一种可诱导稳定表达小反刍兽疫病毒P蛋白的细胞株及其用途

摘要

本公开提供了一种可诱导稳定表达小反刍兽疫病毒P蛋白的细胞株，该细胞株的保藏编号为CGMCC NO.14317。可选地，所述小反刍兽疫病毒P蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。另一方面，本公开还提供了如上所述的细胞株在筛选药物中的用途。另一方面，本公开还提供了如上所述的细胞株在制备疫苗中的用途。另一方面，本公开还提供了如上所述的细胞株在制备检验试剂盒中的用途。通过上述技术方案，本发明提供了可诱导稳定小反刍兽疫病毒P蛋白表达的细胞株，一方面能够用于筛选药物、制备疫苗和检验抗体；另一方面，对于深入研究P蛋白的致病机理及其在小反刍兽疫的预防与控制方面具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物技术领域和动物卫生健康领域，具体地，涉及一种可诱导稳定表达小反刍兽疫病毒P蛋白的细胞株及其用途。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)俗称羊瘟，是世界动物卫生组织(OIE)规定的必须报告传染病，由副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(Peste despetits ruminants virus,Small ruminant morbillivirus,PPRV)感染小反刍动物引起的一种以突然发热、眼鼻排出分泌物、口腔溃疡、肺炎、腹泻为特征的传染病，山羊高度易感。该病于1942年首次在非洲发生，随后在非洲大陆广泛传播，现已波及中东、西亚、南亚等地区。该病于2007至2008年在西藏阿里和那曲地区先后暴发；2013年冬，该病又在新疆暴发；由于山羊和绵羊的大面积流动，该病目前已迅速传播，至2014年9月不到一年的时间,全国共有22个省或自治区的256个县暴发疫情，对我国的动物卫生健康已经产生严重威胁。

小反刍兽疫病毒(PPRV)为单股负链RNA病毒，基因组大小为15948个核苷酸，基因组3’末端为前导序列，5’末端为尾随序列，6个编码框基因排列顺序为3’-N-P-M-F-H-L-5’，依次编码6个结构蛋白，即核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)和大蛋白(L)，P基因还编码2个非结构蛋白C和V。P蛋白的基因总长度为1655个核苷酸，开放阅读框长度为1530个核苷酸，编码509个氨基酸。P蛋白的分子量约为54.8kd，在病毒RNA的转录和复制过程中发挥作用。

研究表明，PPRV的P蛋白在病毒RNA的转录和复制过程中发挥作用：P蛋白能与不同形式的N蛋白结合或单独与N蛋白-RNA模板复合物结合激活转录；P蛋白与L蛋白相结合形成依赖于RNA的RNA聚合酶，然后与N蛋白-RNA模板结合形成核糖核蛋白复合体，进行病毒RNA的转录和复制。另外，疱疹病毒P蛋白在阻断宿主干扰素反应通路中也发挥重要作用，P蛋白主要通过阻断JANUS激酶1(JAK1)对信号传导及转录激活因子1(STAT1)的磷酸化阻断干扰素反应。

目前对小反刍兽疫病毒结构蛋白的研究主要集中于H、N、F和M蛋白，并针对H、N、F蛋白开展了包括单克隆抗体制备、抗体检测试纸条制备和抗原肽筛选等相关应用研究，对P蛋白的基因仅有少数毒株序列特性分析的报道。但是，目前还难以实现P蛋白在真核细胞株中的可诱导稳定高效表达。

发明内容

为了实现P蛋白在真核细胞株中的可诱导稳定高效表达，本公开提供了一种可诱导稳定表达小反刍兽疫病毒P蛋白的细胞株，该细胞株的保藏编号为CGMCC NO.14317。

可选地，所述小反刍兽疫病毒P蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

另一方面，本公开还提供了如上所述的细胞株在筛选药物中的用途。

另一方面，本公开还提供了如上所述的细胞株在制备疫苗中的用途。

另一方面，本公开还提供了如上所述的细胞株在制备检验试剂盒中的用途。

通过上述技术方案，本发明提供了可诱导稳定小反刍兽疫病毒P蛋白表达的细胞株，一方面能够用于筛选药物、制备疫苗和检验抗体；另一方面，对于深入研究P蛋白的致病机理及其在小反刍兽疫的预防与控制方面具有重要意义。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物材料保藏

本发明的脑胶质瘤细胞是本发明的发明人筛选得到了一株可诱导稳定高效地表达小反刍兽疫病毒P蛋白的细胞株，其保藏编号为CGMCC No.14317，保藏日期为2017年8月25日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为P蛋白稳定克隆细胞系。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1A是PPRV的P基因编码序列经扩增后插入pcDNA4to载体的限制性酶切位点的质粒结构示意图。

图1B是pCDNA6/TR质粒结构示意图。

图2A是强力霉素可明显诱导293TREX-PPRV-P细胞株中PPRV-P蛋白的表达的结果图。

图2B是P蛋白的表达呈现出诱导时间依赖的结果图。

图2C是P蛋白的表达呈现出强力霉素剂量依赖的结果图。

图3是强力霉素添加组的PPRV-P基因的表达量相对于对照组(未添加Dox)明显升高的结果图。

图4是强力霉素诱导之后的细胞出现明显的红色荧光的结果图。

图5是采用PPRV阳性和阴性血清进行免疫印记分析本申请的细胞表达的P蛋白的抗原性的结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开提供了一种可诱导稳定表达小反刍兽疫病毒P蛋白的细胞株，该细胞株的保藏编号为CGMCC NO.14317。

上述细胞株是将PPRV的P基因编码序列经扩增后插入pcDNA4to载体的限制性酶切位点，产生pCDNA4-To-PPRV-P重组表达载体；然后将pCDNA4-To-PPRV-P质粒转入已稳定转入pcNDA6/TR质粒的TREx-293细胞，接着用稻瘟菌素和博来霉素筛选出稳定转入pcNDA6/TR和pCDNA4-To-PPRV-P两种质粒的细胞克隆存活下来的细胞，继续培养并单克隆化，最终筛选到一个稳定转染的细胞克隆，编号为293TREx-PPRV-P，该细胞克隆的表达可被强力霉素(Dox)控制；将该细胞克隆进行保藏，即得到保藏编号为CGMCC NO.14317的细胞株。

可选地，其中，所述小反刍兽疫病毒P蛋白的编码基因的核酸序列为SEQ ID NO.1。

SEQ ID NO.1为：ATGGCAGAAGAACAAGCATACCATGTCAACAAGGGACTGGAATGTATCAAGTCTCTCAAAGCCTCTCCCCCGGATCTATCCACCATCAAAGATGCCCTTGAGAGCTGGAGAGAGGGGCTTAGCCCCTCAGGCCGTGCAACACCGAACCCTGATACGTCCGAGGGAGACCATCAGAATATCAACCAATCATGCTCACCAGCAATCGGATCAGACAAAGTCGACATGTCTCCTGAAGATAATCTCGGATTTAGAGAGATCACTTGTAATGACAGTGAGGCTGGGCTCGGAGGAGTTCTGGATAAAGGATCCAACTCTCAAGTACAGCGTTACTATGTTTATAGCCACGGGGGTGAAGAGATTGAAGGACTCGAGGATGCTGACTCTCTCGTGGTTCAAGCAAATCCTCCAGTTACTGACACCTTCAATGGAGGAGAGGATGGATCTGACGACAGCGATGTGGACTCTGGCCCAGATGATCCCGGCAGAGATCCTCTATATGACCGGGGATCTGCTGCCGGCAATGATGTCTCTAGGTCAACAGATGTCGAAAAATTAGAAGGTGATGACATTCAAGAAGTTCTTAACTCCCAGAAGAGTAAAGGAGGAAGATTCCAAGGCGGGAAAATCTTGCGGGTCCCGGAAATACCCGATGTCAAGAACCCTAGACCATCAGCCCAATCAATTAAAAAGGGCACAGACGGGAACTCAGTCTTATCTGGAACGGTGACAGAGTGTTCATCGATAAGTGGTGCAACCCAAGCTGTGCCAGAGTCCAGATGGGAGTCATCAGAGCGAAATGCGTCTGTGGGGAGTGTCCCCAAATCTGCGAGGAGTGCAAAGACGATCCAGGGGTTGACACAAGAATCTGGTACCATAGCATCACTGACTCAGCCTAAAGAGAATGACTCCGAGTTTGAGTATGAGGATGATCTATTCACAGAGATGCAGGAGATTCGTGCAAGCATTGCTAAGATCCATGATGACAACAAAACTATCCTCTCAAAACTTGATTCTCTACTGTTATTGAAAGGAGAAATCGATACTATCAAGAAACAAATCAGCAAACAAAATATAAGTATATCTACCATTGAGGGCCATCTATCCAGTATAATGATAGCCATCCCGGGCTTTGGGAAGGACATCAAGGACCCAACATCTGAGGTTGAGTTGAACCCGGATTTGAGACCTATAATCAGCCGTGATTCTGGCAGGGCTCTTGCGGAGGTCCTCAAGAAACCCGCTGTTGATAGGTCTCAGAAAAGCGGAATCAAAGTCAACTCCGGTTCAAAGGGTCAGCTCCTTAAGGATCTCCAGCTAAAACCTGTCGACAAACAGGCAAGCTCTGCAATCGAGTTTGTTCCATCTGACCATGAATCATCCAGGAGTGTCATCCGCTCCATAATCAAGTCGAGCAAGCTTAACATTGATCACAAGGACTATCTTCTAGATTTACTGAATGATGTGAAAGGCTCCAAGGATCTTAAGGAATTCCACAAGATGCTAACAGCCATTCTTGCCAAGCAGCCGTAA。

另一方面，本公开还提供了如上所述的细胞株在筛选药物中的用途。

更具体地，所述药物为治疗小反刍兽疫的药物。其中，筛选药物的过程可以包括：使用如上所述的细胞株检测待测药物候选物对小反刍兽疫病毒P蛋白与其他小反刍兽疫病毒蛋白的结合的影响，如果待测药物候选物能够抑制小反刍兽疫病毒P蛋白与其他小反刍兽疫病毒蛋白的结合，则指示所述待测药物候选物能够治疗小反刍兽疫；所述其他小反刍兽疫病毒蛋白包括但不限于小反刍兽疫病毒N蛋白、小反刍兽疫病毒M蛋白、小反刍兽疫病毒F蛋白、小反刍兽疫病毒H蛋白和小反刍兽疫病毒L蛋白中的至少一种。

另一方面，本公开还提供了如上所述的细胞株在制备疫苗中的用途。

更具体地，所述疫苗为预防小反刍兽疫的疫苗。其中，所述疫苗的制备方法可以包括：使用如上所述的细胞株制备纯化的小反刍兽疫病毒P蛋白，然后将所述纯化的小反刍兽疫病毒P蛋白与免疫佐剂混合。

另一方面，本公开还提供了如上所述的细胞株在制备检验试剂盒中的用途。

具体地，所述检验试剂盒为用于检验待测动物是否携带抗小反刍兽疫病毒的抗体的检验试剂盒。更具体地，所述检验试剂盒为用于检验待测动物是否携带抗小反刍兽疫病毒P蛋白的抗体的检验试剂盒。如果待测动物接触过小反刍兽疫病毒、曾感染过小反刍兽疫病毒或曾接种过小反刍兽疫病毒的疫苗，则可能被上述检验试剂盒检验出来。

其中，如上所述，所述小反刍兽疫病毒P蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

以下，通过实施例进一步详细说明本发明。

实施例1

本实施例用于详细说明：可被强力霉素诱导的293TREX-PPRV-P细胞株的建立。

实验所用材料：pCDNA4/TO质粒，pCDNA6/TR质粒，TREx-293细胞。

实验具体步骤：PPRV的P基因编码序列经扩增后插入pcDNA4to载体的限制性酶切位点如图(1A)，产生pCDNA4-To-PPRV-P重组表达载体，测序验证序列正确。将pCDNA4-To-PPRV-P质粒转入已稳定转入pcNDA6/TR质粒的TREx-293细胞，如图(1B)，加入10μg/mL的稻瘟菌素(blasticidin)和300μg/mL的博来霉素(Zeocin)以筛选出稳定转入pcNDA6/TR和pCDNA4-To-PPRV-P两种质粒的细胞克隆存活下来的细胞，不断增殖发展为细胞系，培养于含有10％胎牛血清、10μg/mL的稻瘟菌素和300μg/mL的博来霉素的DMEM培养基中并单克隆化，最终筛选到一个稳定转染的细胞克隆，编号为293TREx-PPRV-P，该细胞克隆的表达可被强力霉素(Dox)控制；将该细胞克隆进行保藏，即得到保藏编号为CGMCC NO.14317的细胞株。

实施例2

本实施例用于详细说明：强力霉素诱导的293TREX-PPRV-P细胞株中P蛋白的表达。

实验所用细胞：293TREX-PPRV-P细胞株。

实验具体步骤：将293TREX-PPRV-P细胞株接种于六孔板上并继续培养24小时后，在处理组的培养基中添加(10ng/mL)的强力霉素，并继续培养24小时(或者48、72小时)后提取总蛋白和总RNA；对上述蛋白样品进行免疫印记分析，与未添加强力霉素的对照组相比，强力霉素可明显诱导293TREX-PPRV-P细胞株中PPRV-P蛋白的表达(见图2A)，并且P蛋白的表达呈现出诱导时间依赖(见图2B)模式和强力霉素剂量依赖模式(见图2C)；对上述总RNA样品进行反转录PCR和荧光相对定量PCR分析表明，强力霉素添加组的PPRV-P基因的表达量相对于对照组(未添加Dox)明显升高(见图3)。同样将293TREX-PPRV-P细胞接种于预先铺有盖玻片的六孔板上并继续培养24小时后，在处理组的培养基中添加(10ng/mL)的强力霉素,并继续培养24h后，用4％多聚甲醛固定细胞后，对细胞进行间接免疫荧光分析。染色结果显示与未添加强力霉素的对照细胞相比较，强力霉素诱导之后的细胞出现明显的红色荧光(见图4)，证明P蛋白获得表达。

实施例3

本实施例用于详细说明：应用强力霉素诱导的293TREX-PPRV-P细胞中表达的P蛋白检测PPRV感染。

实验具体步骤：将293TREX-PPRV-P细胞接种于六孔板上并继续培养24小时后，在处理组的培养基中添加(10ng/mL)的强力霉素，并继续培养24h后提取总蛋白；将强力霉素诱导表达的P蛋白作为诊断抗原，分别采用PPRV阳性和阴性血清进行免疫印记分析。结果显示强力霉素诱导表达的P蛋白可以清晰的检测到阳性血清中P蛋白的抗体，阴性血清中则无信号，说明该细胞株表达的P蛋白具有良好的抗原性，并适用于PPRV的免疫印迹分析与诊断(见图5)。

通过上述实施例1-3的结果可以看出，本公开的CGMCC No.14317的细胞可诱导稳定高效地表达小反刍兽疫病毒P蛋白，并且能够用于筛选药物、制备疫苗和检验抗体。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 一种可诱导稳定表达小反刍兽疫病毒P蛋白的细胞株及其用途

<130> 9439CAIQ

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1530

<212> DNA

<213> 小反刍兽疫病毒(Peste-des-petits-ruminants virus)

<400> 1

atggcagaag aacaagcata ccatgtcaac aagggactgg aatgtatcaa gtctctcaaa 60

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