基于网络药理学分析茯苓聚糖抗腺性膀胱炎作用机制方法

摘要

本发明属于生物医学领域，公开了一种基于网络药理学分析茯苓聚糖抗腺性膀胱炎作用机制的方法并首次报道了茯苓聚糖防治腺性膀胱炎的详细靶点和具体药理机制。包括以下要点：通过TCMSP、DisGeNET等在线数据库分析获得茯苓聚糖药理靶点及腺性膀胱炎病原靶点；将茯苓聚糖和腺性膀胱炎靶点取交集得到药物‑疾病交集靶基因靶点并构建相关蛋白互作网络筛选核心靶点；进一步利用R语言相关包对核心靶点进行基因本体GO生物过程和KEGG通路富集分析；最后构建药物‑靶点‑基因本体功能‑通路‑疾病可视化图进行治疗机制的深入解析。本发明方法为阐释茯苓聚糖发挥抗腺性膀胱炎研究机制提供了新思路，同时为茯苓聚糖用于腺性膀胱炎的临床应用提供了前期研究基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种基于网络药理学分析茯苓聚糖抗腺性膀胱炎作用机制的方法。

背景技术

腺性膀胱炎(Cystitis glandularis，GC)通常是指膀胱及其腺体出现病变和炎症反应[1]。在临床观察中，患者可发现有血尿、结石、尿道疼痛等病理特征[2]。目前腺性膀胱炎的发病机制未知，由此引起的感染性膀胱损伤和继发性炎症是该疾病进一步恶化的主要原因[3]。临床对早期腺性膀胱炎患者的确诊尚有缺陷，同时生化诊断方面对该疾病的精确筛查也仍然不足[4]。此外，用于治疗腺性膀胱炎的方案有限，常用抗感染、消炎等药物进行膀胱灌注治疗[5]，但常伴随一些如过敏反应、胃肠道反应和耐药性等不良反应[6]。因此，急需开发一种有效的新型抗腺性膀胱炎的生物活性成分用于未来的临床治疗。

茯苓作为一种常见真菌，在我国自古以来一直被用作药用食品[7]。值得注意的是，这种药用真菌具有潜在的抗菌、免疫激活作用[8]。茯苓聚糖(Pachyman)，也称为茯苓多糖，是茯苓的主要活性成分，其在癌症的辅助治疗中具有一定的药理活性，因此有研究认为茯苓聚糖可增强机体免疫力[9]。相关研究显示，茯苓聚糖也可以通过抑制肝脏的炎症应激反应来发挥强大的药理作用，从而减轻小鼠的药物性肝脏损伤[10-11]。

网络药理学是近年发展起来的一种可用于筛选候选基因或靶点来研究相关疾病功能和药物治疗机制的应用工具[12-13]。网络药理学优点在于突破了传统“单药物，单靶点”药物研发模式的瓶颈，提供了全新的“多药物，多靶点”互作关系的药物开发新模式和新思路，改进了当前药物研究策略，加速了药物发现进程。目前关于茯苓聚糖抗腺性膀胱炎机制尚未见报道。

综上，本发明借鉴网络药理方法进行天然活性成分研发，确定了茯苓聚糖治疗腺性膀胱炎作用机制的相关基因，以期基于此靶点来研究茯苓聚糖抗腺性膀胱炎的功能和药理作用机制，为抗腺性膀胱炎药物的开发提供重要的指导和依据。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于网络药理学分析茯苓聚糖抗腺性膀胱炎作用机制的方法。通过结合多个网络药理学数据库，进行大数据分析，在腺性膀胱炎背景下对可能具有潜在治疗功能的茯苓聚糖靶点进行全面筛查，发现了之前在腺性膀胱炎中未被研究的ALB、VEGFA、TNF、EGF、HRAS、ACE、MMP9、STAT3、ABCB1、LGALS3共十个靶点，并预测了茯苓聚糖在腺性膀胱炎发生发展中具有的调控潜力。

本发明的技术方案如下：

一种基于网络药理学分析茯苓聚糖抗腺性膀胱炎作用机制的方法步骤：

S1、活性成分作用靶点筛选

根据研究目标，设定筛选标准。运用在线数据库(TCMSP、Swiss TargetPrediction、BATMAN和HITPICK)筛选茯苓聚糖作用靶点。

S2、疾病候选靶点识别

在疾病靶标数据库(DisGeNET、Genecard和Malacard)中，以“Cystitisglandularis”作为关键词检索查找腺性膀胱炎候选靶点。然后与S1所得的成分作用靶点进行交集映射，获得成分-疾病交集靶基因，即茯苓聚糖抗腺性膀胱炎的作用靶点。

S3、构建成分靶点-疾病靶点网络及筛选核心靶点

采用STRING数据库分析S2的交集靶点，得到靶点蛋白互作网络关系图(PPI网络)及tsv.数据。运用Cytoscape3.7.1软件分析网络节点的拓扑结构特征参数，确定核心靶点筛选条件并进行后续筛选分析。

S4、对核心靶点富集分析以探讨药物成分作用机制

利用R语言相关包对核心靶点进行GO生物过程和KEGG通路注释富集分析，输出相应图表，对照解析茯苓聚糖抗腺性膀胱炎的作用机制。

S5、“成分-靶点-通路-疾病”网络构建与可视化

运用Cytoscape根据S4结果构建“药物-靶点-通路-疾病”可视化图形；具体应用R语言中“pathview”包将KEGG富集通路的相关靶点映射到通路图，便于进行后续分析。

所述的方法，S1中BATMAN数据库筛选范围为score cutoff>20，P<0.05。

所述的方法，S3中核心靶点筛选范围上限为拓扑数据中的最大Degree值，下限为Degree中位数。

本发明的有益效果体现在：

(1)利用网络药理学技术首次构建了茯苓聚糖抗腺性膀胱炎的“药物成分—靶点—疾病”网络图，揭示了活性成分茯苓聚糖如何通过“多靶点、多通路、多途径”联合调控发挥其药效。结果：茯苓聚糖是通过ALB、VEGFA、TNF等10个相关疾病靶点，调控相关炎症分子信号通路发挥抗腺性膀胱炎作用。本发明方法为阐释茯苓聚糖发挥抗腺性膀胱炎作用研究机制提供了新思路，这些系统生物学信息将在未来的研究中得到验证，进一步为茯苓聚糖用于腺性膀胱炎的防治提供了前期研究基础。

(2)本发明将药物作用疾病的研究方法网络化、系统化，与传统研究方法相比，将研发范围缩小化，研发目的精确化从而节省了药物研发费用。同时大幅度提高了药物筛选和预测的效率，这给茯苓聚糖等其他天然活性成分研发提供了新参考，对我国丰富中药资源的开发与产业化具有突破性意义。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1为茯苓聚糖-腺性膀胱炎交集靶点Venn图

图2为茯苓聚糖抗腺性膀胱炎靶点蛋白PPI图。其中：圆形代表靶点蛋白，边为相互作用关系。

图3为茯苓聚糖-腺性膀胱炎核心靶点图

图4为茯苓聚糖抗腺性膀胱炎GO生物过程气泡图

图5为茯苓聚糖抗腺性膀胱炎GO生物过程柱状图

图6为茯苓聚糖抗腺性膀胱炎KEGG通路富集气泡图

图7为茯苓聚糖抗腺性膀胱炎KEGG通路富集柱状图

图8为茯苓聚糖-靶点-GO-KEGG-腺性膀胱炎网络关系图

图9为茯苓聚糖抗腺性膀胱炎研究步骤流程图

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更清晰明了，下面将通过具体实施例结合附图表对本发明进一步说明与描述。

1、基于网络药理学分析茯苓聚糖抗腺性膀胱炎作用机制的方法

1.1茯苓聚糖作用靶点筛选

以“pachyman”为关键词于TCMSP数据库搜索，得到茯苓聚糖结构式。Swiss TargetPrediction、HITPICK数据库及BATMAN数据库分别输入结构式相应的SMILE编码和IMCHI编码查找茯苓聚糖作用靶点。其中SMILE编码和IMCHI编码经ChemDraw软件转换所得，BATMAN数据库靶点筛选范围为score cutoff>20、P<0.05。一共应用了4个数据库(TCMSP、SwissTarget Prediction、BATMAN、HITPICK数据库)对茯苓聚糖的作用靶点进行全面筛查。去除重复靶点后，经蛋白质数据库Uniprot校验得到最终符合条件的茯苓聚糖靶点。

1.2腺性膀胱炎候选靶点识别

以“Cystitis glandularis”为关键词，应用DisGeNET数据库、Genecard数据库和Malacard数据库查相关疾病靶点，其中Genecard数据库筛选条件为：Relevance score>1。然后，将疾病靶点与1.1所得的茯苓聚糖靶点用生物在线工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)进行Venn图映射交集处理，获得茯苓聚糖-腺性膀胱炎交集靶基因。

1.3构建茯苓聚糖靶点-腺性膀胱炎靶点网络及筛选核心靶点

将1.2交集靶基因上传到STRING数据库，在Multiple Proteins项下检索Organism:Homo sapiens，分析页面中设定minimum required interaction score:0.400，得到靶点蛋白互作网络及tsv.数据。同时在Cytoscape软件中的NetworkAnalyzer模块分析互作网络中所有节点的拓扑参数，选取节点连接度(degree)、自由度中位数作为核心靶点的筛选条件，筛选范围上限为拓扑数据中的最大Degree值，下限为Degree中位数，符合条件的核心靶点将进行下一步分析。

1.4对核心靶点富集分析以探讨药物成分作用机制

应用R语言的“ClusterProfiler”、“ReactomePA”、“AnnotationHub”等相关R包对1.3的核心靶点进行基因本体GO生物过程和KEGG通路富集注释分析，输出其相应的气泡图和柱状图，预测靶点的功能分布，并根据富集因子分析核心通路富集程度，得到关键核心靶点参与的关键通路信息，从而解析茯苓聚糖抗腺性膀胱炎的作用机制。

1.5构建网络关系可视化图形

为了更加直观反映药物、靶点、通路与疾病之间的关系，运用Cytoscape软件将药物与靶点、疾病与靶点、核心靶点与关键富集通路的互作关系连接，建立起“药物-靶点-基因本体功能-通路-疾病”关系网络，并对网络图进行可视化展示。

2、结果及讨论

2.1茯苓聚糖作用靶点筛选

通过TCMSP、Swiss Target Prediction等数据库检索茯苓聚糖作用靶点，经重复筛除及矫正得到166个茯苓聚糖靶点。具体见表1。

表1茯苓聚糖部分作用靶点信息

Tab.1 Part of targets information for pachyman

2.2腺性膀胱炎候选靶点识别

通过DisGeNET、Genecar和Malacard数据库共收集到303个腺性膀胱炎相关基因，通过生信在线工具映射处理得到成分-疾病交集靶点20个，见图1。

2.3构建茯苓聚糖靶点-腺性膀胱炎靶点网络及筛选核心靶点

应用STRING数据库构建茯苓聚糖治疗腺性膀胱炎靶点及其功能相关蛋白相互作用网络，结果见图2。Cytoscape软件导入交集靶点，计算茯苓聚糖-腺性膀胱炎靶点及功能相关蛋白互作网络的拓扑参数，可得靶点Degree中位数为8.4，最大Degree为18，因此将核心靶点筛选条件范围设为9～18，最终获得10个核心靶点，分别为ALB、VEGFA、TNF、EGF、HRAS、ACE、MMP9、STAT3、ABCB1、LGALS3。具体表2和图3。

表2茯苓聚糖-腺性膀胱炎核心靶点信息

Tab.2 The hub biotargets of information for pachyman against Cystitisglandularis

2.4对核心靶点富集分析以探讨药物成分作用机制

2.4.1 GO生物过程分析

为进一步明确核心靶点生物学过程，通过R语言相关包对10个核心靶点进行基因本体GO富集分析，根据P-Value值列出前10条富集通路见表3，具体详细生物学过程富集结果见图4、图5。

表3关键靶点的GO生物过程富集分析结果

Table3 GO biological process of hub targets enrichment analyses

如表3所示，茯苓聚糖抗腺性膀胱炎涉及多条相关生物过程，包括regulation ofpeptidyl-tyrosine phosphorylation(调控肽基酪氨酸磷酸化)、positive regulationof peptidyl-tyrosine phosphorylation(正调节肽基酪氨酸磷酸化)、myeloid celldifferentiation(髓系细胞分化)、negative regulation of hydrolase activity(水解酶活性的负调控)、positive regulation of MAP kinase activity(MAP激酶活性的正调)等。

2.4.2KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析提示共66条相关信息通路与茯苓聚糖抗腺性膀胱炎核心靶点有关，根据P-Value值，可知其中有10条通路相关性较高，见表4，更多详细通路见图6、图7。

表4关键靶点的KEGG通路富集分析结果

Table4 KEGG pathway of hub targets enrichment analyses

如表4所示，核心靶点所涉及到的其他疾病通路包括Bladder cancer(膀胱癌)、EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance(表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药)、Proteoglycans in cancer(癌症时蛋白聚糖变化)、AGE-RAGE signaling pathway indiabetic complications(糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路变化)、MicroRNAs incancer(癌症中微RNA变化)、Hepatitis C(丙型肝炎)、Hepatitis B(乙型肝炎)、Non-smallcell lung cancer(非小细胞癌)、Pancreatic cancer(胰腺癌)、Human cytomegalovirusinfection(人巨细胞病毒感染)等。

2.5构建网络关系可视化图形

分析实验数据后进行“茯苓聚糖-靶点-GO-KEGG-腺性膀胱炎”网络可视化，结果见图8，该图由52个“节点”(1个活性成分茯苓聚糖，1个腺性膀胱炎疾病，10个核心靶点，20个GO生物过程及20个KEGG相关通路)和多条“边”构成：Pachyman为茯苓聚糖，Cystitisglandualris为腺性膀胱炎，中间环的三角形为核心靶点，左侧20个长方形为GO生物过程，右侧20个长方形为KEGG相关通路，边代表药物-靶点-基因本体功能-通路-疾病间的相互作用关系。茯苓聚糖及腺性膀胱炎分别对应10个靶点，每个靶点又联系多个生物过程和通路，体现了茯苓聚糖通过多靶点发挥抗腺性膀胱炎作用机理，同时各个独立生物过程和通路又通过共有靶点连接成网络，进一步说明茯苓聚糖是依赖多个通路而协同发挥抗腺性膀胱炎作用的。

3、讨论

本发明利用网络药理学生物信息技术结合实验数据，分别解析了活性成分-疾病的候选靶点、生物学功能以及分子作用途径，最终确定了茯苓聚糖抗腺性膀胱炎的主要核心靶标，包括ALB，VEGFA，TNF，EGF，HRAS，ACE，MMP9，STAT3，ABCB1和LGALS3共10个靶点。据报道，VEGFA是一种跨膜糖蛋白，当受细胞外界刺激时，可以激活一些关键信号级联反应，如MAPK信号通路[14]。此外，反式激活VEGFA可能会引发应激性炎症[15]。促炎症家族TNF，例如TNF-α和IL-1β，可参与由肺炎球菌性脑膜炎诱导的脑内炎症[16]。表皮生长因子EGF是一种功能性激素，能够促进表皮和上皮组织以及一些成纤维细胞的增殖[17]。STAT3是一种核磷酸化蛋白，其功能与组织中细胞增殖分化的特定基因表达调节有关。此外还常作为DNA损伤传感器，用于识别基因毒性应激和细胞坏死[18-19]。ABCB1本质是一种半胱氨酸蛋白酶，可介导TNF信号通路而诱导激活细胞凋亡相关蛋白酶[20-21]。目前为止，还没有关于ALB、HRAS、ACE、ABCB1、LGALS3与腺性膀胱炎之间关系的相关报道。本发明在生物信息学数据和富集分析的共同作用下，揭示了茯苓聚糖抗腺性膀胱炎所涉及到的基因靶点、生物过程和药理学途径，其特点是对细胞坏死和炎症相关的信号通路具有特异性抑制作用。

4、结论

综上所述，网络药理学技术可用于研究茯苓聚糖抗腺性膀胱炎的候选及核心靶点、生物学过程、分子作用机制。本发明首次揭示了茯苓聚糖抗腺性膀胱炎的核心靶点，包括一些抗腺性膀胱炎的新靶点：ALB、HRAS、ACE、ABCB1、LGALS3。

应理解以上具体实施例仅是对本发明的技术方案及核心原理的理解，并不是对本发明范围的限制。对于本领域技术人员，依据本发明的核心原理，可对本实施例各条件和参数根据需要而变动，但这些等价变化与修饰，仍均属于本发明的保护范围。

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