Ⅱ类启动子调控CRISPR系统中sgRNA的表达实现特异性的基因突变

摘要

CRISPR/Cas9系统，作为新兴的强有力的基因编辑以及遗传筛选工具，通过体外基因编辑，在疾病模型的建立以及基因治疗等生物医学领域方面具有广泛的的应用前景。然而，CRISPR/Cas9系统在实际应用过程中仍然面临着一些技术难题，问题之一就在于很难进行精准可控的基因编辑。CRISPR/Cas9系统在行使基因编辑功能的过程中主要包括两个成员，Cas9蛋白和单链的引导RNA（sgRNA）。其中Cas9蛋白是由RNA聚合酶Ⅱ(polⅡ)类启动子调控表达的一种核酸酶，可以进行组织细胞的特异性表达调控。sgRNA用于识别靶位点，其转录是受到RNA聚合酶Ⅲ(polⅢ)类启动子调控的。而Ⅲ类启动子调控表达的一大缺陷就在于难以控制，受其调控的基因一般会呈现出类似于看家基因的“无处不在”表达的特点，因此使sgRNA也能以一种组织特异性表达调控的方式进行表达更有利于组织特异性基因突变的产生。本文中对经典的CRISPR/Cas9系统进行巧妙的修改，使sgRNA也能在RNA聚合酶Ⅱ类启动子的调控下进行表达，并进一步通过使用细胞特异性启动子来调控sgRNA的表达从而实现了细胞特异性的基因突变。
　　为了能获得RNA聚合酶Ⅱ类启动子调控的sgRNA，构建获得microRNA-shRNA与sgRNA镶嵌（miRsh-sgRNA）盒。该结构中的sgRNA是受RNA聚合酶Ⅱ类启动子调控的，并能够从红色荧光蛋白的3'非翻译区(UTR)转录出来，为了检测功能性的sgRNA能否在此结构中顺利产生，将广谱性启动子EF1a调控的miRsh-sgp53表达载体以及Cas9-P2A-EGFP表达载体共同转染小鼠成纤维细胞（MEFs）和小鼠胚胎干细胞(mESCs)。转然后两基因一般会呈现出类似于看家基因的“无处不在”表达的特点，因此使sgRNA也能以一种组织天采用流式细胞分选(FACS)的方式分选出双荧光蛋白表达的细胞，并对分选出的细胞进一步进行T7EN1酶切及sanger测序，结果表明无论是MEFs还是mESCs，EF1a启动子调控miRsh-sgp53产生的sgRNA都能够引导Cas9蛋白对p53基因进行双链切割(DSB)。为了进一步证实是否miRsh-sgRNA盒能够以细胞类型特异性的方式产生基因突变，构建获得小鼠胚胎类启动子调控的。而Ⅲ类启动子调控表达的一大缺陷就在于难以控制，受其调控的基因一般会呈现出类干细胞特异性的Oct4启动子（mOct4P）来调控sgRNA表达的miRsh-sgp53盒，将该载体以及EF1a启动子调控表达的Cas9-P2A-EGFP表达载体共同转染MEFs和mESCs两天后，在mESCs中，能够观察到红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白共同表达的细胞，但在MEFs中，仅有绿色荧光蛋白的表达，这一现象表明sgRNA以细胞类型特异性的方式产生。通过流式细胞分选的方式分选出这两类细胞进一步进行T7EN1酶切及sanger测序分析。发现p53基因的突变仅发生在小鼠胚胎干细胞中，而没有发生在小鼠成纤维细胞中。此外，T7EN1酶切及sanger测序表明构建的这种由RNA聚合酶Ⅱ类启动子调控CRISPR/Cas9系统较经典的CRISPR/Cas9系统在所有被检测的细胞中，均没有带来额外的脱靶效应。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 CRISPR／Cas9系统

1．1．1 CRISPR／Cas系统的发现

1．1．2 CRISPR／Cas系统的结构

1．1．3 CRISPR／Cas系统的作用机理

1．1．4 CRISPR／Cas系统的分类

1．1．5 CRISPR／Cas9基因编辑技术研究进展

1．1．6 CRISPR／Cas9基因编辑技术的应用

1．1．7 CRISPR／Cas9系统的诱导性调控

1．2 miRNA-shRNA嵌套结构

1．2．1 RNA干扰技术

1．2．2 miRNA-shRNA嵌套结构的出现

1．3 p53基因概述

1．4 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 质粒

2．1．2 工具酶、试剂盒及其它试剂

2．1．3 引物序列

2．1．4 主要器材

2．1．5 缓冲液及主要试剂的配制

2．1．6 主要生物学分析软件

2．2 实验方法

2．2．1 载体骨架的构建

2．2．2 miRsh-sgp53的构建

2．2．3 RNA聚合酶Ⅱ类启动子调控的miRsh-sgp53载体的构建

2．2．4 细胞培养及转染

2．2．5 流式细胞仪分选阳性细胞

2．2．6 T7EN1酶切实验

2．2．7 sanger测序

3 结果与分析

3．1 RNA聚合聚合酶Ⅱ类启动子调控的miRsh-sgp53载体的构建

3．2 EF1a调控miRsh-sgp53盒内的sgRNA的表达情况

3．3 干细胞特异性启动子调控miRsh-sgRNA盒内的sgRNA的表达情况

3．4 miRsh-sgRNA盒差生脱靶效应情况

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文