一株有效防治樱花根癌病的甲基营养型芽孢杆菌YH-18及其应用

摘要

本发明公开了一株有效防治樱花根癌病的甲基营养型芽孢杆菌YH‑18及其应用，该甲基营养型芽孢杆菌分类命名为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)YH‑18，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2018006，保藏日为2018年1月4日，保藏地址：中国武汉武汉大学。本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌YH‑18，为植物内生生防促生细菌，对樱花根癌病有较好的防治效果，同时对樱花的生长具有促生作用。该甲基营养型芽孢杆菌YH‑18培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株有效防治樱花根癌病的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)YH-18及其应用。

背景技术

樱花是世界著名的观赏花木，隶属于蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)，分布于北半球温暖地区，为北温带植物。樱花系浅根性植物，喜微酸疏松肥沃、排水良好的土壤和背风向阳湿润的环境。我国拥有十分丰富的樱花资源，远远超过日本及相邻国家，分布范围非常广泛，从东北到西南都有分布，其中有许多观赏价值极高的种类。近年来樱花因其株型优美、花色艳丽、花期延续期长且具有极高的观赏价值而引起苗木培育者的广泛重视，但是随着种植面积的不断增加，所受病害侵染的面积也不断扩大，其中以樱花根癌病、樱花穿孔病及樱花流胶病最为严重。

根癌病也称冠瘿病、根头癌、根肿病，它是由根癌农杆菌引起的且具有严重危害的细菌性病害，该病害在全世界范围均有不同程度的发生。宋玉双等人研究发现，土壤农杆菌的的寄主范围非常广泛，可以侵染93个科331属643余种不同植物，其中以危害双子叶植物为主，在特殊条件下也可侵染裸子植物和单子叶植物。根癌病的侵染途径主要是通过伤口。发病部位主要为根颈、侧根和枝干，典型症状是在病发部位形成形状大小不一的肿瘤。发病部位初期的病状为先形成乳白色、如豆粒般微小的瘤状物，之后随着苗木的生长瘤状物逐渐长大，颜色渐深，表面由光滑变成粗糙，进而由内部木质化而变的质地坚硬，呈现出黑褐色，干枯龟裂后变成不规则形状，该病害发生严重时瘤体可以将根颈或是枝条包围。患病早期，苗木或树体的地上部分无明显症状。随着肿瘤的变大，植株虚根变少，树势由强变弱，进而造成叶片黄化，提早落叶。发病严重时，植株在营养吸收和水分运输方面均会受到影响，植株生长减慢，产量逐年下降，最后直至死亡。

樱花根癌病由根癌土壤杆菌引起，在生产上造成了非常大的损失，1996年被列入国内森林检疫对象名单。樱花得病后最明显的症状是在根茎处产生球状或半球状瘤状物，瘤状物随着苗木的生长而慢慢长大，严重影响了樱花苗木生长速度和树势，降低了观赏品质和商品价值。病害发生轻时引起提前落叶，严重时可引起整树枯死，被花农称为樱花的“癌症”。

目前针对樱花根癌病的防治手段主要以化学防治和生物防治为主。Utkhede RS等(1993)在苹果田间试验中用氢氧化铜溶液处理发病幼树的根部，结果发现试验组根瘤数目较之对照组减少；王慧敏等(1995)通过测定杀菌剂和抗菌素对3种生物型根癌农杆菌的抑菌作用，研究发现硫酸链霉素对全部根癌菌的抑制作用都很好；福美双对生物III型根癌农杆菌所有菌株都有较强抑制作用；青霉素钠只对生物III型有较好的抑制作用；其他药剂均无作用。但是长期的使用化学农药会对环境和生态平衡带来一系列严重问题，而生物防治近些年来因其成本低、污染小、防治效果显著而备受青睐，一些科学工作者在根癌病防治工作期间也筛选出了不同种类且防治效果显著的生防菌株。Kerr教授从桃树冠瘿病患病植株根际土壤中分离得到的菌株K84，可以有效抑制致病型根癌土壤杆菌生长；Akira(2007)从日本的葡萄苗木上分离得到的葡萄土壤杆菌VAR03-1，无致病性，且能产生一种细菌素，可以抑制番茄和葡萄上由致病性葡萄土壤杆菌G-Ag-27所引起的肿瘤的形成。

芽孢杆菌因培养周期短、生产方便而日益成为生防菌的优势菌株。它是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，好氧或者兼性厌氧生活，能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和抗有机溶剂的内生孢子，所产芽孢可制成粉剂、可湿性粉剂等各种剂型，且与化学农药混用后不失活，是理想的生防菌筛选对象。

苜蓿是一般用于医院呼吸道感染细菌致病性测定的模式植物。2002年Laura用一种在CF病人体内常检测到的病原菌Psudomnoas aeruginosa对苜蓿和老鼠分别接种，比较研究结果发现，苜蓿可以代替老鼠作为模式植物测定该菌对哺乳动物的毒性，甚至苜蓿模型表现出了比老鼠模型更高的灵敏度(Laura et al.，2002)。随后，Steve对Bcc做了同样的比较测试，发现Bcc在苜蓿上的发病率与在老鼠上的结果呈正相关，可以代替老鼠作为测定Bcc对动物毒性的模式植物(Steve et al.，2003)。用苜蓿模型可简单快捷的检测出Bcc菌株对哺乳动物是否具有致病性，这为我们在农业和环保中安全利用Bc奠定了坚实的基础。

近些年来，有关芽孢杆菌在樱花根癌病生物防治领域的研究鲜有报道。因此，将芽孢杆菌用于樱花根癌病的生物防治工作，有利于对该病害更好的防治。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种有效防治樱花根癌病的甲基营养型芽孢杆菌YH-18。本发明的另一目的是提供上述甲基营养型芽孢杆菌的用途。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一株有效防治樱花根癌病的细菌，分类命名为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)YH-18，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2018006，保藏日为2018年1月4日，保藏地址：中国武汉武汉大学。

该有效防治樱花根癌病的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)YH-18，是一株从健康樱花枝干中分离筛选获得的对根癌病菌具有拮抗作用的生防细菌菌株。甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)YH-18在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落较小，白色，直径一般2-3mm，圆形，边缘不整齐，表面粗糙有菌褶，菌体直杆状，大小为0.7×(1～2)μm。革兰氏染色表现为阳性；测得16SrDNA大部分序列1418bp，具体如SEQ IDNO.1所示。将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与YH-18菌株相似性最高的是Bacillus methylotrophicus，同源性都达到100％。构建进化树发现，YH-18与Bacillus methylotrophicus同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近。通过生理生化试验发现该菌吲哚反应为阳性；接触酶反应结果为阳性；甲基红反应结果为阳性；淀粉水解试验为阳性；V-P试验、硝酸盐还原反应和柠檬酸盐反应结果也都呈现阳性；因此判定该菌为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，分类命名为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)YH-18。

所述的甲基营养型芽孢杆菌YH-18在防治樱花根癌病中的应用。

所述的甲基营养型芽孢杆菌YH-18的代谢产物在防治樱花根癌病中的应用。

所述的应用，所述的代谢产物为甲基营养型芽孢杆菌YH-18的发酵液。

所述的甲基营养型芽孢杆菌YH-18在抑制根癌农杆菌中的应用。

所述的甲基营养型芽孢杆菌YH-18的代谢产物在抑制根癌农杆菌中的应用。

所述的应用，所述的代谢产物为甲基营养型芽孢杆菌YH-18的发酵液。

所述的甲基营养型芽孢杆菌YH-18在促樱花生长中的应用。

所述的甲基营养型芽孢杆菌YH-18的代谢产物在促樱花生长中的应用。

所述的应用，所述的代谢产物为甲基营养型芽孢杆菌YH-18的发酵液。

上述甲基营养型芽孢杆菌YH-18防治效果较好的发酵条件如下：

培养基：每1000mL蒸馏水，含牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH7.2。

工艺条件为：pH6～7，通气量1∶1，28℃～30℃，摇床转速180～200转/分，24小时。

通过上述发酵工艺得到的发酵液即为一种微生物杀菌剂。该发酵液与水按照1∶5比例稀释并加入适量土壤打成泥浆对植物裸根进行蘸浆处理即可发挥其杀菌作用。

有益效果：与现有技术相比，本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌YH-18，为植物根际生防促生细菌，对樱花根癌病有较好的防治效果，同时对樱花的生长具有促生作用。该甲基营养型芽孢杆菌YH-18培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1是甲基营养型芽孢杆菌YH-18的抑菌结果图；

图2是甲基营养型芽孢杆菌YH-18的发酵滤液对根癌土壤杆菌的拮抗作用结果图；

图3是甲基营养型芽孢杆菌YH-18对温室指示植物根癌病的抗病作用结果图；

图4是甲基营养型芽孢杆菌YH-18对温室樱花根癌病的抗病作用结果图；

图5是甲基营养型芽孢杆菌YH-18对苜蓿苗接种实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：甲基营养型芽孢杆菌YH-18菌株通过琼脂扩散法测定它们对根癌病菌菌株生长的抑制作用。

将纯化培养的根癌农杆菌cfcc1369(购买自中国林业微生物菌种保藏管理中心)，用LB培养基摇培制成10⁷～10⁸cfu/mL菌悬液，将根癌农杆菌cfcc-1369菌悬液200uL涂布在LB固体培养基，使用打孔器将滤纸制作成直径0.6mm的圆片，将3枚滤纸片点接至涂布好的平板上。用LB培养基摇培至10⁷～10⁸cfu/mL的甲基营养型芽孢杆菌YH-18菌悬液10uL点在滤纸片上，将培养皿封口放置28℃培养箱中培养过夜。结果表明如图1所示，图1中点A、B、C为甲基营养型芽孢杆菌YH-18对根癌农杆菌cfcc-1369形成的抑菌圈，图1中点D为CK对照，可见甲基营养型芽孢杆菌YH-18的抑菌效果较好。

实施例2：甲基营养型芽孢杆菌YH-18菌株发酵液与根癌病菌菌株进行平板抑菌能力的测定。

将甲基营养型芽孢杆菌YH-18菌株的甘油保藏液按2％的接种量接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，摇培24h。将细菌发酵液用0.22μm的细菌过滤器过滤即得细菌发酵滤液。将摇培至10⁷～10⁸cfu/mL的根癌农杆菌cfcc-1369菌悬液200uL涂布在LB平板上，使用打孔器将滤纸制作成直径0.6mm的圆片，将3枚滤纸片点接至涂布好的平板上。将10uL甲基营养型芽孢杆菌YH-18发酵滤液点接至滤纸片上，将培养皿封口置于28℃培养箱中培养过夜。结果表明如图2所示，左图为甲基营养型芽孢杆菌YH-18发酵滤液对根癌农杆菌cfcc-1369形成良好的抑菌圈，右图为对照，可见甲基营养型芽孢杆菌YH-18发酵滤液抑菌较好。

实施例3：甲基营养型芽孢杆菌菌株YH-18对温室指示植物根癌病的抗病作用

购买番茄幼苗，将其置于混合培养土中培养。待幼苗伸出土面15cm左右时接种(选取长势相似的健壮幼苗)，在接种前半小时取出待接菌甲基营养型芽孢杆菌YH-18，使培养菌的温度恢复至室温，然后开始接种。先将解剖针在酒精灯上烧灼灭菌，待解剖针冷却至室温后，挑取分离纯化后的细菌刺至幼苗的茎部，用脱脂药棉蘸取无菌水在接种处用封口膜绑缚，保湿5～7d；接种樱花根癌农杆菌cfcc-1369前半小时取出待接菌，使培养菌的温度恢复至室温，然后开始接种。先将解剖针在酒精灯上烧灼灭菌，待解剖针冷却至室温后，挑取分离纯化后的细菌刺至幼苗根茎处，用脱脂药棉蘸取无菌水在接种处用封口膜绑缚，保湿5～7d。接种菌株YH-18和病原菌cfcc-1369；单独接种病原菌菌株作为对照、不接菌作为空白对照，共三个处理，每个处理做5个重复，在室温为23士5℃的温室里培养生长。1周后观察是否发病。结果发现仅接种桃根癌病病菌的植株茎部明显肿大，同时接种菌株YH-18和病原菌菌株的植株茎部略微肿大，表明YH-18有一定的抗病作用(图3，左为同时接种YH-18和病原菌，右为仅接种病原菌)。

实施例4：甲基营养型芽孢杆菌YH-18对温室樱花苗根癌病的防治效果。

将一年生樱花种植于灭菌土中，置于25℃温室培养15d，选取长势相近的樱花进行接种(每个处理18个重复)。每株樱花接种根癌病原菌cfcc-1369(NA液体培养基，培养24h)2mL，接种斜面保存的甲基营养型芽孢杆菌YH-18接种至NA培养基用培养至10⁷～10⁸cfu/mL，用无菌水将甲基营养型芽孢杆菌稀释到浓度1×10⁸cfu，制成菌悬浊液备用，用无菌手术刀于樱花主根划1cm创口，以无菌棉球吸取根癌土壤杆菌包裹于创口处；7d后用无菌移液管吸取10mL甲基营养型芽孢杆菌悬浊液紧贴樱花苗根系将其注入土壤，然后覆土填平至塑料盆。以单接根癌土壤杆菌的樱花苗作为发病对照，6个月后观察并统计樱花的发病率和病瘤直径。甲基营养型芽孢杆菌YH-18在温室樱花苗根癌病防治上有显著的效果(表1、图4)。图4上图为接种根癌病杆菌的发病对照，下图为接种根癌农杆菌与YH-18的防治处理。

表1 JK-XZ3对温室樱花苗根癌病的防治效果

实施例5：甲基营养型芽孢杆菌菌株YH-18野外防治樱花根癌病的抗病效果

将甲基营养型芽孢杆菌菌株YH-18施用于根癌病严重发生的野外田间地块，取母菌液2L，加水定容10L桶中，稀释5倍，搅拌混匀，加适当土搅拌至呈粘稠状，做成浆液。将裸根樱花苗逐一放入桶中浸没根部，待表面包裹一层泥浆后取出，放入事先挖好的土穴栽植。试验结果显示该菌株对一年生新造林地健康樱花具有良好的防治根癌病效果。根部沾浆法施用该菌株的100棵樱花苗木，结果见表2。因此判定该菌株能够有效防治樱花根癌病。除此之外YH-18菌株对一年生樱花苗还具有优良的促生作用(表3)。

表2一年生樱花实验苗发病统计

表3一年生樱花苗生长量统计

处理苗高(cm)地径(mm)CK12.13.4YH-1834.26.8

实施例5：甲基营养型芽孢杆菌菌株YH-18对洋葱致病性测定。

致病性测定参照Sijam等(2005)的方法，用注射器取甲基营养型芽孢杆菌菌株YH-18菌悬液(1×10⁷～10⁸cfu/mL)在洋葱鳞茎上两点对称注射(深度为1～2cm)，每点注射量为1mL。以灭菌水处理为对照。所有处理均重复3次，置于26℃培养，4～5天后检查结果。洋葱鳞茎接种试验表明，注射接种甲基营养型芽孢杆菌菌株YH-18不引起洋葱鳞茎的腐烂，只是在接种处稍有干瘪凹陷。以上说明甲基营养型芽孢杆菌菌株YH-18不是植物病原细菌，对植物具有安全性。

实施例6：甲基营养型芽孢杆菌菌株YH-18对苜蓿的接种试验。

将YH-18接种到NB培养基中，30℃下震荡(150mrp)培养24h，用无菌水调节菌悬液浓度到10⁹左右用于接种。用Laura的方法来准备要接种的苜蓿种子(Laura>

苜蓿接种结果显示，无论是CK还是接种处理，均无发病症状(接种点附近坏死、黄化和根畸)出现。苜蓿是代替老鼠作为测定Bcc对动物毒性的模式植物(Steve et al.，2003)，用苜蓿模型可简单快捷的检测出Bcc菌株对哺乳动物是否具有致病性。上述试验结果说明甲基营养型芽孢杆菌菌株YH-18对哺乳动物没有毒害性。图5中左为甲基营养型芽孢杆菌YH-18接种，中为吡咯伯格霍尔德氏菌致病型LMG1222，右为清水对照。

序列表

<110>南京林业大学

<120>一株有效防治樱花根癌病的甲基营养型芽孢杆菌YH-18及其应用

<130>100

<160>1

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>1387

<212>DNA

<213>Bacillus methylotrophicus

<400>1

acatgcaagt cgagcgacag atgggagctt gctgcctgat gttagcggcg gacgggtgag60

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