用于确定日本血吸虫个体基因型的多重PCR引物组合、试剂盒及方法

摘要

本发明涉及一种用于确定日本血吸虫个体基因型的多重PCR引物组合、试剂盒及方法，根据血吸虫的基因序列设计7对引物，并基于该7对引物建立了多重PCR反应体系，可实现对日本血吸虫个体进行基因分型。本发明的多重PCR反应体系经过实验内反复实验优化，具有扩增效果好、效率高的特点，并且，所选用的7个微卫星位点多态性高，利于对个体进行基因分型。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于确定日本血吸虫个体基因型的多重PCR引物组合、试剂盒及方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

血吸虫病是一种严重危害人类健康的重大感染病，被世界卫生组织列为20种被忽视的热带病之一。目前，全球共有78个国家和地区流行血吸虫病，感染者超过2亿，近8亿人口面临感染威胁。我国流行日本血吸虫病，目前有数十个流行县尚未达到传播阻断标准，因此研究血吸虫病流行态势及血吸虫进化趋势具有重要意义。日本血吸虫全基因组测序已提供了完整(V2版)DNA序列，大量具有短串联重复序列的微卫星位点(简写STR)已被筛选。微卫星由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，其重复单位的重复次数在个体间呈高度变异。这种变异产生的主要机制是DNA复制过程中产生了链滑动或DNA复制或修复时发生了错配，从而导致一个或几个重复单位的插入或缺失等。以微卫星位点为研究对象，根据其侧翼序列在其两侧设计一对互补引物，根据微卫星长度的多态性可对个体进行基因分型。其方法具有简便快速、DNA用量少，重复性高、稳定性好、可测算杂合度等优点，已应用于血吸虫种群遗传学研究。

但是常用的单重PCR反应，即一次扩增一个微卫星位点，效率低、成本高，且易增加实验操作错误。因此，一次扩增多个微卫星位点即采用多重PCR反应，将极大提高效率、降低成本，尤其是大大降低实验室工作量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于确定日本血吸虫个体基因型的多重PCR引物组合、试剂盒及方法，有利于开展血吸虫种群遗传学研究，极大提高了检测效率、降低了分析成本，利于推广。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于用于确定日本血吸虫个体基因型的多重PCR引物组合，所述引物组合包括：

Sjp4-F:ACAAGCTCCAATCGTCTCTGA；

Sjp4-R:GAATACTGCCGCCCTTGTAA；

Sjp18-F:TCCTTTATCTGGGCTGTGGA；

Sjp18-R:TTTCAGCAGGATAACATGACG；

Sjp22-F:CAAAGCCTAAACGTCATAGACAG；

Sjp22-R:CAACCACCGATAAGTAGAGTGGA；

Sjp42-F:GCTGCAGCTTCTGTGTAGTAA；

Sjp42-R:GTCTTGCTCAGATCAGTTCGT；

Sjp58-F:TCCCAGTACCAATGTAGATGTG；

Sjp58-R:CTAATAAAGTCGTCAAGGAGCA；

Sjp60-F:CGATTCATTCATAGCCTGACT；

Sjp60-R:GAATCCCATCACAGATTAACG；

TS2-F:TTGTCAATAATTTCACTAGGTTCAC；

TS2-R:AATTAATAATTCACAAGTAAAACATCTAAGT。

本发明还提供一种含有所述的用于确定日本血吸虫个体基因型的多重PCR引物组合的用于扩增日本血吸虫多位点序列的试剂盒。

进一步地，所述试剂盒基于Qiagen MM，包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg

本发明还提供一种确定日本血吸虫个体基因型的多重PCR方法，其利用所述的用于确定日本血吸虫个体基因型的多重PCR引物组合来对日本血吸虫个体进行基因分型。

进一步地，所述确定日本血吸虫个体基因型的多重PCR方法包括以下步骤：

S1、提取目标DNA；

S2、以所述目标DNA为模板，采用所述引物组合进行多重PCR扩增反应；

S3、分析扩增产物。

进一步地，多重PCR反应体系以15μL计为：

Sjp4-F:0.015μL；Sjp4-R:0.015μL；Sjp18-F:0.06μL；Sjp18-R:0.06μL；Sjp22-F:0.015μL；Sjp22-R:0.015μL；Sjp42-F:0.0375μL；Sjp42-R:0.0375μL；Sjp58-F:0.06μL；Sjp58-R:0.06μL；Sjp60-F:0.03μL；Sjp60-R:0.03μL；TS2-F:0.0375μL；TS2-R:0.0375μL；PCR MM：7.5μL；ddH

进一步地，多重PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57-51℃退火90s，每次递减2℃，72℃延伸1.5min，共20个循环，然后50℃保持20个循环；最后68℃延伸10min。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本申请的用于确定日本血吸虫个体基因型的多重PCR引物组合、试剂盒及方法，根据血吸虫的基因序列设计7对引物，并基于该7对引物建立了多重PCR反应体系，可实现对日本血吸虫进行个体基因分型。本多重PCR反应体系经过实验内反复实验优化，具有扩增效果好、效率高的特点，并且，所选用的7个微卫星位点多态性高，利于对血吸虫个体进行基因分型。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明的多重PCR反应体系可以同时扩增7个日本血吸虫微卫星位点，根据各位点等位基因阈值可确定等位基因大小。该7个微卫星位点，包括：

Sjp4(GenBank:EU262607)，Sjp18(GenBank:AB604199)，

Sjp22(GenBank:AB604201)，Sjp42(GenBank:AB604209)，

Sjp58(GenBank:AB604214)，Sjp60(GenBank:AB604215)，

TS2(GenBank:AF244896)。

一、设计引物组合

根据GenBank公布的7个基因序列，设计合成7对引物，该7对引物组合的序列分别为：

Sjp4-F:ACAAGCTCCAATCGTCTCTGA(SEQ ID NO.1)；

Sjp4-R:GAATACTGCCGCCCTTGTAA(SEQ ID NO.2)；

Sjp18-F:TCCTTTATCTGGGCTGTGGA(SEQ ID NO.3)；

Sjp18-R:TTTCAGCAGGATAACATGACG(SEQ ID NO.4)；

Sjp22-F:CAAAGCCTAAACGTCATAGACAG(SEQ ID NO.5)；

Sjp22-R:CAACCACCGATAAGTAGAGTGGA(SEQ ID NO.6)；

Sjp42-F:GCTGCAGCTTCTGTGTAGTAA(SEQ ID NO.7)；

Sjp42-R:GTCTTGCTCAGATCAGTTCGT(SEQ ID NO.8)；

Sjp58-F:TCCCAGTACCAATGTAGATGTG(SEQ ID NO.9)；

Sjp58-R:CTAATAAAGTCGTCAAGGAGCA(SEQ ID NO.10)；

Sjp60-F:CGATTCATTCATAGCCTGACT(SEQ ID NO.11)；

Sjp60-R:GAATCCCATCACAGATTAACG(SEQ ID NO.12)；

TS2-F:TTGTCAATAATTTCACTAGGTTCAC(SEQ ID NO.13)；

TS2-R:AATTAATAATTCACAAGTAAAACATCTAAGT(SEQ ID NO.14)。

该7对引物的荧光标志，分别为：Sjp4，HEX绿色；Sjp18，TAMAR黄色；Sjp22，HEX绿色；Sjp42，FAM蓝色；Sjp58，TAMAR黄色；Sjp60，TAMAR黄色；TS2，ROX红色。

二、多重PCR反应

在本实施例的多重PCR反应体系中，各引物浓度分别为：Sjp4，0.2μM；Sjp18，0.4μM；Sjp22，0.1μM；Sjp42，0.25μM；Sjp58，0.4μM；Sjp60，0.2μM；TS2，0.25μM。

具体方法如下：

1、DNA提取

根据说明书，采用DNA提取试剂盒提取日本血吸虫的基因组DNA。

2、多重PCR扩增

采用Sjp4-F、Sjp4-R、Sjp18-F、Sjp18-R、Sjp22-F、Sjp22-R、Sjp42-R、Sjp58-F、Sjp58-R、Sjp60-F、Sjp60-R、TS2-F和TS2-R共7对引物，以步骤1中提取的DNA为模板进行多重PCR扩增。

其中，一个反应体系15μl，包含各对引物、PCR MM、水和模板DNA，如下：

本实施例中，多重PCR反应热循环条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57-51℃退火90s，每次递减2℃，72℃延伸1.5min，共20个循环，然后50℃保持20个循环；最后68℃延伸10min。

发明人在对大量血吸虫标本进行扩增后，发现7个位点的各等位基因大小的阈值为：

提供以上7个位点的等位基因大小阈值，结合本申请的试剂盒和方法，有利于对血吸虫个体进行基因分型，并进行推广。

综上所述：本申请的用于确定日本血吸虫个体基因型的多重PCR引物组合、试剂盒及方法根据血吸虫的基因序列设计7对引物，并基于该7对引物建立了多重PCR反应体系以及等位基因阈值，可实现对日本血吸虫个体进行基因分型，进一步开展种群遗传学研究。本多重PCR反应体系经过实验内反复实验优化，具有扩增效果好、效率高的特点，并且，所选用的7个微卫星位点多态性高，利于个体基因分型。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 用于确定日本血吸虫个体基因型的多重PCR引物组合、试剂盒及方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

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acaagctcca atcgtctctg a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 2

gaatactgcc gcccttgtaa 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

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tcctttatct gggctgtgga 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

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tttcagcagg ataacatgac g 21

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<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 5

caaagcctaa acgtcataga cag 23

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 6

caaccaccga taagtagagt gga 23

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<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

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gctgcagctt ctgtgtagta a 21

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<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

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gtcttgctca gatcagttcg t 21

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<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

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tcccagtacc aatgtagatg tg 22

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cgattcattc atagcctgac t 21

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ttgtcaataa tttcactagg ttcac 25

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<212> DNA

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