的心脏作用之外，本公开还提供了用于测量健康和患病的心脏组织和/或器官之间的差异的比较测定。本文公开的每种前负荷的测定形式可用于健康和患病组织/类器官的比较测定。在提供已知或候选治疗剂的心脏作用的更真实的照片时，所公开的测定形式还产生了健康和患病组织/类器官之间放大的表型差异，其更准确地反映了它们的表型差异。

根据前述观察，本公开的一个方面涉及一种评估化合物对心肌细胞的作用的方法，该方法包含：(a)通过移动未固定在空间中的生物相容性凝胶支撑构件拉伸包含心肌细胞的生物相容性凝胶来对生物相容性凝胶设备的心肌细胞施加前负荷，其中该生物相容性凝胶设备包含：(i)包含多个心肌细胞的生物相容性凝胶；(ii)用于悬浮生物相容性凝胶的生物相容性支撑设备，其中该生物相容性支撑设备包含至少两个支撑构件，其中一小组支撑构件固定在空间中，并且其中生物相容性凝胶和生物相容性支撑设备形成包含心肌细胞的心脏组织条；(iii)附接到至少一个未固定在空间中的支撑构件的电动机，以在至少一个维度上拉伸生物相容性凝胶；(iv)用于检测生物相容性凝胶的运动的检测装置；以及(v)用于对生物相容性凝胶施加电起搏刺激的电源；(b)对生物相容性凝胶施用有效量的化合物；以及(c)测量包含心肌细胞的生物相容性凝胶对化合物的反应。在一些实施例中，所测量的反应是正性肌力反应或负性肌力反应。在一些实施例中，该化合物是药剂，并且所测量的反应是对药剂的反应。

考虑了化合物是已知治疗剂的实施例，例如其中已知治疗剂可用于治疗心脏疾病或病症的方法，该心脏疾病或病症包括但不限于扩张型心肌病、肥厚型心肌病、肺动脉闭锁、法洛四联症(Tetralogy of Fallot)、扩张型心肌病伴共济失调或内脏异位综合征。在一些实施例中，已知治疗剂可用于治疗非心脏疾病或病症，例如弗里德希氏共济失调(Friedreich’s ataxia，FRDA)、卡-塞氏综合征(Kearns-Sayre syndrome)、碳水化合物缺乏性Ia型糖蛋白综合征(磷酸甘露糖变位酶-2先天性糖基化Ia缺陷或PMM2-CDG-Ia)、脊髓小脑性共济失调、威尔逊氏病(Wilson disease)、丹迪-沃克氏综合征(Dandy-Walkersyndrome)、利氏病(Leigh disease)、线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作(MELAS)或肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病(MERRF)。

在一些实施例中，该化合物是用于心脏疾病或病症或用于非心脏疾病或病症的候选治疗剂。根据本公开的这一方面的示例性方法包括以下方法，其中在化合物施用前，电动机引起包含心肌细胞的水凝胶的长度的变化，该变化在前负荷的包含心肌细胞的水凝胶的长度的1-50％之间，例如20-30％之间。

在一些实施例中，该心肌细胞是健康的心肌细胞，该方法还包含将化合物对健康的心肌细胞的作用与化合物对患病的心肌细胞的作用相比较，以揭示健康的心肌细胞与患病的心肌细胞之间的至少一种表型差异。在一些实施例中，健康的心肌细胞和患病的心肌细胞经历相同程度的生理模拟拉伸。本公开的这一方面的实施例包括其中表型差异是收缩力、收缩速率或舒张速率差异的方法，例如其中患病的心肌细胞表现出小于20μN的收缩力的方法。这一方面的方法包括其中患病的心肌细胞来自患有弗里德希氏共济失调的受试者的方法。在一些实施例中，表型差异随着拉伸程度的增加而增加，直至达到用于产生力的最佳肌肉长度(L

根据本公开的另一方面是一种用于测定心脏类器官对化合物的反应的方法，该方法包含：(a)通过调节静水压力以扩张心脏类器官来对心脏类器官施加前负荷，其中该心脏类器官被容纳在至少一个类器官模块内，该类器官模块包含：(i)至少一个类器官模块，其中每个类器官模块包含培养基入口、培养基出口和至少一个与外部检测装置相容的壁，其中该心脏类器官包含至少一种人体细胞，其中该细胞是人胚胎干细胞、人成体干细胞、人诱导性多能干细胞、来源于人体组织的细胞或人体组织的祖细胞，并且其中该心脏类器官与流体泵或包含可调节体积的流体的流体储集器流体连通，其中该流体泵或流体储集器调节类器官内的压力；(ii)镜布置，用于同时监测至少两个类器官模块中的每一个中的心脏类器官的任何生物发育；以及(iii)检测装置，用于观察至少两个类器官模块中的每一个中监测到的心脏类器官的生物发育；(b)将化合物施用于心脏类器官；以及(c)检测心脏类器官对化合物的反应。

在本公开的这一方面的一些实施例中，反应是正性肌力反应或负性肌力反应。在一些实施例中，该化合物是药剂，并且该反应是对药剂的反应。在一些实施例中，该化合物是已知治疗剂。在一些实施例中，已知治疗剂可用于治疗心脏疾病或病症。在一些实施例中，该心脏疾病或病症是扩张型心肌病、肥厚型心肌病、肺动脉闭锁、法洛四联症、扩张型心肌病伴共济失调或内脏异位综合征。在一些实施例中，已知治疗剂可用于治疗具有至少一种心脏作用的非心脏疾病或病症。在一些实施例中，该非心脏疾病或病症是弗里德希氏共济失调(FRDA)、卡-塞氏综合征、碳水化合物缺乏性Ia型糖蛋白综合征(磷酸甘露糖变位酶-2先天性糖基化Ia缺陷或PMM2-CDG-Ia)、脊髓小脑性共济失调、威尔逊氏病、丹迪-沃克氏综合征、利氏病、线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作(MELAS)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病(MERRF)或内脏异位综合征。在一些实施例中，该化合物是用于心脏疾病或病症或用于非心脏疾病或病症的候选治疗剂。在一些实施例中，在化合物施用前，类器官腔室内的压力引起搏出功的变化，其在前负荷的包含心肌细胞的类器官腔室的搏出功的1-50％之间。在一些实施例中，在化合物施用前，搏出功的变化在前负荷的包含心肌细胞的类器官腔室的20-30％之间。

在根据本公开的这一方面的一些实施例中，心脏类器官是健康的心脏类器官，该方法还包含将化合物对健康的心脏类器官的作用与化合物对患病的心脏类器官的作用相比较，以揭示健康的心脏类器官与患病的心脏类器官之间的至少一种表型差异。在一些实施例中，施加到健康的心脏类器官和患病的心脏类器官的压力是相同的。在一些实施例中，表型差异是收缩力、收缩速率或舒张速率的差异。在一些实施例中，患病的心脏类器官表现出小于2mm H

根据以下详细描述和附图以及根据权利要求，所公开的主题的其他特征和优点将变得显而易见。

附图说明

图1.描述了心肌长度与张力之间的关系。在静息长度，心肌保持最小的张力，但是当肌肉拉伸时，张力急剧上升，重叠的肌动蛋白和肌球蛋白丝相互作用形成横桥和收缩。张力达到峰值的长度称为L

图2.描述了未拉伸的心脏组织检测正性肌力的能力有限。A)人心室心脏组织条(hvCTS)测定检测到当以1Hz起搏并用浓度增加的正性肌力剂异丙肾上腺素(左)和左西孟旦(右)处理时收缩力增加的趋势，但当在其未拉伸状态下测量时它们显示钝化反应。B)在没有前负荷的情况下，用正性肌力剂异丙肾上腺素(左)和左西孟旦(右)处理后，人心室心脏类器官室(hvCOC)测定显示出压力-体积环的面积增加。C)与hvCTS分析相比，在没有前负荷的情况下，hvCOC分析对正性肌力剂异丙肾上腺素(左)和左西孟旦(右)的敏感性都有所提高。将hvCOC反应绘制为相对于在1-Hz起搏下未处理的基线标准化的搏出功；将hvCTS反应绘制为相对于在1-Hz起搏下未处理的基线标准化的发展力。数据以平均值±SEM作图(两种药物的hvCOC n＝4；异丙肾上腺素的hvCTS n＝5，左西孟旦为n＝4)。

图3.描述了示例性设备，其中心脏组织可以被拉伸到限定的程度并测量其收缩性。对于线性组织，例如人心室心脏组织条，图2A描述了可用于长度控制的设备。通过将线性心脏组织固定在两个杆上，其中一个是固定的，而另一个连接到电动机，可以通过电动机的运动来精细地控制组织的长度。组织产生的力可以通过各种方式检测，例如连接到固定杆的力传感器。通过限制肌肉的缩短，收缩是等长的，类似于心缩早期心脏中可见的。如图所示，将包含心肌细胞1的水凝胶附接到两个水凝胶支撑物3。将移动的水凝胶支撑物3附接到电动机2，将另一个水凝胶支撑物3附接到固定锚4。对于三维腔室结构的心脏组织，例如人心室心脏类器官腔室，图2B展示了一种示例性设置，其允许通过调节流体储集器的高度并因此改变hvCOC上的静水压力负载来调节内腔前负荷。hvCOC内腔内收缩产生的发展压通过压力传感器记录下来，并与高速摄像机同步，以同时监视腔室尺寸的变化，这是监测腔室尺寸的一种示例性方法，该方法适用于监测使用多种技术。如图所示，心脏模块6包含与心脏类器官腔室7接触的培养基5。用于交换流体(例如培养基5)并用于容纳压力传感器导线12的管11与心脏类器官腔室7接触。流体压力由流体升降器8(例如千斤顶)，设置在流体升降器8上的培养基箱9以及用于通过管11将培养基递送到心脏类器官腔室7的培养基管10控制。使用通过压力传感器导线12连接到所记录的压力13的压力传感器来记录压力。通过记录装置14保存心脏类器官腔室7的行为。

图4.显示了随时间推移的hvCTS张力的示例性记录：hvCTS如图2A所示连接到等长肌肉浴装置，并通过每20秒将其增加2％，从0％增加到30％应变来调整组织长度(长度的增加相对于组织的静息长度)。如通过心肌的理论长度/张力关系所预测，拉伸引起静态张力(如抽搐的波谷所示，从0％应变时的约5μN到30％应变时的172μN)以及发展张力(如抽搐的幅度所示，从0％应变时的约5μN到30％应变时的20μN)的显著增加。通过在长度(或应变)上绘制发展张力，可以为每个hvCTS确定最佳长度L

图5.显示了生理模拟长度的控制如何可以表现出原本在未拉伸的组织中不明显的疾病表型的一个实例。人胚胎干细胞衍生的hvCTS，用携带抑制线粒体蛋白frataxin(FXN)表达的短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体进行转导，被用作遗传性神经肌肉病症弗里德希氏共济失调(FRDA)的疾病模型。如在FXN表达水平同样低于健康个体的临床FRDA患者中观察到的表型所预期，shFXN转导的hvCTS显示出较弱的收缩力(未拉伸时小于20μN)。通过shFXN与携带组成型表达FXN转基因的慢病毒构建体(Lv-FXN)的共转导，预期恢复FXN表达，以挽救收缩缺陷。在0％应变下，未观察到挽救作用，shFXN+Lv-FXN组与shFXN+RFP对照组之间无显著差异(p<0.05，学生t检验)(图5A)。在50％L

图6.显示了在1-Hz起搏下，前负荷对健康的和携带FRDA的hvCOC的发展压的影响。(左)健康对照hESC-hvCOC和FRDA hiPSC衍生的hvCOC的代表性压力-体积环，后者的面积比前者小。(右)健康的和携带FRDA疾病的hvCOC的发展压均显示出随着前负荷的增加而增加，如所预期(平均值±SEM，n＝2-3)。

图7.显示了在人心室心脏类器官腔室(hvCOC)中进行生理模拟拉伸如何可以增强对正性肌力剂的收缩反应的一个实例。图7A显示了当hvCOC收缩时，前负荷的增加与发展压的增加如何相关，如通过图1中的长度/张力关系所预测。图7B显示了hvCOC在0、2.5、5和7.5mm H

图8.心肌细胞组织条(CTS)的形成和使用示意图。按照所描绘的流程图，图片1示出了将人多能干细胞衍生的心肌细胞和本文公开的胶原蛋白/基质胶组合物添加到含有两个PDMS支撑物的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具中。图片2显示了已形成的CTS。图片3显示了从模具中取出的CTS，其位置使得PDMS支撑物支撑包含心肌细胞的生物相容性凝胶。图片5显示了对CTS的药物施用以及通过凝胶两端的电压差说明的电刺激的施加。图片5显示了用于监测和记录CTS对药物和电刺激反应的设备。

图9.A)生物反应器系统的示意图，该系统包含类器官模块10、计算机控制的检测/记录装置2(例如照相机)，用于通过角锥反射镜13同时对多达四个类器官盒20进行成像(并可选地保存图像)，每个类器官盒都含有类器官1(例如心脏、脑、神经、肝脏、肾脏、肾上腺、胃、胰腺、胆囊、肺、小肠、结肠、膀胱、前列腺、子宫、血液、血管、肿瘤、眼睛或皮肤)。类器官模块10可以含有多个相同类型的类器官1或多种类器官1类型。B)由计算机或数据处理器5组成的成像生物反应器平台的示意图，该计算机或数据处理器控制类器官模块10的阵列。

图10.具有四个类器官盒20的类器官模块10的三维渲染图。示出了等轴测图和侧视图。还显示了类器官1、连接到透镜3的检测/记录装置2、灯12(例如LED灯)、角锥镜13、类器官盒20、温度控制元件4(例如加热器)以及混合器19，例如搅拌棒。

图11.A)用于类器官盒的流体交换系统的示意图，包括流体管线、泵、阀、压力传感器和流体箱。根据功能使用阀和泵的特定配置，例如B)抽吸或C)向培养基槽中添加新鲜培养基。实例1中提供对生物反应器系统的图示实施方案的详细描述。

图12.A)流体交换系统的图形表示，该流体交换系统由在模块内的多个类器官盒之间引导培养基的流体管线、泵和阀组成。可以连接多种类器官类型来模拟“罐中身体”。B)具有足够泵送能力的心脏类器官可以用作唯一的生物泵，以形成自动力的“罐中身体”。实例1提供了生物反应器系统的这些实施方案的附加描述。

图13.A)示出了生物反应器系统的一个实施例，其显示了用于通过由阀控制的类器官1的培养基交换的入口和出口路径(左窗格：心脏类器官；右窗格：肝脏类器官)。B)机械刺激系统的示意图，其中可逆流体泵连接到类器官1以进行充气和放气。基于刺激系统传递的压力变化和类器官1的柔韧性，类器官1受到拉伸。

图14.用于操作生物反应器平台或系统的LabVIEW前面板的示意图。A)多个类器官的采集预览窗口。B)环境控制面板。C)电刺激参数。用户可以选择控制电压功率、更改频率、选择要刺激的腔室并决定发送连续刺激或单个脉冲。D)四个不同类器官的实时压力、体积数据。压力用灰线表示，而类器官体积用黑线表示。E)记录参数。

图15.MATLAB分析以从采集中生成平均P-V环。A)计算组织的平均体积收缩曲线。将跳动的每个体积收缩绘制为散点图，最大收缩时间设置为t＝0秒。平均曲线表示为红色实线。B)总结多个收缩的平均P-V环线图。红色圆圈表示采样时间点的值。

图16.LabVIEW软件的流程图，该软件用于监测本文公开的系统和设备中的细胞、组织和类器官。流程图示意性地例示了基于软件控制环境变量，例如温度和CO

具体实施方式

本公开提供了构成人心肌细胞功能的离体模型的材料和方法，其呈现出许多优点，从而共同导致所公开的模型系统更准确和更精确地以组织和器官的三维组织形式(例如心脏)反映人心肌细胞的体内行为。在所公开的模型系统的优点中值得注意的是结合了心肌细胞前负荷，其允许模型更紧密地模拟体内心肌细胞的行为，该心肌细胞通常经受影响性能的变化的前负荷。更特别地，将可控拉伸应用于工程化心脏组织可改善收缩性测量中的信噪比。受控前负荷足以增加信噪比而受到积极影响的应用包括但不限于(a)增强组织对药物治疗的肌力反应，以及(b)放大健康状态和患病状态之间的表型差异。

在公开的模型系统中有用的工程化心脏组织包括但不限于心脏组织条和心脏类器官腔。根据本公开的心脏组织条包括但不限于人心脏组织条，包括人心室心脏组织条。示例性的人心室心脏组织条是人多能干细胞衍生的心室心脏组织条。根据本公开的心脏类器官腔包括但不限于人心脏类器官腔，包括人心室心脏类器官腔。示例性的心脏类器官腔是人多能干细胞衍生的心室心脏类器官腔。

本文公开的心肌细胞模型系统可用于在涉及心肌细胞前负荷的现实条件下评估或测定已知或潜在心脏治疗剂的肌力反应。所公开的材料和方法可用于评估对已知或候选心脏治疗剂的正性、负性和无效的肌力反应。此外，这些材料和方法可用于在涉及心肌细胞前负荷的现实条件下评估任何化合物例如药物的心脏作用。因此，本公开提供了用于快速、有成本效益、可靠和准确地评估任何化合物(例如药物或治疗剂，包括影响身体功能和不直接涉及心血管系统的疾病进程的已知或候选治疗剂)的心脏作用以及评估已知或候选心脏治疗剂的材料和方法。因此，所公开的材料和方法用于针对多种疾病的症状的治疗、预防或改善来评估已知或候选治疗剂，该疾病包括但不限于扩张型心肌病、肥厚型心肌病、肺动脉闭锁、法洛四联症、扩张型心肌病伴共济失调、内脏异位综合征、弗里德希氏共济失调(FRDA)、卡-塞氏综合征、碳水化合物缺乏性Ia型糖蛋白综合征(磷酸甘露糖变位酶-2先天性糖基化Ia缺陷或PMM2-CDG-Ia)、脊髓小脑性共济失调、威尔逊氏病、丹迪-沃克氏综合征、利氏病、MELAS(线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作)和MERRF(肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病)。

本公开提供了针对心肌细胞中有益或有毒性的心脏作用筛选化合物的系统和相关方法，该心肌细胞源自健康个体、心脏患者或患有具心脏作用的非心脏疾病(例如可具有至少一种心脏作用的神经疾病、病症或病况)的患者。系统的一些配置包括功效筛选，然后是毒性筛选，具体取决于要建模的疾病的表型。最初的功效筛选用于确定可改善、挽救或消除疾病症状的治疗，然后是毒性筛选以消除具有不可接受的有害副作用的治疗。

本公开提供了几种基于体外心脏组织或类器官的模型，用于评估已知或候选治疗剂(包括心脏治疗剂)的功效和/或毒性，以及评估或监测患有心脏疾病的患者或患有具至少一种心脏作用的非心脏疾病的患者的心脏组织或类器官的功能或行为。生物杂交材料的显著优势在于可以进行更准确地反映体内生理效应的体外测定。在一些实施例中，系统包含心脏组织条(CTS)，例如以允许凝胶运动显著灵活性的方式支撑的人心室心脏组织条(hvCTS)，以及在存在或不存在测试化合物的情况下捕捉凝胶运动的相关检测(例如记录)装置。为了促进前负荷，hvCTS至少在两个点被支撑，其中之一固定在空间中并与附接的力传感器相关联。至少一个其他支撑点，例如杆附接到电动机，以允许精确控制的运动，从而导致hvCTS拉伸。CTS本身易于制备，主要涉及包埋在生物相容性凝胶中的组织形成性心肌细胞。hvCTS系统和方法适用于高通量格式以及常规格式。

如本文所述，另一种体外测定系统和方法涉及在通常位于类器官模块中的类器官盒中形成并维持的组织或类器官腔。测定涉及将健康或患病个体的组织或类器官暴露于盒中的已知治疗剂或候选化合物，该盒放置在检测(例如记录)装置可以监测类器官行为的环境中。该环境通常还提供在受控条件下递送和除去流体，例如培养基和含化合物的流体，需要各种控制来维持与组织或类器官生存力相容的环境。该系统和方法揭示了在细胞、组织和/或类器官或器官水平上具有有益心脏作用的化合物，从而提高了在具有这种作用的化合物的筛选中获得的结果的准确性和可靠性。此外，这一测定可以扩大规模以使用一种以上的hvCOC。可能具有相同类型(例如心脏)或不同类型的多个组织和/或类器官，在可以方便地位于单个类器官模块中的不同类器官盒中开发和维持(应理解，类器官盒和类器官模块可以含有组织或类器官)。在一些实施例中，这种布置方便地允许将单个镜系统(例如角锥镜系统)与单个检测(例如记录)装置结合使用。本公开还考虑组合测定，其揭示了关于已知或候选化合物对健康或患病细胞的心脏作用以及已知或候选化合物对一种或多种同源组织、类器官或器官或多种不同的组织、类器官或器官的作用的信息。对来自给定来源的一个或多个样品执行不止一种测定，进一步在准确性、可靠性和可重复性方面增强了获得的数据，并在金钱和时间方面增加了可管理的成本。

以下引述的术语在本文明确定义。

“APD50”意指50％复极化的动作电位持续时间。

“APD90”意指90％复极化的动作电位持续时间。

“FRDA”意指弗里德希氏共济失调。

“FXN”意指蛋白frataxin，而“FXN'意指编码FXN的多核苷酸。

“工程化的心肌细胞”是经过重组工程化以表现出特定基因型和表型的心肌细胞。如本文所用，典型的工程化的心肌细胞包含使用任何已知载体，例如本文公开的慢病毒载体，引入外源核酸，例如针对FXN的短发夹RNA的心肌细胞。

“hESC”意指人胚胎干细胞，“hESCs”意指多个人胚胎干细胞。

“hiPSC”意指人诱导性多能干细胞，“hiPSCs”意指多个人诱导性多能干细胞。

“hPSC”意指人多能干细胞，其可以意指hESC或hiPSC，“hPSCs”意指多个人多能干细胞。

“hvCM”意指人心室心肌细胞，“hvCMs”意指多个人心室心肌细胞。

“hvCOC”意指人心室心脏类器官腔，“hvCOCs”意指多个人心室心脏类器官腔。

“hvCTS”意指人心室心脏组织条，“hvCTSs”意指多个人心室心脏组织条。

一般而言，本公开涵盖各种测定格式，以评估可用于治疗多种疾病(包括心脏疾病和非心脏疾病)的已知或候选治疗剂。该测定格式包括评估已知或候选治疗剂对前负荷的心脏组织或类器官的作用。对心脏组织或类器官施加前负荷，例如通过拉伸心脏组织或类器官，更紧密地反映心脏组织和器官的体内状态，从而导致对已知或候选治疗剂的心脏作用进行更灵敏和准确的测量。一种测定格式提供了前负荷的心脏组织，例如人心室心脏组织条(hvCTS)，其适用于已知或候选治疗剂的心脏作用的快速高通量测定。另一种测定格式提供了前负荷的心脏类器官，例如人心室心脏类器官腔(hvCOC)，其允许评估已知或候选治疗剂对三维生物材料(称为心脏类器官)的一种或多种作用。通过对三维心脏进行建模，hvCOC测定格式有望提供有关已知或候选治疗剂的信息，将比已知的心脏测定格式更好地转化为体内心脏状况，从而比使用已知技术更快，更有成本效益地鉴定出具有可接受毒性概况的有效化合物。

本文公开的心脏测定格式可用于评估已知或候选心脏治疗剂，其可用于治疗各种已知的心脏疾病或病况中的任何一种。心脏测定格式还可用于评估已知或候选治疗剂的心脏作用，以治疗可能具有心脏作用的非心脏疾病或病况。考虑将各种疾病的已知或候选治疗剂作为合适化合物以使用本文公开的测定格式的前负荷的心脏组织或类器官来评估。那些疾病/病况包括但不限于扩张型心肌病、肥厚型心肌病、肺动脉闭锁、法洛四联症、内脏异位综合征、弗里德希氏共济失调(FRDA)、卡-塞氏综合征、碳水化合物缺乏性Ia型糖蛋白综合征、脊髓小脑性共济失调、威尔逊氏病、丹迪-沃克氏综合征、扩张型心肌病伴共济失调、利氏病、MELAS(线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作)和MERRF(肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维病)、具有心脏功能障碍的神经疾病或病症和共济失调，例如扰乱神经心脏轴的神经疾病或病症。遗传性神经疾病和病症可能具有直接或间接的心血管作用，包括对心脏生理功能的影响。具有这种作用潜能的示例性神经疾病和病症包括但不限于弗里德希氏共济失调(FRDA)；卡-塞氏综合征，其为一种线粒体肌病，具有心脏传导异常和心肌病；碳水化合物缺乏性Ia型糖蛋白综合征，其为一种神经疾病，具有畸形和心脏表现(心脏损害的平均发作时间为5个月，20％死于生命的第一年内，通常是由于严重的心脏并发症引起)；脊髓小脑共济失调，其具有心血管异常，特别是异常心率变异性；威尔逊氏病，其为一种铜代谢病症，具有同心重塑和室上性心动过速；心律失常；丹迪-沃克氏综合征，其以心脏畸形为特征；扩张型心肌病伴共济失调，其表现出DCM和长QT，其中70％的患者进展为心力衰竭或心源性猝死；利氏病，其为一种神经病症，可能与肥厚性心肌病有关；MELAS，其为一种具有LV肥大的线粒体疾病；以及MERRF，其为一种具有心肌病的神经肌肉病症。

为了维持恒定的心脏收缩所需的能量消耗，赋予心肌细胞(心脏的单个工作单元)所有细胞中最高的线粒体密度。

为了消除归因于不同hPSC系遗传背景变化的收缩和电生理功能的可能差异反应，通过使用慢病毒递送的Lv-shFXN敲低hESC中的FXN表达来模拟如FRDA患者中所报告的低FXN表达，从而生成了等基因FRDA模型，如以下实例中所公开。如在转录本和蛋白质水平上FXN表达的减少所证明，该策略已被证明是有效的(实例3)。更重要的是，首次在由FXN缺陷型hvCM工程改造的心脏组织hvCTS中观察到了收缩功能障碍。与随时间推移显示出发展力逐渐增加的健康hESC-hvCTS不同，在FXN缺陷型hESC-hvCTS中，收缩力降低并且保持较低(实例3)。此外，在缺乏FXN的hESC-hvCTS中，力发展的上升和衰减速度也较慢。这些观察结果表明，FXN的缺乏影响了hvCM产生力的能力，随着hvCTS随时间推移逐渐成熟，这一点变得更加明显。

FXN缺乏对心脏收缩功能障碍的影响在FRDA-hiPSC衍生的hvCM模型中得到了进一步验证。类似于等基因的FXN缺陷型hESC-hvCM模型，尽管细胞系之间的遗传背景不同，但相对于健康的hiPSC-hvCM对照，FRDA-hiPSC衍生的hvCM还通过qPCR和蛋白质印迹证实了FXN的合成减少。FRDA的六种不同的hESC-和hiPSC-hvCTS模型(包括健康hESC-和hiPSC-hvCTS中的等基因FXN敲低模型，它们各自的健康hESC-和hiPSC-hvCTS对照以及来自两名患者的FRDA患者来源的hiPSC-hvCTS)验证了发展力与FXN表达之间的关系。重要的是要注意，主动力的大小与FXN表达之间存在很强的正相关性(实例4)，如皮尔逊系数(Pearson’scoefficient)0.84所示，其中>0.5的值表示很强的正相关性。因此，本文公开的数据首次在两种体外模型中建立了FRDA收缩表型，即来自FXN敲低的等基因模型和直接来自具有FXN基因固有突变的FRDA患者的另一种模型。

FXN表达的恢复挽救了受损的收缩功能

通过在FRDA患者的hiPSC和FXN敲低的hESC FRDA模型中诱导FXN的表达，两个模型在hvCTS中产生的力得到了显著改善，这首次证明了通过恢复FXN的表达挽救了人FRDA三维组织模型中受损的收缩功能(图5，实例6)。这与可诱导和可逆的鼠FRDA模型相一致，该模型表明FXN表达的恢复可以逆转病理效应。

FXN缺陷型hvCOC模型

除hvCTS外，流体喷射人心室心脏类器官腔(hvCOC)为FRDA疾病表型建模提供了高阶工程化的心脏组织。hvCOC模型可以概括生理上复杂的行为，例如压力-体积关系、搏出功和心输出量，并且还提供了促成熟环境来增强心脏模拟特性，尤其是与收缩性有关。患者来源的FRDA hiPSC-hvCM在物理上完好无损，并且可以泵送流体并产生压力(图6)。当与对照hESC-hvCOC相比时，这些模型在基线条件或5和10mm H

以下实例说明了本发明的实施例。实例1描述了多能干细胞的定向分化以形成心室心肌细胞以及本文公开的系统和测定的工程化组织制造。实例2描述了用于所公开的系统和方法中的心肌细胞的前负荷的实验，其中前负荷是通过机电转化或压力变化通过细胞/组织/类器官拉伸来完成的。实例3-5分别提供了与本文公开的心肌细胞测定格式，即心肌细胞组织条(CTS)和心肌细胞类器官腔(COC)有关的一般公开内容。

实例

实例1

直接心脏分化和工程化心脏组织制造

如先前报道，心室(v)心肌细胞(CM)是从人多能干细胞(hPSC)分化而来

在分化后第15天，将vCM心球样细胞团用0.025％胰蛋白酶-EDTA解离。然后将解离的vCM再悬浮于具有50μg/ml抗坏血酸和10μM Y-27632二盐酸盐的StemPro-34完全培养基中。

人心室心脏组织条(hvCTS)和心脏类器官腔(hvCOC)的制造

解离后72小时，通过将130万个hESC-vCM和13万个人包皮成纤维细胞与包含1.67mg/ml胶原蛋白和72.3mg/ml基质胶的110μI胶原蛋白凝胶混合来制备hvCTS。然后将细胞混合物浇铸到带有两个支柱的PDMS模具中，并在37℃，5％CO

hvCOC是通过类似的方法制备的：将1000万个hESC-vCM和100万个人包皮成纤维细胞与1650μI胶原蛋白凝胶混合(与上文关于hvCTS所述相同的相对组成)。然后将混合物浇铸到2％琼脂糖凝胶中的13-mm直径的空腔中。然后将改良的6-Fr硅胶球囊Foley导管(CookMedical)充气并放置到生物反应器的中央，以形成hvCOC的内部边界。将8mm多孔聚乙烯环(Fisher Scientific)和6mm橡胶环放在导管顶部，以提供hvCOC锚。聚乙烯环、橡胶环和导管由外径为3.9mm的金属管固定。使细胞混合物在37℃，5％CO

实例2

hvCTS的前负荷实验

为了在FRDA hvCTS疾病模型中进行挽救，用靶向FXN的慢病毒shRNA(在pLKO.1载体骨架中包含shRNA序列TRCN0000006137的Lv-shFXN)和第二个慢病毒构建体转导hESC-vCM，第二个构建体含有组成型表达的FXN转基因(Lv-FXN；GE Dharmacon OHS5835-EG2395)或红色荧光蛋白作为对照(Lv-RFP；GE Dharmacon)。解离24小时后，Lv-shFXN在感染复数(MOI)为2时，而Lv-FXN或Lv-RFP在MOI为5时被转导到解离的hESC-vCM中。如上所述，将转导的hvCM组装成hvCTS。

在制造后的第17天，将人心室心脏组织条(hvCTS)从其模具中转移并钩到隔离的肌肉浴系统(Aurora Scientific)的力传感器单元和电动机单元上。然后调节所钩组织的长度，以达到最小的发展张力，该长度定义为组织的原始长度(Lo，或0％Lmax)。然后将hvCTS在37℃的浴中培育10分钟。接下来，以1Hz的频率对hvCTS进行电起搏(5V/cm)，并每20秒以2.5％的增量从0拉伸至50％的应变。使用动态肌肉控制软件(Aurora Scientific)进行记录。通过Clampfit(Molecular Devices)分析在每一％应变下的收缩参数，例如发展力、收缩速率和舒张速率。具有最大发展力的长度定义为L

hvCOC的前负荷实验

在制造后的第10天测量了人心室心脏类器官腔(hvCOC)的行为。首先，将导管放气并取出。然后，将培养基替换为不含酚红的DMEM(含25mM葡萄糖和25mM HEPES)。然后，将橡胶管用培养基填充，并用于将hvCOC装置的金属管连接到培养基箱。将hvCOC在1.5Hz(5V/cm)下电起搏，并记录起搏收缩引起的压力-体积变化30秒。通过放置在hvCOC内的压力传感器(Millar)测量压力，并通过高速照相机(Allied Vision)捕获hvCOC的相关面积变化。然后将培养基箱的液位从0mm(相对于hvCOC生物反应器中的培养基液位)调整到高于培养基液位2.5、5和7.5mm(表示0、2.5、5和7.5mm H

实例3

心肌细胞组织条

本公开提供了一种心肌细胞组织条(CTS)，其可用于测定已知或候选治疗剂以治疗心脏疾病或病症，或治疗具有至少一种心脏作用的非心脏疾病或病症，例如各种神经疾病，例如弗里德希氏共济失调(FRDA)。通常，CTS包含包括多个心肌细胞的生物相容性凝胶和用于悬浮生物相容性凝胶的生物相容性支撑设备，其中生物相容性凝胶和生物相容性支撑设备形成心脏组织条；用于检测生物相容性凝胶的运动的检测装置；以及用于对生物相容性凝胶施加电起搏刺激的电源。

CTS中的心肌细胞可以是人心肌细胞，例如人心室心肌细胞。此外，人心肌细胞可以源自至少一种人多能干细胞。在一些实施例中，心肌细胞以至少10

支撑设备被认为包括至少两个竖直支撑构件(例如两个竖直支撑构件)，并且那些竖直支撑构件可以由聚二甲基硅氧烷制成。在一些实施例中，竖直支撑构件(例如两个竖直支撑构件)的横截面是近似圆形的，直径为约0.5mm。在一些实施例中，心脏组织条是约26.5mm长度×约16mm宽度×约6mm高度，例如26.5mm长度×16mm宽度×6mm高度的心脏组织条。在一些实施例中，检测装置是高速照相机。

本公开还提供了一种制造心脏组织条的方法，其包含：(a)提供合适尺寸的生物相容性模具，例如约26.5mm长度×约16mm宽度×约6mm高度；(b)形成与模具相符合的生物相容性凝胶，其中生物相容性凝胶包含基质胶、胶原蛋白和多个心肌细胞；以及(c)将至少两个竖直支撑构件固定到生物相容性凝胶，从而形成心脏组织条。在该方法的一些实施例中，竖直支撑构件是通过在凝胶化之前，将竖直支撑构件包埋于生物相容性凝胶制剂中而固定到生物相容性凝胶。在一些实施例中，竖直支撑构件是通过粘附或通过机械附接而固定到生物相容性凝胶。

实例4

生物反应器

本公开提供了用于培养许多，并且在一些情况下，培养多种组织工程化的人类器官的生物反应器。该装置被设计成允许互连和同时测量多个类器官，并具有通过使操作员能够以最少操纵或干预而在同一生物反应器中进行后续表征来增强类器官功能测试的重现性和效率的特征。

图7提供了高级示意图，说明所公开的生物反应器系统的多功能性。图7A显示了一个类器官模块10，该模块含有至少一个类器官盒20。类器官盒20含有任何类型的单个类器官1(例如心脏、脑、神经、肝脏、肾脏、肾上腺、胃、胰腺、胆囊、肺、小肠、结肠、膀胱、前列腺、子宫、血液、血管、肿瘤、眼睛或皮肤等)。类器官模块10可以含有多个类器官盒20，因此可以含有多个单一类型的类器官1或多种类器官1。类器官模块10被定向成使得检测/记录装置2(例如照相机)可以检测和记录类器官模块10的内容，例如通过使类器官模块10最靠近检测/记录装置2并且优选地垂直于该装置的表面对检测/记录装置2所检测的电磁频谱的至少一个波长基本上或完全透明来进行该检测和记录。图7B示出了与至少一个类器官模块10连接的数据处理器5，例如计算机。类器官模块10通常与检测/记录装置2呈1:1对应，并且检测/记录装置2通过通信路径7，例如常规的电线或无线通信与数据处理器5进行电子通信。视频监视器6也可以通过通信路径7连接到数据处理器5。

图8示出了类器官模块10的透视图。至少一个类器官盒20位于类器官模块10内。安置于类器官模块10之内或之外(未示出)以及安置于类器官盒20之内(未示出)或之外的是混合器19，例如上面放置类器官模块10的可移动平台(例如振动器或旋转平台)或位于类器官盒20内部或外部的磁力搅拌装置(例如搅拌棒)。在一些实施例中，至少一个光源12位于类器官模块10内，用于照亮类器官1。同样位于类器官模块10内的是至少一个镜13，用于以直射和/或反射光图像的形式将电磁辐射从类器官1引导至检测/记录装置2。在一些实施例中，镜13是角锥镜13，用于将图像从多个类器官腔20引导至单个检测/记录装置2。角锥镜13可以将多个类器官腔20的图像汇合成单个聚集的视点以使图像分辨率最大，同时允许各个类器官腔20以物理方式彼此间隔开。

图9示出了生物反应器系统的一个实施例的元件，该元件涉及流体移动，例如培养基流动，特别是涉及添加或供给新鲜培养基以及去除或抽吸用过或废弃的培养基所涉及的流体移动。图9A示出了用于类器官模块10中的单个类器官腔20的整个流体交换系统，图9B提供了用于抽吸的激活阀和泵的组合，而图9C提供了用于供给新鲜培养基的组合。该系统中涉及流体(例如培养基)运动的组件可以位于类器官模块10之内或之外。在描述如图9所示的提供流体运动的生物反应器系统的一个实施例时，注意力将集中在用于培养基抽吸的图9B以及用于将培养基供给至本公开的细胞、组织和类器官的图9C。应理解，抽吸和供给的组合描述将提供对生物反应器系统的一个实施例中的完整流体连通的描述，如图9A所示。在图9的其余描述中，附件应理解为在附接的组件之间提供流体连通。

现转到生物反应器系统的一个实施例中涉及用于抽吸培养基的图9B的特征，培养基93与腔培养基-接头D管道86接触，该管道附接到接头D阀67。类器官-接头D管道85也附接到接头D阀67。此外，接头D阀67附接到接头D-泵C管道87，该管道附接到泵C 72。泵C 72附接到泵C-接头C管道88，该管道附接到接头C阀66。接头C阀66附接到接头C-混合/再循环箱管道89，该管道又附接到混合/再循环箱73。在一些实施例中，培养基93再循环并被导向混合/再循环箱73。接头C阀66还附接到从接头C阀66通向废料的接头C-废料管道90。

在操作中，类器官中细胞的供给涉及图9C中突出显示的组件，包括新鲜培养基箱60，其附接到新鲜培养基-接头B管道78，该管道又附接到接头B阀65。接头B阀65附接到接头B-泵B管道79，该管道附接到泵B 71。泵B 71又附接到泵B-接头E管道80，该管道附接到接头E阀68。接头E阀68还附接到接头E-接头F管道82，该管道附接到接头F阀69。腔培养基-接头F管道83也附接到接头F阀69，该管道也接触腔培养基93。

描述了附加的附接组件，其在系统内提供流体连通并允许附加的功能，包括但不限于治疗性添加剂稀释、治疗剂的灌注、类器官的治疗性清洗、流体管线的冲洗等。新鲜培养基箱60附接到新鲜培养基-接头A管道74并与之流体连通，该管道又附接到接头A阀64，例如三通流体控制器或阀并与之流体连通。添加剂容器62(例如治疗剂容器)用于将至少一种治疗剂递送至添加剂箱63，该添加剂箱附接到添加剂箱-接头A管道75，该管道又附接到接头A阀64。接头A阀64还附接到接头A-泵A管道76，该管道附接到泵A 70。泵A 70附接到泵A-混合/再循环箱管道77，该管道又附接到混合/再循环箱73。在一些实施例中，来自新鲜培养基箱60的培养基用于稀释来自混合/再循环箱73内的添加剂箱63的治疗剂。混合/再循环箱73还附接到混合/再循环箱-接头B管道92，该管道又附接到接头B阀65。接头E阀68附接到接头E-类器官腔管道81。在一些实施例中，培养基可以通过接头E-类器官腔管道81进行递送，以增加类器官1内的压力。压力探针，即压力传感器95，检测类器官1内的压力和压力变化，并将压力转换为模拟电信号，该信号通常会传输到数据处理器，从而允许压力由系统监测和调整。另外，该装置提供了对流体管线的清洗或冲洗。特别地，接头F阀69附接到接头F-废料管道84，该管道又从接头F阀69引导至废料。在一些实施例中，通过经由接头F-废料管道84排出到废料，可以在不与类器官腔20接触的情况下从流体交换系统中除去流体。

图10示出了类器官模块10内的流体交换的高级示意图，以说明“罐中身体”的形成。图10A示出了流体交换系统，该流体交换系统在类器官模块10内的至少两个类器官腔20之间转移培养基。流体通过一系列的阀和泵被引导通过该系统。图10B示出了流体交换系统，其中流体由阀引导并且仅由生物泵(例如心脏类器官1)泵送，从而提供自供能的“罐中身体”。

图11示出了使流体流入和流出类器官1的方法。图11A示出了类器官1(左图：心脏类器官；右图：肝脏类器官)，其连接至培养基入口管26和培养基出口管28，从而允许流体被引导到类器官1的空隙中并通过培养基出口管28流出至废料路径。流经类器官1的流体的方向由入口阀27和出口阀29控制。图11B表示了向类器官1(例如肺类器官1)施加机械压力的方法。流体泵控制流体流动(例如气体或液体)到类器官1并调节类器官腔的压力以控制类器官1的大小。绝对压力值取决于类器官1的材料特性和给定应用所需的膜尺寸。调整施加的相对压力以使机械应变至多25％。

如对本领域技术人员显而易见的，生物反应器系统的一些特征是可选的，并且该系统的大多数特征存在于各种实施例中。在一些实施例中，细胞可以源自任何哺乳动物物种或被工程化为来自细胞和/或细胞外基质的类器官1。任何器官组织类型均适用于所公开的系统、组合物和方法。例如，组织可以充当任何器官的替代物，包括但不限于心脏、脑、神经、肝脏、肾脏、肾上腺、胃、胰腺、胆囊、肺、小肠、结肠、膀胱、前列腺、子宫、血液、血管、肿瘤、眼睛和皮肤。

含有类器官1的类器官腔20通常是由透明固体制成的立方体，其可以是一次性的或可灭菌的，具有至少两个接入端口，例如门。合适的透明固体包括玻璃和透明塑料，例如聚苯乙烯、丙烯酸和聚碳酸酯。只要检测/记录装置2可以检测和记录类器官腔20内的类器官1中的细胞的行为，类器官腔20也可以是任何多边形。假定类器官腔20的结构受到允许检测/记录装置2检测细胞行为的需求所限制，很明显可以在构造类器官腔20中使用各种透明和半透明的材料。在检测/记录装置2不检测来自类器官1的可见光的透射的实施例中，甚至设想了不透明的材料。类器官腔20也被构造成不透流体的，从而允许类器官腔20容纳腔培养基93以供给类器官1的细胞。此外，腔盖可以提供用于穿透至少一个电极或压力探针(即压力传感器95)的孔。

在类器官模块10中含有至少一个类器官腔20，该模块由与用于类器官腔20的材料相似的材料形成。类器官模块10在平面图中通常为正方形或矩形，并且除了底部外还含有顶部。类器官模块10的尺寸可容纳至少1、2、3、4、5、6、8、10或更多个类器官腔20。类器官模块10的壁、顶部和底部通常由透明固体形成，例如玻璃或透明塑料(例如丙烯酸或聚碳酸酯)，但也可以由半透明或不透明的材料制成，只要检测/记录设备2可以检测和记录细胞行为即可。类器官模块10通常还含有一个或多个光源12，以及一个或多个镜13，例如角锥镜13。在若干实施例中，对于类器官模块10中所含的每个类器官腔20，存在至少一个光源12和镜13的至少一个表面。

该系统的其余组件包括诸如新鲜培养基箱60、混合/再循环箱73和添加剂箱63之类的箱，它们是用于容纳系统中使用的流体的容器。这样的箱可以是任何各种尺寸，并且可以由多种材料制成，只要所构造的箱可以在设计用于最小化生物污染的环境(例如无菌环境)中使用，并且只要所使用的材料与形成一个或多个流体移动端口兼容即可。该系统的实施例还可以涉及一个或多个泵，例如泵A 70、泵B 71和泵C 72，这些泵可以相同或不同，并且可以按照已知的任何提供流体(例如通过管的空气和/或培养基)移动的原理进行操作。示例性的泵包括蠕动泵、与无菌环境兼容的虹吸泵、诸如活塞驱动泵的正排量泵和诸如离心泵的非正排量泵。在一些实施例中，重力被用于使流体移动，而没有泵被用于使例如培养基移动。

类器官模块10还可以与各种管接口以使用于提供压力的气体(例如空气)移动，例如使类器官膨胀，该类器官可以是球囊(例如6-Fr硅Foley导管球囊)或用于使流体移动。压力变化足以控制球囊的充气或使流体在系统中移动，这是在与多种管类型的使用兼容的压力下实现的，而不仅仅是经认证处理高压的管道。例如，适合使用透明的塑料柔性管道，例如

在一些实施例中，类器官模型具有流入和流出的流体路径(图11A)。阀(例如止回阀、电磁阀)控制流体移动进出带有腔的类器官的方向。在一些实施例中，考虑了用于流入和流出的单个轴或管(图11B)。流体泵控制流入和流出类器官的流体流动速率。在一些实施例中，不相等的流入和流出流体速率用于控制类器官内的流体量。调节类器官腔内的体积会导致柔韧性类器官的机械拉伸。在一些实施例中，以阶跃函数(被动拉伸)或S形函数(循环拉伸)形式施加拉伸。在许多类器官类型中，机械拉伸被认为是机械转导信号。在一些实施例中，机械刺激和电刺激的组合为治疗筛选提供了更稳健的反应。

流体交换系统自动进行常规培养基更换，调节腔内压力，在筛选过程中对治疗剂进行灌注并在类器官之间交换培养基(图10和11)。流体系统由一系列微流体泵、由数字输出板控制的三通阀和培养基储集器组成。更改阀配置会改变培养基的行进方向。在一些实施例中，可以将流体添加到中空的竖直安装轴中或从中去除，该轴连接有类器官，从而调节静水压力。压力传感器95和信号调节器(例如OPP-M和LifeSens)感测类器官内的平均压力，并通过LabVIEW与泵通信以调节所需的腔内压力。另外，流体交换系统用于将治疗剂混合和灌注至类器官。从添加剂箱中泵吸出溶液，并与循环培养基混合。然后治疗剂灌注到类器官腔20中并通过类器官1，类似于经由人血流的药物递送。在一些实施例中，泵和阀的流体系统连接类器官模块10内的至少两个类器官腔20，以允许在类器官1之间或当中进行培养基和/或治疗剂的交换。另外，在一些实施例中，类器官腔20之间的流体交换系统由类器官1形式的生物泵(例如心脏类器官1)提供动力。

系统控件

自定义LabVIEW代码自动执行该过程的很大一部分，包括硬件和软件。每个类器官模块10通过一台由LabVIEW驱动的计算机(即数据处理器5)进行离散控制。有关示例性软件流程图，参见图14。因此，在或可以在不同条件下同时监测多个类器官1和多个类器官模块10(图12)。LabVIEW代码控制相关的硬件，例如数据采集装置、多通道数字输出源、阀、泵和照相机捕获卡。因此，该代码以电子方式控制生物反应器平台或系统的多种功能，例如自动药物灌注和混合、腔内压力控制、电刺激、CO

数据捕获

同时记录压力和体积数据，以在相关的收缩类器官中生成压力-体积曲线。高速数字照相机(Allied Vision)获取高达100帧/秒的图像。通过假设具有相同横截面积的等效球体来估算类器官体积。单次采集通常包含多次收缩。为了表征类器官的平均收缩特征，MATLAB代码首先将曲线分成离散的收缩。然后将每次收缩的数据对齐并取平均值(图13A)。然后可以将平均压力曲线和平均体积曲线绘制为平均P-V环(图13B)。

分析记录的高速明场视频(例如光流)以表征收缩类器官的运动模式。分析收缩概况的变化以确认对类器官收缩性能的治疗作用。为了处理大量的多维数据采集，机器学习算法确定与治疗反应相关的关键参数，并最终将未知的治疗剂分类为感兴趣的类别。此外，机器学习可以与长期数据采集同时执行，以鉴定罕见的异常事件并最小化数据存储。例如，长期数据采集可以分为一系列连续的采集。随着进一步的采集继续，已完成的采集被发送到缓冲区进行分析。机器学习(例如二进制支持向量机)会根据缓冲区内的数据评估功能中的任何异常，例如罕见的异常事件。如果检测到异常，则将相关数据永久存储，而将正常功能数据丢弃。

类器官模块

在本文公开的生物反应器系统的一些实施例中，外壳(约25x25x15 cm)由可灭菌材料与检测/记录装置2(例如照相机)和温度控制元件4(例如加热单元)制成，附接到类器官模块10的顶部。在一些实施例中，例如加热器形式的温度控制元件4被放置在外壳内。竖直照相机聚焦到四边形的45度角锥镜13上，其将一个或多个类器官1的侧面轮廓向上反射到照相机。倾斜的LED灯12均匀地照亮每个类器官1的侧面轮廓。接入门允许将可更换的类器官腔20简单地插入到类器官模块10中以进行监测，然后取出进行其他实验分析(例如光学标测)。在对类器官1进行治疗性给药后，使用微型磁力搅拌器(例如ThermoSci MicroStirrer)形式的混合器19混合培养基93，该混合器可以使用软件控制来打开和关闭。使用包括恒温器、加热器和风扇(例如IncuKit Mini)的温度控制元件4对每个类器官模块10进行温度控制。为了细胞培养缓冲，CO

尽管已经进行了各种微组织的微流体连接以形成“芯片上身体”的研究，但尚未描述用于较大的宏观类器官形成复杂的、相互连接的“身体”的生物反应器平台。由于微组织缺少较大器官的关键特征(例如较厚组织的扩散限制)，因此它们不是模拟人体器官反应的理想选择。允许在多个宏观类器官之间进行流体交换的系统概括了人体的关键生理和药理特征。在简化的人体仿生模型中测量多个功能特性的能力为弥合传统细胞培养系统、体内动物模型和临床试验之间的长期差距提供了新途径。结合诱导的hPSC的体细胞重编程，“罐中人体”系统有望成为下一代药物发现、心脏毒性筛选、疾病模型化以及其他种族、性别和患者特异性应用的通用平台。

参考文献

1.Martelli A,Puccio H.Dysregulation of cellular iron metabolism inFriedreich ataxia:From primary iron-sulfur cluster deficit to mitochondrialiron accumulation.Front Pharmacol.2014；5:130.

2.Dixon SJ,Stockwell BR.The role of iron and reactive oxygen speciesin cell death.Nat Chem Biol.2014；1 0:9-17.

3.Kipps A,Alexander M,Colan SD,Gauvreau K,Smoot L,Crawford L,DarrasBT,Blume ED.The longitudinal course of cardiomyopathy in Friedreich's ataxiaduring childhood.Pediatr Cardiol.2009；30:306-310.

4.Casazza F,Morpurgo M.The varying evolution of Friedreich's ataxiacardiomyopathy.Am J Cardiol.1996；77:895-898.

5.Lynch DR,Regner SR,Schadt KA,Friedman LS,Lin KY,St John SuttonMG.Management and therapy for cardiomyopathy in Friedreich's ataxia.ExpertRev Cardiovasc Ther.2012；1 0:767-777.

6.Weidemann F,Liu D,Hu K,Florescu C,Niemann M,Herrmann S,Kramer B,Klebe S,Doppler K,Uceyler N,Ritter CO,Ertl G,Stork S.The cardiomyopathy inFriedreich's ataxia-new biomarker for staging cardiac involvement.Int JCardiol.2015；1 94:50-57.

7.Tsou AY,Paulsen EK,Lagedrost SJ,Perlman SL,Mathews KD,Wilmot GR,Ravina B,Koeppen AH,Lynch DR.Mortality in Friedreich ataxia.J Neurol Sci.2011；307:46-49.

8.Rajagopalan B,Francis JM,Cooke F,Korlipara LV,Blamire AM,SchapiraAH,Madan J,Neubauer S,Cooper JM.Analysis of the factors influencing thecardiac phenotype in Friedreich's ataxia.Mov Disord.2010；25:846-852.

9.Payne RM,Pride PM,Babbey CM.Cardiomyopathy of Friedreich's ataxia:Use of mouse models to understand human disease and guide therapeuticdevelopment.Pediatr Cardiol.2011；32:366-378.

10.Durr A,Cossee M,Agid Y,Campuzano V,Mignard C,Penet C,Mandel JL,Brice A,Koenig M.Clinical and genetic abnormalities in patients withFriedreich's ataxia.N Engl J Med.1996；335:1 169-1 175.

11.Filla A,De Michele G,Cavalcanti F,Pianese L,Monticelli A,Campanella G,Cocozza S.The relationship between trinucleotide(gaa)repeatlength and clinical features in Friedreich ataxia.Am J Hum Genet.1996；59:554-560.

12.Isnard R,Kalotka H,Durr A,Cossee M,Schmitt M,Pousset F,Thomas D,Brice A,Koenig M,Komajda M.Correlation between left ventricular hypertrophyand gaa trinucleotide repeat length in Friedreich's ataxia.Circulation.1997；95:2247-2249.

13.Puccio H,Simon D,Cossee M,Criqui-Filipe P,Tiziano F,Melki J,Hindelang C,Matyas R,Rustin P,Koenig M.Mouse models for Friedreich ataxiaexhibit cardiomyopathy,sensory nerve defect and fe-s enzyme deficiencyfollowed by intramitochondrial iron deposits.Nat Genet.2001；27:181-186.

14.Al-Mahdawi S,Pinto RM,Varshney D,Lawrence L,Lowrie MB,Hughes S,Webster Z,Blake J,Cooper JM,King R,Pook MA.Gaa repeat expansion mutationmouse models of Friedreich ataxia exhibit oxidative stress leading toprogressive neuronal and cardiac pathology.Genomics.2006；88:580-590.

15.Miranda CJ,Santos MM,Ohshima K,Smith J,Li L,Bunting M,Cossee M,Koenig M,Sequeiros J,Kaplan J,Pandolfo M.Frataxin knockin mouse.FEBSLett.2002；512:291-297.

16.Hick A,Wattenhofer-Donze M,Chintawar S,Tropel P,Simard JP,VaucampsN,Gall D,Lambot L,Andre C,Reutenauer L,Rai M,Teletin M,Messaddeq N,SchiffmannSN,Viville S,Pearson CE,Pandolfo M,Puccio H.Neurons and cardiomyocytesderived from induced pluripotent stem cells as a model for mitochondrialdefects in Friedreich's ataxia.Dis Model Mech.2013；6:608-621.

17.Lee YK,Ho PW,Schick R,Lau YM,Lai WH,Zhou T,Li Y,Ng KM,Ho SL,Esteban MA,Binah O,Tse HF,Siu CW.Modeling of Friedreich ataxia-related ironoverloading cardiomyopathy using patient-specific-induced pluripotent stemcells.Pflugers Arch.2014；466:1831-1844.

18.Lee YK,Lau YM,Ng KM,Lai WH,Ho SL,Tse HF,Siu CW,Ho PW.Efficientattenuation of Friedreich's ataxia(frda)cardiomyopathy by modulation of ironhomeostasis-human induced pluripotent stem cell(hipsc)as a drug screeningplatform for frda.Int J Cardiol.2016；203:964-971.

19.Wang J,Chen A,Lieu DK,Karakikes i,Chen G,Keung W,Chan CW,HajjarRJ,Costa KD,Khine M,Li RA.Effect of engineered anisotropy on thesusceptibility of human pluripotent stem cell-derived ventricularcardiomyocytes to arrhythmias.Biomaterials.2013；34:8878-8886.

20.Shum AM,Che H,Wong AO,Zhang C,Wu H,Chan CW,Costa K,Khine M,KongCW,

Li RA.A micropatterned human pluripotent stem cell-based ventricularcardiac anisotropic sheet for visualizing drug-induced arrhythmogenicity.AdvMater.2017；29.

21.Chen A,Lieu DK,Freschauf L,Lew V,Sharma H,Wang J,Nguyen D,Karakikes i,Hajjar RJ,Gopinathan A,Botvinick E,Fowles CC,Li RA,KhineM.Shrink-film configurable multiscale wrinkles for functional alignment ofhuman embryonic stem cells and their cardiac derivatives.Adv.Mater.Weinheim2011；23:5785-5791.

22.Luna J,Ciriza J,Garcia-Ojeda M,Kong M,Herren A,Lieu D,Li R,FowlkesC,Khine,M,McCloskey K.Multiscale Biomimetic Topography for the Alignment ofNeonatal and Embryonic Stem Cell-Derived Heart Cells.Tissue Eng Part CMethods.2011；17:579-588.

23.Turnbull IC,Karakikes 1,Serrao GW,Backeris P,Lee J-JJ,Xie C,SenyeiG,Gordon RE,Li RA,Akar FG,Hajjar RJ,Hulot J-S,Costa KD.Advancing functionalengineered cardiac tissues toward a preclinical model of humanmyocardium.FASEB J.2014；28:644-654.

24.Cashman TJ,Josowitz R,Gelb BD,Li RA,Dubois NC,CostaKD.Construction of defined human engineered cardiac tissues to studymechanisms of cardiac cell therapy.J Vis Exp.2016:e53447.

25.Weng Z,Kong C-W,Ren L,Karakikes I,Geng L,He J,Chow MZ,Mok CF,KeungW,Chow H,Leung AY,Hajjar RJ,Li RA,Chan CW.A simple,cost-effective but highlyefficient system for deriving ventricular cardiomyocytes from humanpluripotent stem cells.Stem Cells Dev.2014；23:1704-1716.

26.Goffart S,von Kleist-Retzow JC,Wiesner RJ.Regulation ofmitochondrial proliferation in the heart:Power-plant failure contributes tocardiac failure in hypertrophy.Cardiovasc Res.2004；64:198-207.

27.Ramirez RL,Becker AB,Mazurkiewicz JE,Feustel PJ,Gelman BB,KoeppenAH.Pathology of intercalated discs in Friedreich cardiomyopathy.J Am CollCardiol.2015；66:17391740.

28.Edenharter O,Clement J,Schneuwly S,Navarro JA.Overexpression ofDrosophilafrataxin triggers cell death in an iron-dependent manner.JNeurogenet.2017；31:189-202.

29.Lopaschuk GD,Jaswal JS.Energy metabolic phenotype of thecardiomyocyte duringdevelopment,differentiation,and postnatal maturation.JCardiovasc Pharmacol.2010；56:130-140.

30.Keung,W.,Ren,L.,Sen Li,Wong,A.O.,Chopra,A.,Kong,C.W.,TomaselliG.F.,Chen,C.S.,Li,R.A.Non-cell autonomous cues for enhanced functionality ofhuman embryonic stem cell-derived cardiomyocytes via maturation ofsarcolemmal and mitochondrial K(ATP)channels.Sci Rep.6,34154(2016).

31.Poon,E.,Keung,W.,Liang,Y.,Ramalingam,R.,Yan,B.,Zhang,S.,Chopra,A.,Moore,J.,Herren,A.,Lieu,D.K.,Wong,H.S.,Weng,Z.,Wong,O.T.,Lam,Y.W.,Tomaselli,G.F.,Chen,C.,Boheler,K.R.&Li,R.A.Proteomic Analysis of Human Pluripotent StemCell-Derived,Fetal,and Adult Ventricular Cardiomyocytes Reveals PathwaysCrucial for Cardiac Metabolism and Maturation.Circ Cardiovasc Genet 8,427-436(2015).

32.Zhang,S.,Poon,E.,Xie,D.,Boheler,K.R.,Li,R.A.,Wong,H.S.Consensuscomparative analysis of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.PLoSOne.10,e0125442(2015).

33.Karakikes I.,Stillitano F.,Nonnenmacher M.,Tzimas C.,Sanoudou D.,Termglinchan V.,

Kong C.W.,Rushing S.,Hansen J.,Ceholski D.,Kolokathis F.,KremastinosD.,Katoulis A.,

Ren L,Cohen N.,Gho J.M.,Tsiapras D.,Vink A.,Wu J.C.,Asselbergs F.W.,LiR.A.,HulotJ.S.,Kranias E.G.,Hajjar R.J.Correction of human phospholambanR14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases andcombination therapy.Nat Commun.6,6955(2015).

34.Chen,G.,Li,S.,Karakikes,I.,Ren,L.,Chow,M.Z.,Chopra,A.,Keung,W.,Yan,B.,Chan,C.W.,Costa,K.D.,Kong,C.W.,Hajjar,R.J.,Chen,C.S.,Li,R.A.Phospholamban as a crucial determinant of the inotropic response of humanpluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes and engineered 3-dimensional tissue constructs.Circ Arrthyhm Electrophysiol.8,193-201(2015).

35.Weng,Z.,Kong,C.-W.,Ren,L.,Karakikes,L,Geng,L.,He,J.,Chow,M.Z.Y.,Mok,C.F.,Chan,H.Y.S.,Webb,S.E.,Keung,W.,Chow,H.,Miller,A.L.,Leung,A.Y.H.,Hajjar,R.J.,Li,R.A.&Chan,C.W.A Simple,Cost-Effective but Highly EfficientSystem for Deriving Ventricular Cardiomyocytes from Human Pluripotent StemCells.Stem Cells Dev.23,17041716(2014).

36.Karakikes,L,Senyel,G.D.,Hansen,J.,Kong,C.-W.,Azeloglu,E.U.,Stillitano,F.,Lieu,D.K.,Wang,J.,Ren,L.,Hulot,J.-S.,Iyengar,R.,Li,R.A.&Hajjar,R.j.Small Molecule-Mediated Directed Differentiation of Human Embryonic StemCells Toward Ventricular Cardiomyocytes.Stem Cells Transl.Med.3,18-31(2014).

37.Li,S.,Cheng,H.,Tomaselli,G.F.,Li,R.A.Mechanistic basis ofexcitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derivedventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+spark characteristics:directevidence of functional Ca2+-induced Ca2+release.Heart Rhythm.11,133-140(2014).

38.Poon,E.,Yan,B.,Zhang,S.,Rushing,S.,Keung,W.,Ren,L.,Lieu,D.K.,Geng,L.,Kong,C.W.,Wang,J.,Wong H.S.,Boheler,K.R.,Li,R.A.Transcriptom e-guidedfunctional analyses reveal novel biological properties and regulatoryhierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytescrucial for maturation.PLoS One.8,e77784(2013).

39.Chow,M.Z.,Geng,L.,Kong,C.W.,Keung,W.,Fung,J.C.,Boheler,K.R.,Li,R.A.Epigenetic regulation of the electrophysiological phenotype of humanembryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes:insights for drivenmaturation and hypertrophic growth.

Stem Cells Dev.22,2678-2690(2013).

40.Lieu,D.K.,Fu,J.D.,Chiamvimonvat,N.,Tung,K.C.,McNerney,G.P.,Huser,T.,Keller,G.,Kong,C.W.,Li,R.A.Mechanism-based facilitated maturation of humanpluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.Circ Arrhythm Electrophysiol.6,191-201(2013).

41.Fu,J.D.,Rushing,S.N.,Lieu,D.K.,Chan,C.W.,Kong,C.W.,Geng,L.,Wilson,K.D.,Chiamvimonvat,N.,Boheler,K.R.,Wu,J.C.,Keller,G.,Hajjar,R.J.,Li,R.A.Distinct roles of microRNA-1 and-499 in ventricular specification andfunctional maturation of human embryonic stem cell-derivedcardiomyocytes.PLoS One.6,e2741 7(2011).

42.Wilson,K.D.,Hu,S.,Venkatasubrahmanyam,S.,Fu,J.D.,Sun,N.,Abilez,O.J.,Baugh,J.J.,Jia,F.,Ghosh,Z.,Li,R.A.,Butte,A.J.,Wu,J.C.Dynamic microRNAexpression programs during cardiac differentiation of human embryonic stemcells:role for miR-499.Circ Cardiovasc Genet.3,426-435(2010).

43.Fu,J.D.,Jiang,P.,Rushing,S.,Liu,J.,Chiamvimonvat,N.,Li,R.A.Na+/Ca2+exchanger is a determinant of excitation-contraction coupling in humanembryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes.Stem Cells Dev.19,773-782(2010).

44.Liu,J.,Lieu,D.K.,Siu,C.W.,Fu,J.D.,Tse,H.F.,Li,R.A.Facilitatedmaturation of Ca2+handling properties of human embryonic stem cell-derivedcardiomyocytes by calsequestrin expression.Am J Physiol Cell Physiol.297,C152-159(2009).

45.Lieu,D.K.,Liu,J.,Siu,C.W.,McNerney,G.P.,Tse,H.F.,Abu-Khalil,A.,Huser,T.,Li,R.A.Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+)wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derivedcardiomyocytes.Stem Cells Dev.18,1493-1500(2009).

46.Chan,J.W.,Lieu,D.K.,Huser,T.,Li,R.A.Label-free separation of humanembryonic stem cells and their cardiac derivatives using Ramanspectroscopy.Anal Cham.81,1324-1331(2009).

47.Liu J.,Fu J.D.,Siu C.W.,Li R.A.Functional sarcoplasmic reticulumfor calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes:insights for driven maturation.Stem Cells.12,3038-44(2007).

48.Wang K.,Xue T.,Tsang S.Y.,Van Huizen R.,Wong C.W.,Lai K.W.,YeZ.,Cheng L.,Au K.W.,Zhang J.,LiG.R.,Lau C.P.,Tse H.F.,LiR.A.Electrophysiological properties of pluripotent human and mouse embryonicstem cells.Stem Cells.10,1526-34(2005)

49.Li,R.A.,et al.,Bioengineering an electro-mechanically functionalminiature ventricular heart chamber from human pluripotent stemcells.Biomaterials,2018.163:p.116-127.

50.Weng,Z.,et al.,A simple,cost-effective but highly efficient systemfor derivingventricular cardiomyocytes from human pluripotent stem cells.StemCells Dev,2014.23(14):p.1704-16.

从引用的上下文中显而易见的是，在此引用的每个参考文献都以全文或相关部分引用的方式并入本文中。

应理解，尽管所要求保护的主题已经结合其详细描述加以描述，但是前面的描述旨在说明而不是限制由所附权利要求的范围限定的所要求保护的主题的范围。其他方面、优点和修改在所附权利要求书的范围内。