特异性靶向SATB1基因的sgRNA及其在转录激活中的应用

摘要

本发明提供一种制备特异性靶向目标基因SATB1的sgRNA，序列为SEQ ID NO.1，本发明利用Casilio系统特异性转录激活人Hela细胞中SATB1基因。本发明制备的特异性靶向人SATB1基因的sgRNA能够精确靶向人SATB1基因并且实现转录激活。本发明制备方法步骤简单、sgRNA靶向性好，SATB1转录激活效率高。本发明可以在较短时间内实现SATB1转录激活，与直接细胞内转染SATB1过表达质粒相比，更符合生理情况，且价格低廉，有助于进一步深入研究SATB1的生物学功能。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及一种特异性靶向SATB1基因的sgRNA，以及利用该sgRNA通过Casilio系统特异性转录激活人Hela细胞SATB1基因的方法。

背景技术

规律成簇间隔短回文重复系统(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat；CRISPR-associated，CRISPR-Cas9)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-strand breaks,DSB)。而核酸酶缺陷突变体dCas9则去除了Cas9的切割能力，仅保留了sgRNA介导的靶向能力。将转录激活因子P65HSF1及RNA结合蛋白Pumilio/FBF(PUF)融合表达，同时，在sgRNA后串联PUF结合位点，并与dCas9共同表达，可以利用sgRNA和dCas9将PUF结合位点靶向至目的基因，利用PUF与PUF结合位点结合，将转录激活因子P65HSF1靶向至目的基因，从而转录激活该基因。此系统称为Casilio系统(见图1)。

dCas9靶向DNA是通过向导核糖核酸(guide RNA，sgRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。sgRNA的特异性决定了基因编辑的精确程度。因此，设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键技术。

SATB1是一类转录因子，具有转录目的基因等多个生物学功能。利用Casilio系统快速、简便、高效、特异性转录激活SATB1基因，有助于深入研究其功能。而能否设计、制备出精确性和特异性靶向SATB1基因的sgRNA以及通过分子生物学方法制备出靶向SATB1基因的Casilio系统成为实现SATB1基因激活的关键技术。

参考文献：

Ran,F.A.et al.,Genome engineering using the CRISPR-Cas9system.NAT PROTOC8 2281 (2013)。

Cheng,A.W.et al.,Casilio:a versatile CRISPR-Cas9-Pumilio hybrid for generegulation and genomic labeling.CELL RES 26 254(2016).

发明内容

本发明的目的是提供一种制备特异性靶向目标基因SATB1的sgRNA，序列为：ttgcggaagaagcagatgtcagg(SEQ ID NO.1)。

本发明的另一个目的是提供所述sgRNA在转录激活靶向SATB1基因中的应用，是基于Casilio系统特异性转录激活人Hela细胞SATB1基因，通过以下步骤实现。

1.靶向SATB1基因sgRNA寡核苷酸的设计和选择：

(1)在SATB1基因上选择特征为5’-N(19)GG或5’-N(20)GG-3’或5’-N(21)GG-3’的序列；

(2)sgRNA在SATB1基因上的靶向位点位于转录起始位点后200bp内；

按以上原则，设计得到sgRNA，序列为SEQ No.1。

2.利用sgRNA，合成可以连入pAC-sgRNA-5×PBSa真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸：

(1)根据选择的sgRNA，去除3’端NGG三个碱基，在其5’端加上CACCG得到正向寡核苷酸；根据选择的sgRNA，去除3’端NGG三个碱基，获得对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC,3’端加上C得到反向寡核苷酸。上述正向、反向寡核苷酸序列见SEQ NO.2和SEQ NO.3；

(2)分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，合成可以连入pAC-sgRNA-5×PBSa真核表达载体的双链。

3.将sgRNA构建至pAC-sgRNA-5×PBSa载体，鉴定并扩增：

(1)将退火的sgRNA寡聚核苷酸双链与pAC-sgRNA-5×PBSa载体(序列见SEQ NO.4) 连接获得pAC-SATB1sgRNA-5×PBSa质粒(序列见SEQ NO.5)；

(2)pAC-SATB1sgRNA-5×PBSa质粒转化感受态细菌并涂Amp+平板；

(3)对pAC-SATB1sgRNA-5×PBSa质粒进行鉴定：挑选阳性克隆并用序列如SEQ ID NO.6所示的通用引物U6测序的方法鉴定阳性克隆，37℃摇床摇阳性克隆菌过夜并用抽提 pAC-SATB1sgRNA-5×PBSa质粒。

4.转染Hela细胞转录激活SATB1：

(1)按照 DNA&siRNA Transfection Reagent(Polyplus transfection，114-01)的操作手册，用800ng脂质体装载的pAC-SATB1sgRNA-5×PBSa质粒、400ng 的pmax-dCas9质粒((序列见SEQ No.7))以及800ng的pAC1393-PUFa-P65-HSF1质粒(序列见SEQNo.8)，分别转染至Hela细胞；

(2)转染48小时后收集转然后的Hela细胞，提取总RNA和总蛋白，Real time Q-PCR 及Western Blot确认SATB1被转录激活。

本发明可以在较短时间内实现SATB1转录激活，与直接细胞内转染SATB1过表达质粒相比，更符合生理情况，且价格低廉，有助于进一步深入研究SATB1的生物学功能。利用本发明制备的特异性靶向人SATB1基因的sgRNA能够精确靶向人SATB1基因并且实现SATB1转录激活。该制备方法步骤简单、sgRNA靶向性好，SATB1基因转录激活效率高。

附图说明

图1是本发明的Casilio系统原理图。

图2是SATB1mRNA表达情况的分析图，其中示出通过Real time Q-PCR确认SATB1mRNA上调。

图3是用Western Blot检测SATB1表达水平，确认转录激活后的SATB1蛋白水平上调。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步介绍。

实施例1靶向人SATB1基因的sgRNA的设计和合成

1.靶向人SATB1基因的sgRNA的设计。

(1)在SATB1基因上选择特征为5’-N(19)GG或5’-N(20)GG-3’或5’-N(21)GG-3’的序列。

(2)sgRNA在SATB1基因上的靶向位点位于转录起始位点后200bp内。

2.按以上原则，设计得到sgRNA，序列为SEQ No.1。

3.靶向人SATB1基因的sgRNA寡聚核苷酸的合成和构建。

根据选择的sgRNA，去除3’端NGG三个碱基，在其5’端加上CACCG得到正向寡核苷酸；根据选择的sgRNA，去除3’端NGG三个碱基，获得对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC,3’端加上C得到反向寡核苷酸。序列见SEQ NO.2和SEQ NO.3。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入 pAC-sgRNA-5×PBSa真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。

变性、退火反应体系为：

1μl正向寡核苷酸(100μM)

1μl反向寡核苷酸(100μM)

1μl T4ligation buffer(New England BioLabs公司，货号：B0202S)

1μl T4PNK(New England BioLabs公司，货号：M0201S)

6μl灭菌水。

在PCR仪中按照以下程序运行：37℃，30min；95℃,5min；0.1℃/sec由95℃降至25℃。

实施例2将双链sgRNA构建至pAC-sgRNA-5×PBSa载体

将变性、退火后所得双链sgRNA按1：200比例稀释。

将双链sgRNA构建至pAC-sgRNA-5×PBSa载体(序列见SEQ NO.4)，反应体系如下：

100ng pAC-sgRNA-5×PBSa质粒

2μl稀释后双链sgRNA

2μl Tango buffer，10X(Thermo Scientific,货号BY5)

1μl DTT，10mM(Thermo Scientific,货号R0862)

1μl ATP，10mM(Thermo Scientific,货号AM8110G)

1μl FastDigest BbsⅠ(Thermo Scientific,货号FD1014)

0.5μl T7ligase(Enzymatics,货号L602L)

灭菌水，补足至20μl。

反应条件：37℃5min，21℃5min。共6个循环.

将上述步骤获得的连接产物转化Stbl3感受态细胞(Thermo Scientific,货号C7373-03) 并涂Amp+平板(50μg/ml)，并挑取克隆。

用如序列表SEQ ID NO.6所示的通用引物U6，用Sanger法测序的方法鉴定获得阳性克隆。 37℃摇床摇菌过夜培养阳性克隆，抽提质粒，获得pAC-SATB1sgRNA-5×PBSa质粒(如序列表SEQ ID NO.5所示)。

实施例3构建人Hela细胞SATB1基因转录激活

1、细胞培养与转染。

(1)Hela细胞接种培养于DMEM高糖培养液中(Thermo Scientific,货号11995-065)，其中含10％FBS(Thermo Scientific,货号10099-141)，penicillin(100U/ml)和streptomycin (100μg/ml)。

(2)在转染前将Hela细胞接种至6孔板中，待70％～80％密度时进行转染。

(3)按照 DNA&siRNA Transfection Reagent(Polyplus transfection，114-01) 操作手册，将400ng pmax-dCas9质粒(序列见SEQ No.7),800ng pAC1393-PUFa-P65-HSF1 质粒(序列见SEQ No.8)和800ng pAC-SATB1sgRNA-5×PBSa质粒转染至每孔细胞中，6～8 小时后换液。

2、Real time Q-PCR鉴定SATB1mRNA表达情况：

转染48小时后，收集转染后的Hela细胞，提取总RNA，随后逆转录为cDNA，再进行PCR。反应体系如下：

10μl SYBRPremix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2X)(TaKaRa，货号RR420A)

0.4μl Forward Primer

0.4μl Reverse Primer(SATB1正反向引物序列见SEQ NO.9和SEQ NO.10；Beta actin正反向引物序列见SEQ NO.11和SEQ NO.12)

0.4μl ROX Reference DyeⅡ(50X)(TaKaRa，货号RR420A)

50ng cDNA模板

灭菌水(补足至20μl)

反应条件为

Step Ⅰ(1个循环)

95℃30s

Step Ⅱ(40个循环)

95℃5s

60℃34s(此步收集荧光)

根据引物和内参CT值，分析SATB1mRNA表达情况(见图2)

3、Western Blot鉴定SATB1敲除情况：

提取对照组和敲除组细胞蛋白，进行蛋白电泳，随后转膜，封闭，加入抗SATB1一抗孵育(Abcam，货号ab92307)过夜，次日去除一抗并洗涤30min，加入二抗(Abcam，ab6721) 孵育1小时，随后再次洗涤30min后显影，结果见图3。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 特异性靶向SATB1基因的sgRNA及其在转录激活中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 1

ttgcggaaga agcagatgtc agg 23

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

caccgttgcg gaagaagcag atgtc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

cgacatctgc ttcttccgca acaaa 25

<210> 4

<211> 3270

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

ggcgcgccga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga tacaaggctg 60

ttagagagat aattggaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta caaaatacgt 120

gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg 180

actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta tatatcttgt 240

ggaaaggacg aaacaccggg tcttcgagaa gacctgttta agagctatgc tggaaacagc 300

atagcaagtt taaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 360

ccaattgggt ctccagattg tatgtagcct gtatgtagcc tgtatgtagc ctgtatgtag 420

cctgtatgta agatcttttt ttgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag 480

tccgtagcgc gtgcgccaat tctgcagaca aatggcggcg cgccgcggcc gcaggaaccc 540

ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga 600

ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 660

agctgcctgc aggggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca 720

caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg 780

gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt 840

tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc 900

gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg 960

atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga 1020

cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc 1080

ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa 1140

aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa 1200

ttttatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac 1260

acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 1320

gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 1380

aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa 1440

taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 1500

gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa 1560

tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta 1620

ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag 1680

taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca 1740

gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta 1800

aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc 1860

gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc 1920

ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca 1980

ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc 2040

acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca 2100

taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac 2160

tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg 2220

cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg 2280

ataaatctgg agccggtgag cgtggaagcc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg 2340

gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac 2400

gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc 2460

aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 2520

aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 2580

actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 2640

gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 2700

atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 2760

atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 2820

ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 2880

gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 2940

cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 3000

tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 3060

cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 3120

ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat 3180

gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 3240

tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 3270

<210> 5

<211> 3273

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

ggcgcgccga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga tacaaggctg 60

ttagagagat aattggaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta caaaatacgt 120

gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg 180

actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta tatatcttgt 240

ggaaaggacg aaacaccgtt gcggaagaag cagatgtcgt ttaagagcta tgctggaaac 300

agcatagcaa gtttaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 360

gtgccaattg ggtctccaga ttgtatgtag cctgtatgta gcctgtatgt agcctgtatg 420

tagcctgtat gtaagatctt tttttgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 480

tagtccgtag cgcgtgcgcc aattctgcag acaaatggcg gcgcgccgcg gccgcaggaa 540

cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg 600

cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg 660

cgcagctgcc tgcaggggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt 720

tcacaccgca tacgtcaaag caaccatagt acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg 780

cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc 840

ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa 900

atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac 960

ttgatttggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt 1020

tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca 1080

accctatctc gggctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt 1140

taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta 1200

caattttatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc 1260

gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 1320

acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 1380

cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga 1440

taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 1500

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 1560

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ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 1680

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 1740

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 1800

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 1860

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 1920

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 1980

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 2040

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 2100

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 2160

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 2220

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ctgataaatc tggagccggt gagcgtggaa gccgcggtat cattgcagca ctggggccag 2340

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aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 2460

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 2520

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tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 2640

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 2700

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 2760

caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 2820

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 2880

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 2940

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 3000

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 3060

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 3120

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 3180

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 3240

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgt 3273

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

atggactatc atatgcttac cgta 24

<210> 7

<211> 8330

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 7

tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60

ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120

aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540

caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600

caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660

cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagg 720

tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagtag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780

tgctaacgca gtcagtgctc gactgatcac aggtaagtat caaggttaca agacaggttt 840

aaggaggcca atagaaactg ggcttgtcga gacagagaag attcttgcgt ttctgatagg 900

cacctattgg tcttactgac atccactttg cctttctctc cacagggaaa aaacaattga 960

caagtttgta caaaaaagca ggctccgaat tcaccggtgc cgccaccatg atcgatggtg 1020

gcggtggtag cgggggaggc ggctccgggg gcggaggcag tatgtaccca tacgatgttc 1080

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