以靶标蛋白甾醇14α-脱甲基酶三维结构筛选的小分子化合物及其在制备杀菌剂中的应用

摘要

本发明公开了以靶标蛋白甾醇14α‑脱甲基酶三维结构筛选的小分子化合物及其在制备杀菌剂中的应用，所述小分子化合物为((1R,5S)‑3‑((3‑苯基‑1,2,4‑噁二唑‑5‑基)甲基)‑3,4,5,6‑四氢‑1H‑1,5‑甲撑吡啶并[1,2‑a][1,5]二氮环辛‑8(2H)‑酮盐酸盐。本发明通过室内药剂敏感性测定，证明了所述小分子化合物对引起小麦赤霉病害的主要植物病原真菌禾谷镰刀菌具有良好的抑制活性，而且对引起果蔬灰霉病的灰霉病菌及引起苹果轮纹病的苹果轮纹病菌也有较好的抑制活性。本发明首次提出以靶标蛋白三维结构筛选绿色小分子化合物((1R,5S)‑3‑((3‑苯基‑1,2,4‑噁二唑‑5‑基)甲基)‑3,4,5,6‑四氢‑1H‑1,5‑甲撑吡啶并[1,2‑a][1,5]二氮环辛‑8(2H)‑酮盐酸盐应用于植物病害的防控，市场应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及以靶标蛋白甾醇14α-脱甲基酶三维结构筛选的小分子化合物及其在制备杀菌剂中的应用。

背景技术

据联合国粮农组织(FAO)估计，世界上因病虫杂草造成的农作物产量损失高达40％左右(4400-5500亿元)，其中对树木的影响更是难以估计。长期以来，使用化学药剂是防控植物病害的主要手段。化学农药的大量长期使用不仅导致抗性问题的产生，而且会造成药剂残留，杀伤非靶标生物，污染生态环境，并最终经过生物富集对人体产生危害。为解决以上问题，以植物病原微生物靶标蛋白三维结构设计筛选绿色小分子化合物成为研究热点。

目前，使用化学杀菌剂是控制小麦赤霉病等植物病害发生和危害的主要手段，防治小麦赤霉病害主要化学药剂包括苯并咪唑类杀菌剂(多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、甲基托布津等)、麦角甾醇生物合成抑制剂(戊唑醇、三唑酮、烯唑醇、丙环唑等)及新型杀菌剂氰烯菌酯等。随着杀菌剂的长期大量使用，小麦赤霉病菌对药剂逐渐产生了抗药性，特别是病原菌的多药抗性(muitidrug resistance，MDR)，已成为小麦赤霉病防治过程中最为棘手的问题。因此，研究小麦赤霉病菌多药抗性机制，有针对性的开发新药和合理用药，是当前农业和医学界的研究热点之一。

发明内容

本发明的目的是提供了以靶标蛋白甾醇14α-脱甲基酶三维结构筛选的小分子化合物及其在制备杀菌剂中的应用。本发明首次提出以靶标蛋白三维结构筛选绿色小分子化合物((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐应用于植物病害的防控。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了以靶标蛋白甾醇14α-脱甲基酶三维结构筛选的小分子化合物，所述小分子化合物为((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐。

进一步的：所述((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐的分子式：C₂₀H₂₁ClN₄O₂，分子量：384.864，结构式如下：

本发明还提供了所述的小分子化合物在制备用于防治植物病原菌的杀菌剂中的应用。

进一步的：所述植物病原菌为禾谷镰刀菌、灰霉病菌和苹果轮纹病菌。

进一步的：所述((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐在杀菌剂中的使用浓度为0.5mM-1mM。

进一步的：所述((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐对禾谷镰刀菌的抑制率为24％-32％。

进一步的：所述((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐对灰霉病菌的抑制率为28％-43％。

进一步的：所述((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐对苹果轮纹病菌的抑制率为26％-30％。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明基于禾谷镰刀菌CYP51B蛋白(甾醇14α-脱甲基酶(CYP51))结构合成了((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐，而且通过室内药剂敏感性测定，证明了((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐对引起小麦赤霉病害的主要植物病原真菌禾谷镰刀菌具有良好的抑制活性，而且对引起果蔬灰霉病的灰霉病菌及引起苹果轮纹病的苹果轮纹病菌也有较好的抑制活性。本发明首次提出以靶标蛋白三维结构筛选绿色小分子化合物((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐应用于植物病害的防控，解决了禾谷镰刀菌、灰霉病菌和轮纹病菌对多种杀菌剂产生抗性，造成防效差的问题，对环境友好，绿色无污染，符合世界卫生组织药剂残留毒性标准，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是((1R，5S)-3-((3-苯基-l，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐对3种病原菌菌丝生长的抑制效果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

本发明在InterBioScreen数据库(https：//www，ibscreen.com/)，基于禾谷镰刀菌CYP51B蛋白(甾醇14α-脱甲基酶(CYP51))三维结构设计筛选到并合成了小分子化合物((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐。

((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐的英文名称为：(1R，5S)-3-((3-phenyl-1，2，4-oxadiazol-5-y1)methyl)-3，4，5，6-tetrahydro-1H-1，5-methanopyrido[1，2-a][1，5]diazocin-8(2H)-one hydrochloride；分子式：C₂₀H₂₁ClN₄O₂(STOCK2S-80122)，分子量：384.864，结构式如下：

((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-l，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐的合成过程如下：

1、试验方法

((1R，5S)-3-((3-苯基-l，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐对病原菌的药剂敏感性均采用菌落生长速率抑制法进行测定。生长速率法又称含毒介质法，特别适用于在培养基上不产孢或者产孢量少且菌丝较密的的供试菌株，符合本次实验的要求。

实验操作过程如下：

(1)活化菌株：将保种管中的禾谷镰孢菌、灰霉病菌及苹果轮纹病菌接种在PDA平板上，培养3-4d后置于4℃恒温冰箱中备用。

(2)配制母液：称取0.0577g本发明所述小分子化合物，用溶剂DMSO(二甲基亚砜)配制成浓度为1M的母液。

(3)制备带毒平板：将PDA培养基加热溶化，冷却至45-50℃，加入母液制成含0.5和1mM药液的培养基(对照中加入相应体积的二甲基亚砜)，充分混匀后分别倒入培养皿中冷却。每处理设置3次重复。

(4)接种病原菌：用打孔器(直径为6mm)在预培养的菌落边缘同一圆周上打取菌饼，接入毒板的中央，封口后置于25℃恒温培养箱中培养。

2、数据处理

待对照组的菌落边缘接近皿壁时，采用十字交叉法测量各处理组的菌落直径，并计算生长抑制率。

3、试验结果

((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐对禾谷镰刀菌、灰霉病菌及苹果轮纹病菌菌落生长速率的影响(图1)，供试药剂的浓度及抑制率如表1所示。

表1((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐对3种病原菌菌丝生长的抑制作用测定结果

从表1和图1实验结果可知，本发明所述绿色小分子化合物((1R，5S)-3-((3-苯基-1，2，4-噁二唑-5-基)甲基)-3，4，5，6-四氢-1H-1，5-甲撑吡啶并[1，2-a][1，5]二氮环辛-8(2H)-酮盐酸盐对苹果轮纹病菌、小麦赤霉病菌和灰霉病菌都有显著抑制作用。而且在0.5mM-1mM范围内，随着药物浓度升高，抑制效果越明显。

苹果轮纹病菌：苹果轮纹病又名粗皮病、轮纹烂果病，是苹果枝干部和果实上的重要生物灾害，常引起苹果枝干树皮粗糙、局部性坏死和果实腐烂。患病植株坐果率低，导致树体衰弱和产量减少，甚至绝产毁园。近年来，随着易感品种富士苹果的大面积栽培，苹果轮纹病发病率逐年增加，危害面积不断扩大，已成为中国苹果生产中的严重病害，严重威胁着苹果产业的可持续发展。

小麦赤霉病菌：赤霉病是一种毁灭性病害，可引起穗腐，造成严重减产和品质降低。随着全球气候变暖、耕作制度和方式的改变，小麦赤霉病不断蔓延扩展，常常造成小麦减产、品质降低，且受侵染的小麦籽粒中含有真菌毒素，可引起人畜中毒和严重疾病。该病菌除危害小麦外，还能侵染大麦、燕麦、水稻、玉米等多种禾本科作物以及鹅冠草等禾本科杂草，此外，还可侵染大豆、棉花、红薯等作物。

灰霉病菌：灰霉病菌寄主广泛，可侵染番茄、黄瓜、茄子、菜豆、青椒、芹菜、莴笋、莴苣、葡萄等多种果蔬。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。