一种用于鉴定桑树桑黄的培养基及其配置方法与应用

摘要

本发明公开了一种用于鉴定桑树桑黄的培养基及其配置方法与应用，属于生物技术领域。本发明所述鉴定桑树桑黄的培养基包括以下组分：蚕沙粉、KH2PO4、MgSO4、水，其质量比为41.25：0.3：0.15：58.3，培养基PH值为8.5‑8.8，然后121℃灭菌30min，制作成桑树桑黄鉴定培养基。只有真正的桑树桑黄菌丝，才能在桑树桑黄鉴定培养基中正常生长，而其他菌种均无法在桑树桑黄鉴定培养基中正常生长。将桑树桑黄菌种长期在上述鉴定培养基培养保存，5年内未发现桑树桑黄菌种有任何退化、变异等现象，无需复壮即可顺利诱导出桑树桑黄子实体。证明该培养基不仅可以鉴定真正的桑树桑黄，并且完全适合桑树桑黄菌种的长期保存。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定桑树桑黄的培养基的制作方法。

背景技术

桑黄(Sanghuangporus sanghuang)，是一种寄生于桑树(Morus L.)上的极为稀有的药用真菌。桑黄是目前国际上公认的抗癌效率最好的药用真菌之一

我国自汉代以来的历代医书中，均有对桑黄使用的记载。如汉代的《神农本草经》、魏晋时期陶弘景的《名医别录》、初唐时期甄权的《药性论》等

近二十年来，桑黄以其卓越的药用价值，越来越受到美日韩等国及国内研究人员的重视，而“桑黄”一词却被逐渐被滥用。有学者已经对桑黄做了一定的分类，明确真正的桑黄仅一种，并且在野外也确实只长在桑树树干

这些所谓的“桑黄”，基本可归为两类：一类是锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)的子实体，如：属于纤孔菌属的暴马丁香黄、忍冬黄、栎树黄、杨树黄等；另外一类是多孔菌科(Polyporaceae)的子实体，如：属于火木层孔菌的漆树黄、属于针层孔菌属的松树黄，及部分杂树黄等。

此前诸多文献中，将生长在非桑树上的黄色无柄蕈类，均冠以“桑黄”是不严谨的：诸多研究论文中，也往往也将上述两类黄色无柄蕈类误认为为桑树桑黄，极少能提供真正的桑树桑黄的生境图片。桑黄的分类也一度陷入混乱。直到2014年，有学者发现，桑黄是一个独立的新属

鉴于桑树桑黄卓越的药用价值及上述现状，亟需制定一种简单可行的鉴别桑树桑黄的方法，厘清什么才算是真正的桑黄，才能逐渐减少对“桑黄”二字的滥用，为桑黄这一非常重要的药用真菌正名，真正促进桑黄这一珍贵中药材的研究和应用，为推进我国中医药学做贡献。

桑树分布广泛，生存能力强，活体桑树不易被食用菌寄生；桑树富含乳胶，内含各种抑制糖苷酶生物活性的生物碱，是一种对大部分食草昆虫有毒性的防御性物质

蚕沙(Faeces bombycis)即为家蚕幼虫期食用桑叶后产生的粪便(蚕粪)，呈墨绿色，六棱型，有自然的清香味，是一味传统的中药，民间常用作婴儿头枕。蚕沙对微生物的功效具有双重性：一方面，与常规的培养食用菌菌种的PDA培养基相比，蚕沙中具备相似的糖类、脂肪、粗纤维、蛋白质、维生素和微量元素，从某种意义上讲,蚕沙的营养价值较苜蓿(干粉)、米糠和麦麸高，可以满足食用菌菌丝正常的生长需要

家蚕作为典型的完全变态的鳞翅目昆虫，从一龄发育至五龄，特别是五龄即将老熟上蔟前，体内器官发生剧烈的变化，所排出的粪便(蚕沙)内物质的成分和含量与1-4龄的蚕沙相比，也会发生很大变化。

既然在亿万年的进化过程中，家蚕和桑黄均以桑树为营养物质来源，对桑树均产生了适应性，而蚕沙是家蚕的排泄物，利用蚕沙来检测桑树桑黄的适应性，借此制作简单、高效的桑树桑黄鉴定培养基，具有非常重要的理论研究实际应用价值。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种鉴别长在桑树上的桑黄，即“桑树桑黄”与其他“桑黄”(容易与桑树桑黄混淆的子实体)的方法。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种用于鉴定桑树桑黄的培养基，包括蚕沙。

作为优选，所述蚕沙为家蚕5龄上蔟前一天的蚕沙，要求家蚕健康无病、蚕沙纯净(仅含少量家蚕食用后的碎桑叶，无任何防僵粉及石灰等养蚕用药品)。

进一步地，包括：蚕沙粉、KH

其中，蚕沙粉、KH

用于鉴定桑树桑黄的培养基的制备方法，包括如下步骤：

(1)取家蚕5龄上蔟前一天的蚕沙；

(2)取5目筛子，初筛新鲜蚕沙，去除较大的碎桑叶；

(3)60℃烘干10h，电风扇风选一次，并用镊子人工再精选一次，剔除较小的桑叶碎屑；

(4)置于150目筛子，清水淘洗一次，再次去除附着在蚕沙表面细微的桑叶碎屑，得到纯净的5龄上蔟前蚕沙；

(5)将5龄上蔟前蚕沙在60℃再次烘干1h，用粉碎机粉碎，得到纯净的5龄上蔟前的干蚕沙粉；

(6)配置桑树桑黄鉴定培养基配置：称取上述干蚕沙粉，添加水、KH

一种桑树桑黄的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)将待检测菌种转接到桑树桑黄鉴定培养基上，封口膜封口；

(2)完全黑暗、28℃静置培养10-12天；

(3)在上述培养条件下，只有桑树桑黄菌丝能在上述培养基中正常生长，而其他菌种均无法在桑树桑黄鉴定培养基中正常生长。

本发明鉴定桑黄的详细步骤如下：

(1)首先野外考察，并采集桑树桑黄子实体、各类与桑树桑黄容易混淆的子实体(图1)；

(2)分离上述各类子实体菌种，暂时保存于PDA培养基中(图2A)。上述菌种在PDA培养基均能顺利生长，仅从颜色，形态，气味等方面，无法准确区分哪个才是真正的桑树桑黄。

(3)取新鲜的家蚕5龄上蔟前一天的蚕沙，要求家蚕健康无病、蚕沙纯净(仅含少量家蚕食用后的碎桑叶，无任何防僵粉及石灰等养蚕用药品)；

(4)用筛子初筛新鲜蚕沙，去除较大的碎桑叶；

(5)烘干后电风扇风再选一次，并用镊子人工再精选一次，剔除较小的桑叶碎屑；

(6)清水淘洗一次，进一步剔除附着在蚕沙表面细微的桑叶碎屑，得到纯净的5龄上蔟前蚕沙(除蚕沙外，无任何其他杂质)。

(7)再次烘干后用粉碎机粉碎，得到纯净的5龄上蔟前的干蚕沙粉；

(8)配置桑树桑黄鉴定培养基配置：称取上述干蚕沙粉，添加水、KH

(9)将上述培养基原料置于培养皿，平铺一层，高温高压灭菌，置于超净台冷却备用。

(10)挑取上述各类生长在PDA培养基中的各类菌种，转接到上述桑树桑黄鉴定培养基中，完全黑暗、28℃静置培养10-12天；

(11)在上述培养条件下，只有桑树桑黄菌丝能在上述培养基中正常生长，而供试的其他菌种寄生的树种并非桑树，均无法在桑树桑黄鉴定培养基中正常生长(图2B)；

(12)将桑树桑黄菌种长期保存在上述鉴定培养基培养，5年内未发现桑树桑黄菌种有任何退化、变异等现象(图3)；用纯桑枝制作子实体菌袋(无任何添加物质)，无需复壮即能顺利培养出桑树桑黄子实体(图4)。

有益效果：本发明首次基于家蚕与桑树、桑树桑黄与桑树之间的协同进化关系，利用家蚕5龄蚕沙加以改进，制作了真正适合桑树桑黄鉴定的培养基。本发明具有以下优点：可以非常直观、高效地辨别市场上绝大部分黄色无柄蕈类是否为真正的桑树桑黄。本发明可以克服绝大部分人没有见到过真正野生的桑树桑黄，无法从子实体外观辨认桑树桑黄的困难；也可以克服各类菌种均能在PDA培养基顺利生长，无法从菌丝颜色，形态，气味等方面准确区分的困难；本发明的培养基是一种绿色培养基，所采用的鉴定的原料(蚕沙)获得简单，天然，环保无毒害，是一种养蚕废弃物的再利用，成本低廉；鉴定方法简单，可操作性强，不需要借助更多实验室检测设备。本发明提供的桑树桑黄鉴定培养基配方，不仅可以甄别市场上绝大部分非桑树桑黄，也可以作为桑树桑黄菌种长期培养保存的优秀培养基，桑树桑黄菌种用此长期保存，无有任何退化、变异等现象，无需复壮即能顺利培养出桑树桑黄子实体。

附图说明

图1为野外采集的桑树桑黄子实体及各类与桑树桑黄容易混淆的子实体。

1.暴马丁香黄(吉林)；2.忍冬黄(西藏)；3.栎树黄(浙江)；4.杨树黄(贵州)；5.杨树黄(辽宁)；6.桑树桑黄(桑黄)(云南)；7.漆树黄(湖南)；8.松树黄(西藏)。

图2为各类菌种的培养与鉴定。A：保存在PDA培养基上的各类菌种，B：各类菌种在桑树桑黄鉴定培养基中的生长状态。1.漆树黄(湖南)；2.松树黄(西藏)；3.松树黄(湖南)；4.暴马丁香黄(湖北)；5.暴马丁香黄(吉林)；6.暴马丁香黄(黑龙江)；7.忍冬黄(西藏)；8.栎树黄(浙江)；9.杨树黄(贵州)；10.杨树黄(辽宁)；11.桑树桑黄(桑黄)(云南)；12.桑树桑黄(桑黄)(西藏)。

图3为桑树桑黄的菌种在桑树桑黄鉴定培养基长期(5年)培养(完全黑暗)的生长状态。

图4利用保存在桑树桑黄鉴定培养基中的菌种诱导出的桑树桑黄子实体。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1、桑树桑黄及其他菌种分离培养

(1)检索文献及网络中经常被误认为桑黄桑黄的黄色无柄蕈类(表1)；野外采集的桑树桑黄子实体及各类与桑树桑黄容易混淆的子实体(图1)。

表1：桑树桑黄及各类与桑树桑黄容易混淆的子实体

(2)分离上述各类子实体菌种，暂时保存于PDA培养基中。上述菌种在PDA培养基均能顺利生长，仅从颜色，形态，气味等方面，无法准确区分哪个才是真正的桑树桑黄(图2A)。

实施例2、桑树桑黄鉴定培养基制作

(1)取新鲜的家蚕5龄上蔟前一天的蚕沙，要求家蚕健康无病、蚕沙纯净(仅含少量家蚕食用后的碎桑叶，无任何防僵粉及石灰等养蚕用药品)；

(2)取5目筛子，初筛新鲜蚕沙，去除较大的碎桑叶；

(3)60℃烘干10h，电风扇风选一次，并用镊子人工再精选一次，剔除较小的桑叶碎屑；

(4)置于150目筛子，清水淘洗一次，进一步剔除附着在蚕沙表面细微的桑叶碎屑，得到纯净的5龄上蔟前蚕沙(除蚕沙外，无任何其他杂质)。

(5)60℃再次烘干1h，用粉碎机(不锈钢中药粉碎机，拜杰BJ-800A)粉碎，得到纯净的5龄上蔟前的干蚕沙粉；

(6)配置桑树桑黄鉴定培养基配置：称取上述干蚕沙粉，添加水、KH

(7)将上述培养基原料置于培养皿，平铺一层(每个9cm的培养皿底部加入5-6g)，121℃灭菌30min，置于超净台冷却备用。

实施例3、桑树桑黄鉴定

(1)挑取上述各类生长在PDA培养基中的各类菌种，转接到上述桑树桑黄鉴定培养基种，封口膜封口。

(2)完全黑暗、28℃静置培养10-12天。

(3)在上述培养条件下，只有桑树桑黄菌丝能在上述培养基中正常生长，而供试的其他菌种寄生的树种并非桑树，均无法在桑树桑黄鉴定培养基中正常生长(图2B)。

(4)将桑树桑黄菌种长期用上述鉴定培养基培养，5年内未发现桑树桑黄菌种有任何退化、变异等现象(图3)，用纯桑枝制作子实体菌袋(无任何添加物质)，无需复壮即能顺利培养出桑树桑黄子实体(图4)。

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