一种转肽活力提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法

摘要

本发明公开了一种转肽活力提高的γ‑谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法，属于基因工程领域。本发明的突变体是在SEQ ID N0.3所示的氨基酸的基础上，将第463位氨基酸由苏氨酸突变成天冬氨酸。本发明得到的突变体在枯草芽孢杆菌中表达，γ‑谷氨酰转肽酶突变体酶的转肽反应活力较突变前提高22.6％，水解反应活力降低了90％。本发明表明463位氨基酸残基对γ‑谷氨酰转肽酶的转肽反应活力有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。本发明所得的γ‑谷氨酰转肽酶突变体可用于制备L‑茶氨酸。

说明书

技术领域

本发明涉及一种转肽活力提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

L-茶氨酸，是存在于茶类植物中的一种天然氨基酸，决定茶叶的品质和风味，对人体具有多方面的健康功效，其作为一种食品组分及饮品添加剂的需求量日益增加。目前，茶氨酸生产的研究主要集中在酶转化法，而其中γ-谷氨酰转肽酶又以其独特的优越性脱颖而出。

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT，EC2.3.2.2)负责催化γ-谷氨酰类化合物的γ-谷氨酰分子转移到其他氨基酸、短肽等受体分子上(转肽反应)或水分子上(水解反应)，广泛存在于哺乳动物和细菌中。当以L-谷氨酰胺为供体，乙胺为受体，γ-谷氨酰转肽酶催化转肽反应时，即可生成L-茶氨酸，该反应过程耗时短，不需要额外添加ATP，具有诸多优势。

γ-谷氨酰转肽酶催化合成L-茶氨酸突出的问题是，存在水解反应，造成副产物L-谷氨酸的合成。一般情况下通过优化控制供体和受体之间用量比例、调节pH等条件来优化反应，降低副产物的合成，但是副产物L-谷氨酸积累仍然存在。

发明内容

本发明首先提供了一种转肽活力提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体，其含有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述γ-谷氨酰转肽酶突变体的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括但不限于细菌、真菌细胞。

本发明的第五个目的是提供一种提高γ-谷氨酰转肽酶转肽活力的方法，是将SEQID NO.3所示氨基酸序列的第463位氨基酸由苏氨酸突变成天冬氨酸，或将SEQ ID NO.4所示核苷酸序列编码第463位的苏氨酸的密码子突变成了编码天冬氨酸的密码子。

本发明的第六个目的是提供一种表达所述γ-谷氨酰转肽酶突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主，以pMA5为表达载体。

本发明的第七个目的是提供所述基因工程菌的制备方法，是在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第463位的苏氨酸的密码子突变成了编码天冬氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主菌中即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是：

(1)以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，Flprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)，Rlprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ ID NO.2所示的重组基因T463D。

(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pMA5表达载体中，得到重组质粒pMA5-T463D，重组质粒化转化B.subtilis 168，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌株，命名为pMA5-T463D/B.subtilis 168。

本发明的第八个目的是提供一种生成L-茶氨酸的方法，是以所述γ-谷氨酰转肽酶突变体为催化剂，以L-谷氨酰胺为供体，乙胺为受体，按照0.01-10U/mmol的L-谷氨酰胺比例加入γ-谷氨酰转肽酶突变体，控制L-谷氨酰胺与乙胺的浓度比为1:1～1:15比例进行转肽反应。

本发明还提供所述γ-谷氨酰转肽酶突变体或所述基因工程菌在制备含L-茶氨酸的产品方面的应用。

有益效果：本发明在天然γ-谷氨酰转肽酶的基础上，通过定点突变生物技术改造γ-谷氨酰转肽酶分子结构，突变体酶的转肽反应活力较突变前提高22.6％，水解反应活力降低了90％。本发明表明463位氨基酸残基对γ-谷氨酰转肽酶的转肽反应活力有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。本发明所得可用于制备L-茶氨酸。

具体实施方式

实施例1含γ-谷氨酰转肽酶突变体的重组载体的构建

(1)T463D突变体的获得：以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)、Rprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ IDNO.3所示的重组基因。

(2)将重组基因与pMA5分别用BamHI、MluI双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pMA5-T463D。测序工作由上海生工完成。

实施例2产γ-谷氨酰转肽酶枯草芽孢杆菌工程菌构建

将实施例1得到的重组质γ-谷氨酰转肽酶粒pMA5-T463D化学法转化入B.subtilis 168感受态细胞，具体方法如下：

(1)转化实验所需溶液如下(g/L)：

Sp-A：(NH₄)₂SO₄>2HPO₄>4·7H₂O>

100×CAYE：Casamino acid 20，酵母粉100Sp I培养基：Sp-A49％，Sp-B 49％，50％葡萄糖2％，100×CAYE 2％Sp II培养基：Sp I培养基98％，50mmol/LCaCl₂>2>

(2)将B.Subtilis 168的单菌落接种至2mL Sp I培养基中(50mL离心管)，37℃、200r/min培养过夜；

(3)取100μL培养液至5mL Sp I培养基中，37℃、200r/min培养至对数期(OD600值为1左右)，约4～5h；

(4)取200μL培养液至2mL Sp II培养基中，37℃、200r/min培养90min，取出后加入20μL 10mmol/L EGTA，于37℃、200r/min继续培养10min，然后分装成500μL每管，加入5μL重组质粒pMA5-T463D，混匀，37℃、200r/min培养90min，取菌液涂布抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。得到重组菌pMA5-T463D/B.subtilis 168。

实施例3重组菌pMA5-T463D/B.subtilis 168γ-谷氨酰转肽酶高效表达及酶活测定。

(1)将实施例2构建的重组菌pMA5-T463D/B.subtilis 168与表达未突变的酶的对照菌株pMA5-ggt/B.subtilis 168分别接种于l0mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于枯草芽抱杆菌发酵培养基中，37℃培养24h，取发酵液于4℃、10000r/min离心l0min，上清为胞外粗酶液，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，用于酶活力的测定。

(2)枯草芽抱杆菌发酵培养基：蔗糖25g/L,胰蛋白胨5g/L，玉米浆15g/L,MgSO40.3g和K₂HPO₄·3H₂O>

(3)转肽酶活定义为：在37℃反应条件下，每分钟内由γ-L-谷氨酰基-4-硝基苯胺经转肽反应生成生成1μmol对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个单位标准酶活。。

(4)γ-谷氨酰转肽酶酶活测定方法：采用比色法测定，具体方法如下：取培养60h的菌液50mL，于4℃条件下10,000r/min离心30min收集上清，上清液中即为目的蛋白。酶活测定方法如下：1ml的标准反应体系中包含50mM硼酸盐-氢氧化钠(pH 10)，2.5mMγ-L-谷氨酰基-4-硝基苯胺，60mM双甘二肽,750mM NaCl和10μl适当稀释的酶液。37℃反应10min后添加2ml 3.5N的醋酸终止反应，不添加双甘二肽作为对照，410nm处测定吸光度值。实验组和对照组的吸光度差值即为转肽酶活。

(3)结果表明重组菌pMA5-T463D/B.subtilis 168表达的γ-谷氨酰转肽酶的转肽酶活为20.1U/mL，比对照菌株pMA5-ggt/B.subtilis 168(16.4U/mL)γ-谷氨酰转肽酶转肽酶活提高22.6％。

实施例4：γ-谷氨酰转肽酶突变体用于L-茶氨酸生物转化生产

以L-谷氨酰胺为供体，乙胺作为受体，控制初始L-谷氨酰胺浓度为20mM，每2～3h按补加一次底物控制L-谷氨酰胺与乙胺的浓度比为1:1～1:15比例按照0.01-10U/mmol L-谷氨酰胺比例加入γ-谷氨酰转肽酶，缓冲液pH 4-12，反应温度25-65℃，最后用三氯乙酸终止反应。结果显示，利用γ-谷氨酰转肽酶突变体T463D作为催化剂合成L-茶氨酸的含量可达100mM以上。

实施例5：γ-谷氨酰转肽酶突变体用于L-茶氨酸生物转化生产

以L-谷氨酰胺为供体，乙胺作为受体，控制初始L-谷氨酰胺浓度为20mM，L-谷氨酰胺与乙胺的浓度比为1:10，每2～3h按补加一次底物(浓度比为1:10的L-谷氨酰胺和乙胺)，按照1U/mmol L-谷氨酰胺比例加入γ-谷氨酰转肽酶，缓冲液pH 10，反应温度35-40℃，最后用三氯乙酸终止反应。结果显示，反应12h，利用γ-谷氨酰转肽酶突变体T463D作为催化剂可合成110mM的L-茶氨酸，而利用突变前的γ-谷氨酰转肽酶作为催化剂最高合成83mM的L-茶氨酸。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种转肽活力提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 584

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