一种可解除免疫抑制并增强肿瘤靶向性杀伤的间充质干细胞的制备方法

摘要

本公开提供了一种可解除免疫抑制并增强肿瘤靶向性杀伤的间充质干细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对PD‑1基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、形成携带TRAIL基因的待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，通过PCR及测序并筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。通过上述技术方案，本发明制备了一种可解除免疫抑制并增强肿瘤靶向性杀伤的人间充质干细胞。

说明书

技术领域

本公开涉及医药生物技术领域，具体地，涉及一种可解除免疫抑制并增强肿瘤靶向性杀伤的间充质干细胞的制备方法。

背景技术

研究发现，间充质干细胞(MSCs)具有特异性迁移至原发肿瘤部位及肿瘤转移灶的特点，并表现出自身抗肿瘤的特性，可以使包括肝癌、淋巴瘤及胰岛素瘤细胞滞留在G0/G1期，抑制肿瘤细胞生长，诱导癌细胞凋亡。因此，间充质干细胞有望成为肿瘤靶向治疗的优良载体。经基因工程改造的间充质干细胞作为一种有效的替代疗法，能够克服常规药物半衰期短及高药物毒性的临床限制。已有研究发现使用腺病毒在MSCs中转导表达白介素-12，对肾癌肿瘤细胞具有抑制生长作用。用表达单纯疱疹病毒胸腺激酶(HSV-tk) 的反转录病毒转染MSCs，应用HSV-tk/gcv自杀基因治疗，在体内体外均有诱导神经胶质瘤细胞死亡的效果。但是，间充质干细胞的消除肿瘤的效率仍然有待提高。

CRISPR基因编辑技术通过在基因组特定位点进行精确的靶向性剪切，形成DNA双链缺口(Double-strand breaks,DSBs)，通过细胞内非同源末端链接(Non-homologous endjoining,NHEJ)实现对原位基因的敲除，通过同源重组(Homology directed repair,HDR)在外源基因模板存在的情况下，实现点突变的引入与修复及大片段基因(如报告基因)的插入。如专利文献 CN105985985A中所述，利用CRISPR/Cas9系统构建慢病毒，对脐带来源的MSCs中的免疫抗原B2M、炎症因子TNF-α进行敲除，从而实现降低异体间充质干细胞免疫源性的目的。但在哺乳动物细胞中，NHEJ修复基因占主导模式，实现基因敲除比实现基因敲入容易很多。且基因敲入的片段越大，整合几率越低，技术实现更为困难。目前尚未见有在MSCs中进行大片段基因敲入的报道。

发明内容

本公开的目的是克服间充质干细胞存在免疫抑制且对肿瘤的杀伤效率较低的缺陷，解除间充质干细胞的免疫抑制并提高间充质干细胞对肿瘤的杀伤效率。

为了实现上述目的，本公开提供了一种可解除免疫抑制并增强肿瘤靶向性杀伤的间充质干细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对PD-1 基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、将插入有模版DNA同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模版DNA包括针对PD-1基因的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有TRAIL基因；且能够通过TRAIL基因的定向敲入使得PD-1基因的表达沉默；S3、将间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物； S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。

通过上述技术方案，本发明建立了一种可在间充质干细胞高效敲入长片段报告基因的方法，在间充质干细胞中敲除PD-1基因的同时插入肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL,TNF-related apoptosis-inducing ligand)基因，通过敲除PD-1实现对CD8⁺T细胞抑制的解除(G0/G1期细胞数量减少，S>

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开提供了一种可解除免疫抑制并增强肿瘤靶向性杀伤的间充质干细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对PD-1基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、将插入有模版DNA同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模版DNA 包括针对PD-1基因的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有TRAIL基因；且能够通过TRAIL 基因的定向敲入使得PD-1基因的表达沉默；S3、将间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。

本发明通过RNP复合物以电转的方式将sgRNA和Cas9蛋白转入细胞中，并在电转后的合适的时间内选择AAV病毒来将插入有荧光蛋白报告基因的同源重组载体转染如细胞中，最终使得sgRNA、Cas9蛋白和插入有模版DNA的载体共同通过CRISPR基因编辑来使得大片段的外源基因得以定向敲入靶点位置。

其中，PD-1基因是以NCBI数据库中的Gene Symbol来定义的，其NCBI Gene ID为5133。

其中，可选地，所述sgRNA带有化学修饰基团；所述化学修饰基团优选为甲基化学修饰基团或磷硫酰化学修饰基团；针对PD-1基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白的用量摩尔比为1:1至1:5。其中，可以使用在线sgRNA 设计工具(http://crispr.mit.edu/)依据PD-1基因的敲入位点设计sgRNA的序列并加以合成。其中，sgRNA序列的5’端和3’端末尾的可以分别添加有甲基(-O-Me)化学修饰基团或磷硫酰(-phosphorothioate)化学修饰基团。

其中，可选地，将针对PD-1基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合的时间为5-20分钟，温度为10-40℃。

其中，可选地，步骤S3中，所述间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物混合时，相对于每10⁶个所述间充质干细胞，以sgRNA的量计，所述RNP>7个/mL；以sgRNA的量计，所述RNP复合物的终浓度为0.1-1.5μmol/μL。

其中，可选地，步骤S3中，电转的条件包括：电场强度为50-250V/cm，单次脉冲时间为2-15ms，相邻两次脉冲之间的时间间隔为10-60s，总脉冲次数为2-10次。

其中，可选地，步骤S4中，在电转结束后5-20分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染，得到转染后的培养物。

其中，可选地，步骤S4中，待转染的AAV病毒颗粒的悬液的加入量使得待转染的AAV病毒颗粒的MOI值为10⁴-10⁶。MOI值是感染时病毒与细胞数量的比值。

其中，优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、宫血间充质干细胞及牙髓间充质干细胞。所述 AAV病毒的血清型可以为AAV-1病毒、AAV-2病毒、AAV-3病毒、AAV-4 病毒、AAV-5病毒、AAV-6病毒、AAV-7病毒、AAV-8病毒、AAV-9病毒、AAV-DJ病毒及AAV-DJ/8病毒，优选为AAV-DJ病毒、AAV-6病毒、AAV-1 病毒或AAV9病毒，更优选所述AAV病毒的血清型为AAV9病毒，在该优选情况下，能够进一步增加大片段基因敲入干细胞的效率。

其中，所述PD-1基因的敲入位点能够使得通过TRAIL基因的定向敲入使得PD-1基因的表达沉默，优选所述PD-1基因的敲入位点位于PD-1基因的第一外显子上。

其中，所述TRAIL基因是指肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL，TNF-relatedapoptosis-inducing ligand)基因，可以为膜结合型TRAIL基因或分泌型TRAIL基因。

其中，所述模版DNA可以包括左同源臂序列、敲入片段和右同源臂序列；优选地，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间可以插入有CMV 增强子、CMV启动子、TRAIL基因的表达框和SV40poly A；优选地，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入的序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.10所示。

其中，优选地，所述sgRNA如SEQ ID NO.1所示；相应地，所述左同源臂序列如SEQID NO.2所示；相应地，所述右同源臂序列如SEQ ID NO.3 所示。

其中，可选地，所述载体的骨架序列如SEQ ID NO.7所示。所述载体的骨架序列是指未插入模版DNA的载体的序列。

以下通过实施例进一步详细说明本发明：

实施例1

构建在脐带间充质干细胞程序性死亡受体1基因(PD-1)的Exon1中插入膜结合型TRAIL基因表达Cassette的细胞模型。

1、sgRNA设计以及合成

(1)通过在线sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu/)在PD-1基因1 号外显子上设计靶向识别的PD-1sgRNA，优选结果如下：5’-

cgacuggccagggcgccuguguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu-3’(SEQ ID NO.1)。

其中1-20位的序列为识别基序，其余的序列为tracrRNA。

(2)该sgRNA由Integrated DNA Technologies,Inc.(IDT)合成并在该 sgRNA序列的5’端和3’端末尾的三个碱基的二号位和三号位上别添加 O-Me、phosphorothioate的修饰。

2、体外法检测sgRNA的活性

(1)从基因组扩增识别靶序列片段(1456bp)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PD-1-FW:5’-ggaaagaggccacagcagtg-3’(SEQ ID NO.5)，

PD-1-REV:5’-agtcgcctgccacagtgaag-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)将PCR扩增产物200ng，sgRNA 100ng，SpCas9 200ng(购于 Sigma-Aldrich，货号：TGEN-CP-500UG)，10×缓冲液2μL配置成20μL 反应体系。反应体系在37度保温一小时，在70度保温一小时。

(3)使用TAE配置1％的BioWest琼脂糖胶，在90V的电压下电泳 30min，使用凝胶成像仪观察结果。

3、AAV包装系统选择及质粒构建

(1)待编辑细胞为脐带间充质干细胞，根据AAV组织亲和性对照表，优选血清型为AAV-9的包装系统。

(2)AAV-9的总包装容量为4.7Kb。在AAV包装系统的装载载体上所插入的片段应包含左同源臂(500bp左右)，插入片段以及右同源臂(500bp 左右)。

左同源臂序列为SEQ ID NO.2。

右同源臂序列为SEQ ID NO.3。

插入片段一个完整的Cassette包括CMV增加子、CMV启动子、膜结合型TRAIL CDS和SV40poly A，共1487bp，序列如SEQ ID NO.4所示。使用无缝克隆(NEBuilder高保真DNA组装试剂盒，购于NEB(北京)有限公司，货号：E2621S)的方法将Cassette插入到pAAV载体上，载体序列为SEQ ID NO.7。

4、AAV病毒包装及纯化

(1)在病毒包装前一天将HEK293T细胞按照每皿5×10⁶的数量种植到直径10cm的含有10mL完全培养基：DMEM(购于ThermoFisher>2的细胞培养箱中培养24小时。

(2)病毒包装当天检查HEK293T细胞汇合度是否达到80％。每皿按照以下步骤单独配置转染体系：将10μg的pAAV-Cassette，10μg的pHelper， 10μg的pAAV9-RC混合后使用无血清的DMEM调整体积到910μL后经漩涡振荡器混匀，加入90μL的PEI(购于PolysciencesAsia Pacific,Inc.货号： 23966-2)后再次使用漩涡振荡器混匀，静置15分钟。将CORNING培养皿中的完全培养基替换成9mL无血清培养基，再将之前经过静置的DNA-PEI 复合物均匀滴加到培养皿中，轻柔晃匀后置于37度、5％CO₂的细胞培养箱中培养6小时。转染6h后将CORNING培养皿中的无血清培养基替换成完全培养基，于37度、5％CO₂的细胞培养箱中继续培养。

(3)在转染60小时之后，分别收获上清和细胞。

将收集得到的上清经4000rpm 4度离心10分钟后弃去杂质。将去除杂质的上清加入Amicon Ultra-15超离柱中(购于默克化工技术(上海)有限公司，货号：UFC 905096)，经过若干次4000rpm、4度离心30分钟将体积浓缩至10到15mL。将用细胞刮刀刮下的HEK293T细胞用适量培养基吹匀并转移至50mL离心管中，经1500rpm、4度离心10min后弃上清，所有沉淀总共加3mL细胞裂解缓冲液(150mM NaCl,20mM tris pH8.0)使其重悬。将重悬细胞在-80℃酒精浴和37℃水浴中反复冻融三次。将浓缩的上清和冻融的细胞悬液混匀，添加1MMgCl₂至终浓度为1mM。添加Benzonase(购于默克化工技术(上海)有限公司，货号：70746-1kU)至终浓度为25U/mL，混匀后37℃反应40min。取出50mL离心管，4℃，4000rpm离心20min，取上清。

(4)采用碘克沙醇密度梯度离心法纯化病毒(购于Sigma-Aldrich，货号：D1556-250mL)。配置碘克沙醇梯度17％：5mL 10×PBS,0.05mL 1M MgCl₂,0.125mL>2,0.125mL>2,0.125mL>2,0.125mL>

(5)利用qPCR对AAV9进行滴度检测。根据EGFP序列设计引物，使qPCR产物的长度约200bp。qPCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

AAV-TRAIL-F:5’-gatcttcacagtgctcctgc-3’(SEQ ID NO.8)。

AAV-TRAIL-R:5’-tgacggagttgccacttgac-3’(SEQ ID NO.9)。

制备7个AAV9重组质粒标准品，以1：10的比例进行梯度稀释。从 10ng/μL以下的浓度开始稀释，分别为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL和0.00001ng/μL。

根据以下公式计算稀释的DNA拷贝数：

使用DNase对病毒样本进行预处理(购于宝生物工程(大连)有限公司，货号：2270A)。使用2×SYBR PCR mix(购于东洋纺(上海)生物科技有限公司，货号：QPS-201)配置qPCR反应体系。使用Roche 480II 实时荧光定量PCR系统进行定量PCR。根据Ct值，绘制标准曲线，并计算 AAV9的滴度。

5、RNP复合物组装及待编辑细胞的预处理

(1)将SpCas9(终浓度300ug/ml)和PD1sgRNA(终浓度175μg/ml) 按照1:3的摩尔比进行混合在室温孵育10min，从而形成SpCas9/sgRNA RNP 复合物。

(2)观察脐带间充质干细胞汇合率达到80％后移除含10％FBS的 DMEM/F12培养基(购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：11320082)，用PBS漂洗一次。加入0.05％胰酶(购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号： 25200-072)使之完全覆盖皿底。37℃孵育3-5分钟后停止消化，吸去胰酶。即刻加入新鲜的DMEM/F12完全培养基，用1mL枪扇形吹打培养皿底，使皿/瓶底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，制成干细胞悬液。使用血球计数板对细胞密度进行计数。使用Opti-MEM(14.5mM的ATP、23.6mM 的氯化镁,购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：11058021)调整细胞密度到5×10⁷/mL。

(3)将10μL经过室温孵育的SpCas9/sgRNA SNP复合物(以sgRNA 的量计，所述RNP复合物的含量为7.5μmol)和10μL经过计数并使用 Opti-MEM重悬的骨髓间充质干细胞悬液(其中细胞数量为5×10⁵个)相混合，将20μL混合液转移到16孔电转板条中。使用Lonza>2的细胞培养箱中继续培养。

(4)电转完第5到20分钟内开始按照1×10⁵的MOI值轻柔地滴加>

(5)电转完24小时后将旧培养基移除，更换为DMEM/F12完全培养基。

6、单克隆细胞株的培养：

(1)电转完第48小时使用PBS漂洗一次培养皿。加入胰酶使之完全覆盖皿底。37℃孵育3-5分钟后停止消化，吸去胰酶。即刻加入新鲜的 DMEM/F12完全培养基，用1mL枪扇形吹打培养皿/瓶底，使皿底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，保证细胞间没有粘连，制成干细胞悬液。使用血球计数板对细胞密度进行计数。按每个10cm培养皿15000个细胞的比例把细胞种植到含DMEM/F12完全培养基的10cm CORNING培养皿中于 37度、5％CO₂的细胞培养箱中继续培养。

(2)每24小时进行观察并移除旧的培养基，更换为新的DMEM/F12 完全培养基。72小时后可以在镜下观察到克隆的形成。

(3)电转后12到14天在十倍的物镜下可以看到克隆的大小已经相当于一个硬币。不能让克隆继续变大或者相交。在96孔板上的每个孔中加入 120μL DMEM/F12完全培养基，标记板O。在超净台中通过显微镜进行观察，将P200移液器调节至45μL使用带有滤芯的枪头刮碎克隆，用移液器收集细胞并转移到96孔板的小孔中。

(4)克隆挑取之后每24小时后将旧的培养基移除，更换为新的 DMEM/F12完全培养基，四天后细胞汇合率达到80％。

(5)在两块96孔板上的每个孔中加入133μL含10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，分别标记为板A、板B。将板O的每孔使用150μL 的PBS漂洗。每孔中加入35μL的胰酶，消化5到10分钟后每孔中添加165μL 的DMEM/F12完全培养基。从孔中分别移取66μL的细胞悬液转移到板A 和板B的对应小孔中。板A用于基因组提取，板B备用。在板O的每个孔中直接添加165μL的细胞冻存液后至于深低温冰箱存储。

实施例2

构建在脐带间充质干细胞程序性死亡受体1基因(PD-1)的Exon1中插入分泌型TRAIL基因表达Cassette的细胞模型。

采用实施例1的方法进行，不同在于：插入片段为一个完整的Cassette 包括CMV增加子、CMV启动子、重组分泌型TRAIL基因CDS和SV40poly A，共1349bp，序列如SEQ ID NO.10所示。

对比例1

按照实施例1的方法进行，不同的是电转完第35min开始按照1×10⁵的MOI轻柔得滴加AAV9，并于电转完50分钟内滴加完毕。

对比例2

按照实施例2的方法进行，不同的是电转完第35min开始按照1×10⁵的MOI轻柔得滴加AAV9，并于电转完50分钟内滴加完毕。

测试实施例1

1、基因编辑效率检测(等位基因插入检测)

(1)在同源臂外设计引物(非整合位点PCR产物约1341bp左右，针对实施例1和对比例1膜结合型TRAIL整合位点PCR产物2828bp，针对实施例2和对比例2分泌型TRAIL整合位点PCR产物2690bp)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PD1-HR-FW:5’-ggagccgattagccatggac-3’(SEQ ID NO.11)，

PD1-HR-REV:5’-agaagaactgtcctcactcg-3’(SEQ ID NO.12)。

(2)选取96个克隆以及未编辑脐带间充质干细胞细胞株作为对照，将 96孔板中的克隆所获得的基因组进行PCR扩增。

(3)将PCR产物进行电泳并分析。只有1341bp左右条带的为非编辑细胞，只有2828bp的或2690bp的为双等位基因编辑细胞，既有1341bp左右条带也有2828bp的或2690bp的为单等位基因编辑细胞。分别标注并统计这三类编辑类型的比例。结果如表1所示。

表1

组别非编辑细胞比例双等位基因编辑细胞单等位基因编辑细胞实施例131.2％23.6％45.2％对比例195.9％1.0％3.1％实施例240.3％24.6％35.1％对比例293.7％2.1％4.2％

2、实施例1和2得到脐带间充质干细胞对免疫抑制的解除作用(相对于未进行敲入的脐带间充质干细胞)：

细胞周期检查点(checkpoint)是细胞周期(cell cycle)中的一套保证 DNA复制和染色体(chromosome)分配质量的检查机制，是一类负反馈调节机制。当细胞周期进程中出现异常事件，如DNA损伤或DNA复制受阻时，这类调节机制就被激活，及时地中断细胞周期的运行。待细胞修复或排除故障后，细胞周期才能恢复运转。将实施例1和2得到脐带间充质干细胞以及未进行敲入的脐带间充质干细胞分别移植入BALB/c小鼠，观测到实施例1和2得到脐带间充质干细胞对CD8⁺T细胞抑制的解除(G0/G1期细胞数量减少，S期细胞数量增加)，结果如表2所示。

表2

组别G0/G1期细胞比例S期细胞比例实施例121.6％67.8％实施例223.1％65.9％未敲入68.4％21.2％

3、对荷瘤小鼠的肿瘤抑制实验：

参照文献《茶皂素对荷瘤小鼠肿瘤抑制作用研究》中的方法，制备人乳腺癌(EAC)荷瘤昆明小鼠模型(体重18～22g)，并用实施例1和2得到的脐带间充质干细胞和未进行敲入的脐带间充质干细胞对荷瘤小鼠分别进行尾静脉注射(注射剂量为1×10⁶cell/0.1ml)，查看肿瘤抑制效果，结果如表>

(肿瘤对照组平均瘤重－实验组平均瘤重)/肿瘤对照组平均瘤重× 100％。

表3

组别平均瘤重(g)肿瘤抑制效率实施例10.94±0.1358.4％实施例21.01±0.2155.3％未敲入脐带间充质干细胞1.92±0.4615.0％对照组2.26±0.52/

以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 杭州观梓健康科技有限公司

<120> 一种可解除免疫抑制并增强肿瘤靶向性杀伤的间充质干细胞的制备方法

<130> 10969-K-HZGZ

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 103

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgacuggcca gggcgccugu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 2

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggaacctg agcccagagg gggccaccca ccttccccag gcagggaggc ccggccccca 60

gggagatggg ggggatgggg gaggagaagg gcctgccccc acccggcagc ctcaggaggg 120

gcagctcggg cgggatatgg aaagaggcca cagcagtgag cagagacaca gaggaggaag 180

gggccctgag ctggggagac ccccacgggg tagggcgtgg gggccacggg cccacctcct 240

ccccatctcc tctgtctccc tgtctctgtc tctctctccc tcccccaccc tctccccagt 300

cctaccccct cctcacccct cctcccccag cactgcctct gtcactctcg cccacgtgga 360

tgtggaggaa gagggggcgg gagcaagggg cgggcaccct cccttcaacc tgacctggga 420

cagtttccct tccgctcacc tccgcctgag cagtggagaa ggcggcactc tggtggggct 480

gctccaggca tgcagatccc 500

<210> 3

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acaggcgccc tggccagtcg tctgggcggt gctacaactg ggctggcggc caggatggtt 60

cttaggtagg tggggtcggc ggtcaggtgt cccagagcca ggggtctgga gggaccttcc 120

accctcagtc cctggcaggt cggggggtgc tgaggcgggc ctggccctgg cagcccaggg 180

gtcccggagc gaggggtctg gagggacctt tcactctcag tccctggcag gtcggggggt 240

gctgtggcag gcccagcctt ggcccccagc tctgcccctt accctgagct gtgtggcttt 300

gggcagctcg aactcctggg ttcctctctg ggccccaact cctcccctgg cccaagtccc 360

ctctttgctc ctgggcaggc aggacctctg tcccctctca gccggtcctt ggggctgcgt 420

gtttctgtag aatgacgggt caggctggcc agaaccccaa accttggccg tggggagtct 480

gcgtggcggc tctgccttgc 500

<210> 4

<211> 1487

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480

acggtgggag gtctatataa gcagagctat ggctatgatg gaggtccagg ggggacccag 540

cctgggacag acctgcgtgc tgatcgtgat cttcacagtg ctcctgcagt ctctctgtgt 600

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aagtggcatt gcttgtttct taaaagaaga tgacagttat tgggacccca atgacgaaga 720

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tcccctagtg agagaaagag gtcctcagag agtagcagct cacataactg ggaccagagg 900

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aaactcctgg gaatcatcaa ggagtgggca ttcattcctg agcaacttgc acttgaggaa 1020

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