水稻黄单胞杆菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)Tn5转座子插入突变体文库构建及噻枯唑药敏性突变体筛选

摘要

水稻黄单胞杆菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae Xoo）引起的水稻白叶枯病是水稻上重要的病害之一。噻枯唑[N，N-亚甲基-双（2-氨基-5-巯基-1，3，4-噻二唑]杀菌剂属于噻二唑类化合物，被广泛用于控制水稻白叶枯病等细菌病害。由于噻枯唑具有广谱抗菌活性，毒性低，选择性强等优点而被长期单一使用。然而，近年噻枯唑在生产上也出现了相应的抗性问题，使细菌病害的化学防控面临了新的挑战。鉴于目前仍不了解噻枯唑的作用和抗性机理，本文通过构建Tn5随机插入突变体文库，并以噻枯唑杀菌剂筛选药敏性变化的突变体，为研究噻枯唑作用机理和抗性机理提供了可靠的试验材料。
　　该突变体文库包含16000个突变体。随机挑选2个突变体在活化25代之后，通过Southern blot杂交验证，未发现插入位点变化，突变体稳定性良好;随机挑选26个突变体，Southern blot杂交结果显示插入位点是随机的，有Tn5的单次插入，也有双次插入;通过RATE-PCR获得43个突变体中Tn5旁侧序列，作出Tn5在水稻黄单胞杆菌全基因组上插入位置图谱，观察发现Tn5转座子均匀分布于全基因组，该突变体文库具有良好的饱和度。经验证，该突变体文库随机性、稳定性、饱和度均良好，是一个质量很高的突变体文库。
　　实验中测定了噻枯唑对野生型菌株ZJ173的最低抑制浓度MIC为70μg/ml，以此为参照，通过在NA平板中添加药剂，观察菌落的生长情况来筛选水稻黄单胞杆菌突变体文库。筛选获得对噻枯唑更加敏感的突变体7株，获得不同抗药性水平的噻枯唑抗性突变体8株。通过致病力和对噻枯唑药敏性等生物学表型测定，发现对噻枯唑敏感和抗性的15个突变体的致病力均有不同程度的下降;噻枯唑对野生型菌株ZJ173的有效中浓度EC50为12.5μg/ml，抗药性突变体中EC50最高为24.1μg/ml，敏感突变体中EC50最低为3.7μg/ml。通过RATE-PCR获得Tn5旁侧序列，与全基因组序列对比，可知在8个抗药性突变体中，Tn5插入了基因组的IS家族（Transposase and inactivated derivatives，IS30 family）、色素C氧化酶亚基Ⅱ(cytochrome C oxidase subunitⅡ)、单链DNA特异性外切核酸酶（single-stranded-DNA-specific exonuclease）等基因中，在7个敏感突变体中，Tn5插入了信号传导组氨酸激酶（Signal transductionhistidine kinase）、Rhs家族蛋白（Rhs family protein）、转座子（putative transposase）等基因中。
　　同时对噻枯唑敏感性变异的突变体胞外多糖含量和细胞膜的电导率研究发现，抗药性菌株的胞外多糖水平下降;所有突变体的细胞膜通透性提高。

目录

声明

摘要

符号及缩略说明表

第一章 文献综述、研究目的及意义

1 水稻白叶枯病害简介和水稻黄单胞杆菌的研究进展

2 水稻白叶枯病害的化学防治

3 噻枯唑的抗性水平研究

4 EZ-Tn5转座子的功能研究

4．1 一个简单的，广泛的宿主范围系统

4．2 优化换位效率

4．3 插入位点的快速鉴定

4．4 创建自定义的转座子

5 研究目的及意义

参考文献

第二章 水稻黄单胞杆菌突变体库构建和质量分析

1 材料与方法

1．1 菌株

1．2 培养基、抗生素

1．3 试剂

1．4 野生型菌株突变体文库的构建

1．5 突变体库质量的检测

2 结果与分析

2．1 水稻黄单胞杆菌突变体库

2．2 突变体库的质量

3 总结与讨论

参考文献

第三章 水稻黄单胞杆菌突变体文库的筛选

1 材料与方法

1．1 菌株

1．2 培养基、抗生素

1．3 水稻黄单胞杆菌药敏性测定

1．4 抗药性突变的筛选

1．5 敏感突变体的筛选

2 结果与分析

2．1 水稻黄单胞杆菌的药敏性

2．2 抗药性突变体

2．3 药敏性突变体

3 结果与讨论

参考文献

第四章 水稻黄单胞杆菌与噻枯唑互作基因的鉴别与功能研究

1 材料与方法

1．1 菌株

1．2 培养基、抗生素

1．3 水稻黄单胞杆菌野生型菌株ZJ173及突变体的药敏性测定

1．4 致病性测定

1．5 突变体Tn5插入位点的确定

1．6 胞外多糖的测定

1．7 电导率的测定

2 结果与分析

2．1 水稻黄单胞杆菌ZJ173和突变体的药敏性

2．2 突变体的致病性

2．3 突变体Tn5插入位点

2．4 突变体生物合成胞外多糖能力分析

2．5 突变体的电导率

3 结果与讨论

参考文献

全文小结

附录

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢