一种真核细胞III型启动子表达CRISPR sgRNA的方法及其应用

摘要

本发明是利用一个真核细胞III型启动子（U6或H1）启动由Drosha切割位点串联的多个发卡结构小RNA的表达，在真核细胞内表达后可以产生多个有生物活性的CRISPR？sgRNA，以U6-sgRNA-shRNA-sgRNA的结构为例，这种U6启动表达的结构在一次转录中产生含有多个sgRNA和shRNA的初级转录本，在真核细胞中这些sgRNA经过加工后可以分别识别各自的靶位点，从而指导Cas9蛋白打靶多个位点，为多基因编辑打下基础。相比于传统的分别表达多个单一gRNA的方法和植物上新近报道的tRNA-gRNA系统，本发明的结构更简单，构建更方便。此外，本发明还可以通过Golden？Gate的方法继续串联shRNA-sgRNA的序列打靶更多的位点或者表达多个shRNA干扰基因的表达。