抗人bFGF纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用

摘要

本发明公开了抗人bFGF纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。所述的抗重组人bFGF的纳米抗体具有分子量小、特异性强、亲和力高、耐高温等优点；同时，所需剂量低，对黑色素瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用，并可抑制黑色素瘤细胞的生长及迁移。所述的抗人bFGF纳米抗体的制备方法简单，纯化后的纯度可达到90％以上。本发明为bFGF相关肿瘤疾病的治疗提供新的候选药物，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及抗人bFGF纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。

背景技术

黑色素瘤是一种恶性程度高的肿瘤，发展迅速，死亡率高，对放疗和化疗均不敏感，除早期原位黑色素瘤可通过外科手术切除，晚期发生转移的黑色素瘤则难以治愈。在一组恶性黑色素瘤细胞系中，研究人员发现每个细胞系都独特的表达bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、PDGF-A、PDGF-B、TGF-β、TGF-α中两种，或者四种、五种细胞因子，但是所有的细胞系都表达bFGF，说明bFGF在黑色素瘤细胞中的表达具有普遍性。从正常上皮非典型性增生，到原位癌早期浸润癌再到已发生转移的恶性黑色素瘤，bFGF在细胞中的表达强度依次升高。研究发现，利用反义核苷酸技术和过量表达突变的FGFR1(FGFR：成纤维细胞生长因子受体)来干扰bFGF通路，能够抑制黑色素瘤细胞的增殖和体内的肿瘤发生，进而说明bFGF是促进黑色素瘤发生和发展的重要影响因子。bFGF/FGFR作为抗肿瘤治疗的靶点之一，目前尚未有商品化的治疗性bFGF抗体，bFGF靶向药物的研发仍有广阔空间。

bFGF单抗的抑制肿瘤血管新生和抗肿瘤的作用已经得到了国内外学者的证实和肯定。1987年Massoglia等开创了bFGF单抗研究的先河，1989年Reilly等首次制备出具有中和活性的bFGF单抗，1991年Akira Hori等首次报道bFGF单抗能在特定的条件下抑制肿瘤的生长，1999年Anouma认识到其具有体内外抑瘤活性。国内bFGF单抗的研究始于1998年，向军俭等制备的bFGF单抗能促进细胞增殖，2010年又报道所制备的鼠源性bFGF单抗具有抑制HUVEC血管新生的作用，并且人源性bFGF单抗具有抑制血管新生的作用。虽然目前已有抗bFGF传统抗体和Fab抗体等小分子抗体的相关研究文献和专利报道，但这些报道中所制备的抗体均来自小鼠或兔，为经典的含有重链和轻链的IgG类抗体及其衍生物，没有来自骆驼科动物、只有重链的新型抗体(也就是纳米抗体)的相关研究报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗重组人bFGF的纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种抗重组人bFGF的纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用；所述的抗重组人bFGF的纳米抗体包含由框架区FR(Framework Region)和互补决定区CDR(Complementarity-determining Regions)组成的可变区结构域，所述的可变区结构域包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：

(1)SEQ ID No.1～4任一氨基酸序列所示的CDR1，

(2)SEQ ID No.5～8任一氨基酸序列所示的CDR2；

(3)SEQ ID No.9～12任一氨基酸序列所示的CDR3。

所述的可变区结构域包含选自以下任一项的CDR1、CDR2和CDR3：

(1)SEQ ID No.1所示的CDR1，SEQ ID No.5所示的CDR2和SEQ ID No.9所示的CDR3；

(2)SEQ ID No.2所示的CDR1，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的CDR2，和SEQ IDNo.9或SEQ ID No.10所示的CDR3；

(3)SEQ ID No.3所示的CDR1，SEQ ID No.7所示的CDR2，和SEQ ID No.11所示的CDR3；

(4)SEQ ID No.4所示的CDR1，SEQ ID No.8所示的CDR2，和SEQ ID No.12所示的CDR3。

所述的框架区FR选自下组的FR1、FR2、FR3和FR4：

(1)SEQ ID No.13～15任一氨基酸序列所示的FR1；

(2)SEQ ID No.16～19任一氨基酸序列所示的FR2；

(3)SEQ ID No.20～24任一氨基酸序列所示的FR3；

(4)SEQ ID No.25～27任一氨基酸序列所示的FR4。

所述的抗重组人bFGF的纳米抗体，其氨基酸序列选自如所示的氨基酸序列中的任意一种(SEQ ID NO.28～33)；具体如下：

所述的抗重组人bFGF的纳米抗体包含与SEQ ID NO.28～33所示的任一氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，更优选地至少99％序列相同性的氨基酸序列。

如SEQ ID NO.28～33所示的任一氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸的氨基酸序列。

所述的取代优选为与SEQ ID NO.28～33所示的任一氨基酸序列相比包含一个或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。

编码如SEQ ID NO.28～33所示的氨基酸序列的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.34～39所示。

所述的纳米抗体由342个碱基、336个碱基或369个碱基组成，编码114个氨基酸、112个氨基酸或123个氨基酸，由抗体4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)组成：纳米抗体的CDR1编码10个氨基酸，CDR2编码7个氨基酸，CDR3编码11个氨基酸；或CDR1编码10个氨基酸，CDR2编码7个氨基酸，CDR3编码9个氨基酸；或CDR1编码10个氨基酸，CDR2编码8个氨基酸，CDR3编码19个氨基酸；3个CDR区为特异性序列。

所述的药物可为药物组合物，包括药学上可接受的载体。

所述的药物也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，联合治疗可以包括本发明的抗重组人bFGF的纳米抗体联合至少一种其他的抗肿瘤药物。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供的抗重组人bFGF的纳米抗体具有分子量小、特异性强、亲和力强、耐高温、对黑色素瘤细胞的增殖均有明显的抑制作用。因此，本发明提供的抗重组人bFGF的纳米抗体可以为bFGF相关肿瘤疾病的治疗提供新的候选药物。

附图说明

图1是bFGF纳米抗体噬菌体文库3轮淘洗结果图。

图2是不同噬菌体抗体克隆的ELISA结果图；其中1为阳性对照，2为阴性对照，3～86分别为不同的噬菌体抗体克隆。

图3是bFGF纳米抗体纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是蛋白分子标准，泳道2～7是300毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱后得到的纳米抗体，依次为Nb1～Nb6。

图4是bFGF纳米抗体与bFGF特异性结合图；其中1为阳性对照(市售鼠抗bFGF IgG抗体，缩写为bFGF mAb)，2～7表示不同的纳米抗体克隆株，依次为Nb1～Nb6。

图5是bFGF纳米抗体热稳定实验结果分析图；其中bFGF单抗为阳性对照，Nb1～Nb6表示不同的纳米抗体克隆株。

图6是bFGF纳米抗体与FGFR2的结合位点研究结果分析图；其中Nb1～Nb6表示不同的纳米抗体克隆株。

图7是bFGF纳米抗体与bFGF单抗结合位点研究结果分析图；其中Nb1～Nb6表示不同的纳米抗体克隆株。

图8不同浓度Nb6处理后的黑色素瘤细胞迁移实验结果分析图；其中**表示与bFGF组相比，p<0.01。

图9Nb6对不同黑色素瘤细胞Erk1/2和Akt磷酸化水平时间点影响结果分析图；其中**表示与0h组相比，p<0.01。

图10是bFGF纳米抗体治疗黑色素瘤瘤体照片图；其中1为阴性对照组，2为抗bFGF纳米抗体组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1抗重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的纳米抗体的筛选方法

1、纳米抗体文库基因的构建

(1)用浓度为0.2mg/mL的重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，购自北京义翘神州生物技术有限公司)免疫羊驼(购自美国Allele Biotechnology&PharmaceuticalsCo.)，每次免疫将0.2mg的bFGF与弗氏佐剂等体积混合，每两周一次，共免疫4次，除第一次使用完全的弗氏佐剂(购自Sigma公司)，剩余几次全部使用弗式不全佐剂(购自Sigma公司)。免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的单链抗体。

(2)4次免疫结束后，提取羊驼外周血淋巴细胞100mL，用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)提取总RNA，采用AMV First Strand cDNA Synthesis试剂盒(详见NEB公司试剂盒产品说明书)反转录合成cDNA。

(3)设计引物对重链抗体的可变区进行PCR扩增(反应体系见表1，PCR条件见表2)。PCR产物经QIA quick PCR Purification试剂盒(购自QIAGEN公司)回收纯化，获得330～370bp左右的羊驼重链可变区PCR产物。

表1羊驼单链抗体可变区的PCR扩增反应体系

表2羊驼单链抗体可变区的PCR扩增条件

2、纳米抗体噬菌体抗体库的构建

(1)使用限制性的内切酶SfiⅠ(购自NEB公司)酶切20μg pComb3X(购自AlleleBiotechnology and Pharmaceuticals公司)噬菌体展示载体及10μg羊驼重链可变区PCR产物，并用T4DNA连接酶(购自NEB公司)连接两个片段。将连接产物电转化至电转感受态细胞XL1-Blue(购自Allele Biotechnology and Pharmaceuticals公司)中，后分别五次加入1mL SOC培养基(购自NEB公司)至电转杯重悬杯内的菌液，并将5mL培养菌液于37℃摇床中，250rpm培养1h。

(2)向5mL培养菌液加入10mL SB培养基(配制方法：称取8g MOPs，24g蛋白胨，16g酵母提取物，定容至800mL，于121℃灭菌20min灭菌；培养基中含10mg/L四环素)和3μL氨苄青霉素储存液(100g/L氨苄青霉素)，混匀后取1μL培养液稀释100倍，均匀涂布于LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)，检测库容。将余下培养液于37℃，275rpm培养1h。向培养液中加入4.5μL氨苄青霉素储存液(100g/L氨苄青霉素)，继续培养1h。向培养液中加入2mL辅助噬菌体VCSM13(购自Allele Biotechnology and Pharmaceuticals公司；滴度为10¹²～10¹³pfu/mL)、添加SB培养基(含10mg/L四环素)至200mL，并加入92.5μL氨苄青霉素储存液(100g/L氨苄青霉素)，于37℃，275rpm培养2h。向培养液中加入400μL卡那霉素储存液(35g/L卡那霉素)，培养过夜。

(3)次日，将过夜培养的菌液于4℃，3000g离心15min。将上清转移至含有4％(w/v)PEG-8000和3％(w/v)NaCl的50mL离心管中，涡旋混匀，并于4℃孵育30min，用于沉淀噬菌体。于4℃，15 000g条件下离心15min。弃上清，用2mL TBS重悬噬菌体沉淀。4℃条件下，将上清最大转速离心5min，并用0.22μm滤器过滤上清至无菌EP管中，此即为抗bFGF纳米抗体的噬菌体原始库。

3、噬菌体抗体库的筛选

(1)将bFGF抗原(购自义翘神州生物技术有限公司)稀释至2μg/孔，包被于96孔酶标版，4℃过夜包被。次日，用5％脱脂牛奶(2.5g的脱脂牛奶完全溶解于50mL 0.05％PBST溶液中)于37℃封闭1小时后，将噬菌体文库制备液(及步骤2得到的抗bFGF纳米抗体的噬菌体原始库，10¹⁴pfu/mL)加入包被有抗原的孔中，37℃孵育2小时。加入XL1-blue菌液(OD＝0.8～1)，100μL/孔，室温孵育15min。该步骤重复多次，至获得被感染菌液达到2mL。将2mL被感染的菌液加入6mL>

(2)从第3轮淘洗的培养皿中挑选84个阳性克隆，接种于含有1mL SB培养基(含10mg/L四环素，100mg/L氨苄青霉素)，以辅助噬菌体作为本实验的阴性对照，将培养液置于37℃摇床培养5h。后加入10μL/孔的VCSM13辅助噬菌体，再培养1.5～2h。加入2μL卡那霉素储存液(35g/L卡那霉素)，于37℃摇床过夜培养。次日，将培养液于4℃，3000g离心15min。取800μL上清并添加200μL的5倍浓度的4％PEG-8000和3％NaCl混合溶液，于4℃孵育30min。将培养液于4℃，15 000g离心15min。弃上清，加入200μL TBS，并轻轻震荡均匀。将50μL悬液加入包被有200ng/孔bFGF抗原的96孔板中。以任意3孔样品的混合液作为阳性对照，以辅助噬菌体为本实验的阴性对照，PBS作为本实验的空白对照。将96孔板于37℃孵育1h。后以100ng/孔的量孵育Anti-M13抗体1小时。加入100μL/孔的TMB显色液(购自NEB公司)，并孵育15min。测定450nm处吸光值，将实验组OD值为辅助噬菌体组OD值3倍以上的克隆株定义为阳性克隆株。结果如图2，共有69个克隆株为阳性克隆株，阳性比例达到82％。随机选16株阳性克隆，进行质粒抽提，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将DNA测序结果用Bioedit进行分析，把氨基酸序列相同的克隆株视为同一克隆株，而氨基酸序列不同的株视为不同克隆株，最终共有6株氨基酸序列不同的纳米抗体，分别命名为Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5和Nb6，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.34～39所示。

4、bFGF纳米抗体的表达和纯化

(1)用一组特异性引物(见表3)对pComb 3x载体上的纳米抗体目的基因进行PCR扩增(反应体系见表4，PCR条件见表5)。

表3纳米抗体目的基因扩增引物

(划线标注为添加的Hind III和Nde I酶切位点)

表4纳米抗体目的基因PCR扩增体系

表5纳米抗体目的基因PCR扩增反应时间

上述PCR产物经QIA quick PCR Purification试剂盒(购自QIAGEN公司)回收纯化，获得330～370bp左右的纳米抗体PCR产物。使用限制性的内切酶Hind III(购自Thermo公司)和Nde I(购自Thermo公司)酶切表达载体pET22b(购自Novagen公司)和纳米抗体目的基因，并用T4 DNA连接酶连接两个片段。将连接产物转化表达型宿主菌BL21(DE3)(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中，涂布在含有LB固体培养基(含有100mg/L氨苄青霉素)的板上，37℃过夜。

(2)挑选单个菌落接种在5mL LB培养液(含有100mg/L氨苄青霉素)中，37℃摇床培养过夜。后接种1mL过夜菌种至400mL LB培养基(含有100mg/L氨苄青霉素)中，37℃摇床培养，当OD＝0.6～1时，加入IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，18℃摇床培养20h。第二天，4℃，6000rpm离心15min收菌。将菌体用PBS重悬，超声破碎10min。8000rpm离心30min，上清即为表达产物粗提液。将粗提液经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白。为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液(100mmol/L)用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液(300mmol/L)用于洗脱目的蛋白，最终可制备纯度达90％以上的蛋白。结果见图3，从左到右分别是：泳道1为标准蛋白分子，泳道2～7依次为300mmol/L咪唑的洗脱液洗脱的Nb1～Nb6蛋白样品。结果显示，纳米抗体经过该纯化后，其纯度可达到90％以上。

实施例2抗bFGF纳米抗体理化性质及生物活性试验

1、抗bFGF纳米抗体的特异性分析

向96孔酶标板内加入50ng/孔的bFGF、aFGF、KGF、EGF、TNFα、VEGF(均购自北京义翘神州生物技术有限公司)、BSA、牛奶，于4℃包被过夜。次日，用5％脱脂牛奶封闭酶标板2h后，分别加入浓度为100ng/孔的阳性对照bFGF mAb(购自sigma公司)、空白对照PBS以及抗bFGF纳米抗体，37℃孵育1h。后加入100ng/孔的抗Flag(购自Sigma公司)标签抗体，孵育1h。加入100μL/孔的TMB显色液，孵育10min。最后用2.29％硫酸终止反应，测定450nm处吸光值。以抗bFGF纳米抗体与对应抗原bFGF的吸光度值为与其他对照抗原吸光值3倍以上的抗体克隆定义为阳性。

结果如图4表示，6株抗bFGF纳米抗体与bFGF存在特异性结合能力强，和其他7个对照抗原的结合能力较弱。

2、抗bFGF纳米抗体的亲和力测定

采用表面等离子体谐振生物传感器测定抗bFGF纳米抗体的亲和力。将0.4mol N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亚胺和0.1mol N-羟基琥珀酰亚胺等体积混合后以20μL/min的流速通入仪器中对芯片表面进行活化。bFGF蛋白用pH 4.2的0.2mol醋酸缓冲液稀释至2mg/mL后，流过芯片表面。固定量达到所需量后通入PBS缓冲液。通入1mol乙醇胺(pH 8.5)溶液7min灭活剩余的酯键。将不同浓度(3.125，6.25，12.5，25，50，100，200nM)的抗bFGF纳米抗体以20μL/min的流速通入仪器中。通过仪器软件计算抗bFGF纳米抗体的亲和力。结果如表6所示，抗bFGF的纳米抗体具有高亲和力，最高亲和力达到0.69nM。其余抗bFGF纳米抗体亲和力常数分别为11.32nM、317.60nM、5.37nM、12.37nM和10.32nM。

表6抗bFGF的纳米抗体亲和力常数

Nb1Nb2Nb3Nb4Nb5Nb6KD(nM)11.32317.605.370.6912.3710.32

3、热稳定性的测定

将筛选得到的纳米抗体(Nb1～Nb6)分别置于25℃，37℃，60℃，90℃四种不同温度下各10min、30min、60min、120min以及180min；同时以bFGF单克隆抗体(购自Sigma，鼠源抗体)作为阳性对照。收集不同温度、不同时间处理后的样品，用ELISA法检测它们与bFGF结合性，即在不同温度不同时间处理后，抗体是否还具有与bFGF结合的能力。检测结果图5表明，与未处理的纳米抗体相比，经过25℃和37℃处理后，纳米抗体相对活性均保持在90％以上，而经过60℃处理后，纳米抗体相对活性均有所下降，但仍保持在80％以上。但经过90℃处理后，纳米抗体相对活性均显著下降，其中Nb5处理60min时相对活性已降至0％，而Nb6处理180min后相对活性才降至0％，其他几组纳米抗体相对活性均在120min时下降至0％。这与作为阳性对照的bFGF单克隆抗体相比具有明显优势，虽然bFGF单克隆抗体在25℃，37℃，60℃三种不同温度下的相对活性均在90％以上，但在经过90℃处理后，它的相对活性在10min内就已经降至0％。因此，说明纳米抗体相对通常的鼠单克隆抗体，在高温处理时的稳定性更加好。

4、竞争结合实验

(1)采用竞争ELISA法检测本发明的纳米抗体Nb_bFGF与FGFR2(购自义翘神州生物技术有限公司)竞争结合bFGF(购自义翘神州生物技术有限公司)的能力。本实验将定量100ng的纳米抗体与变量(0～1μg)的FGFR2同时加入包被50ng>

(2)采用竞争ELISA法检测Nb_bFGF与商业鼠单克隆抗体bFGF>

实施例3抗bFGF纳米抗体治疗小鼠黑色素瘤实验

1、对黑色素瘤细胞增殖的抑制实验

(1)将培养至对数生长期的小鼠黑色素瘤细胞B16、B16-F10和人黑色素瘤细胞A375(购自上海细胞所)用0.25％胰酶消化液消化，然后用含10％FBS(胎牛血清)的DMEM培养基(购自Gibco公司)调整其密度为3×10⁴个细胞/mL，以100μL/孔接种于96孔板，24h后换为100μL/孔不含血清的DMEM培养，于37℃，5％CO₂条件下饥饿培养4～6h。

(2)用含0.2％FBS和12.5ng/mL bFGF的DMEM培养基稀释阳性对照FGFR和样品纳米抗体，从16nmol/L开始以4倍梯度稀释，设6个稀释度各2个复孔，以含0.2％FBS和12.5ng/mLbFGF的DMEM培养基作为阴性对照，含0.2％FBS的DMEM培养基作为空白对照，于37℃，5％CO₂条件下培养48h。

(3)加入10μL/孔CCK-8试剂(购自Sigma公司)，于37℃，5％CO₂条件下孵育4h。

(4)用酶标仪在450nm和630nm处测量吸光值。

(5)细胞增值抑制率(％)＝[阴性对照组OD-实验组OD]/阴性对照组OD×100％。

结果如表7所示，当将12.5ng/mL bFGF与阳性对照FGFR、样品Nb_bFGF一起孵育处理黑色素瘤细胞时，FGFR与Nb_bFGF对bFGF诱导黑色素瘤细胞的增殖均有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。各组Nb_bFGF对B16、B16-F10和A375细胞的最高增值抑制率在分别为25～46％、31～43％和24～36％，而相同剂量的FGFR对各株细胞的最高增值抑制率为(27.10±1.50)％、(22.10±2.56)％和(25.31±2.13)％。在5株Nb_bFGF中，Nb1、Nb3和Nb6对3株黑色素瘤细胞的增值抑制效果均表现最佳。Nb2在抑制B16-F10细胞增殖时，其最高抑制率比FGFR组高40％，而在抑制另外两株黑色素瘤细胞时，其最高抑制率与FGFR组无差异。Nb5虽然对B16-F10和A375细胞增殖的最高抑制率都显著高于FGFR组，但是其对B16细胞的增殖抑制率却与FGFR组无差别。说明不同株Nb_bFGF对不同株黑色素瘤细胞的增殖抑制效果存在差异。

阳性对照FGFR与各组Nb_bFGF的半数抑制浓度(IC50)见表7。可见，与FGFR组相比，除了Nb2对A375的IC50高于FGFR组，其他Nb_bFGF对黑色素瘤细胞的IC50均低于FGFR组，说明与FGFR相比，Nb_bFGF对小鼠黑色素瘤细胞B16、B16-F10和人黑色素瘤细胞A375进行细胞增殖抑制作用时，所需剂量更低，但抑制率更高。

表7 Nb_bFGF对黑色素瘤细胞的最高增值抑制率和半数抑制浓度(IC50)

2、划痕实验检测Nb_bFGF对黑色素瘤细胞迁移的影响

(1)取6孔细胞培养板，用记号笔在其底部每孔处平行画两条横线。

(2)用含10％FBS的DMEM培养基调整实验所需肿瘤细胞(小鼠黑色素瘤细胞B16、B16-F10和人黑色素瘤细胞A375)的密度至3×10⁵个细胞/mL，取2mL/孔加入6孔板中，培养24h至细胞单层铺满孔板底部80％。

(3)取出6孔板中培养基，用200μL枪头与背面横线垂直的方向平行划痕2条，并用PBS洗涤平板2次，以清洗漂浮的细胞。

(4)用含0.2％FBS和12.5ng/mL bFGF的DMEM培养基稀释样品纳米抗体(Nb6)，从16nmol/L开始以4倍梯度稀释，设3个稀释度各2个复孔，以0.2％FBS+DMEM+12.5ng/mL bFGF培养基作为对照。用荧光显微镜对细胞划痕和背部横线交叉的地方进行拍照，后将细胞置于37℃，5％CO₂条件下培养48h。

(5)用荧光显微镜在给药前后细胞划痕和背部横线交叉的同一地方进行拍照，用Image J软件计算细胞的迁移率。细胞迁移率(％)＝[给药前划痕面积-给药后划痕面积]/给药前划痕面积×100％。

结果如图8所示，与bFGF组相比，三个不同剂量组的Nb6均可抑制划痕处细胞的生长及迁移，且成剂量依赖关系。对于B16细胞，Nb6三个剂量组的迁移率分别为(41.58±6.06)％(**p<0.01)、(32.52±5.78)％(**p<0.01)和(27.23±4.96)％(**p<0.01)。与bFGF组相比，它们抑制细胞迁移的抑制率分别为26.66％、42.65％和51.97％。B16-FI0是高转移的黑色素瘤细胞株，因此，该细胞株的迁移率均高于B16细胞和A375细胞，分别为(72.73±6.03)％(**p<0.01)、(63.20±7.54)％(**p<0.01)和(55.38±8.69)％(**p<0.01)。与bFGF组相比，它们抑制细胞迁移的抑制率分别为26.79％、36.39％和44.25％。A375细胞为人黑色素瘤细胞，经Nb6处理后，该细胞株的迁移率与B16细胞株迁移率相似，分别为(40.92±5.85)％(**p<0.01)、(35.60±4.29)％(**p<0.01)和(28.83±4.85)％(**p<0.01)。与bFGF组相比，它们抑制细胞迁移的抑制率分别为37.44％、45.67％和55.91％。因此，本实验说明Nb6可抑制小鼠黑色素瘤细胞B16、B16-F10和人黑色素瘤细胞A375的生长及迁移，且成剂量依赖关系。

3、Westerning Blotting检测Nb_bFGF对黑色素瘤细胞信号通路的影响

(1)将培养至对数生长期的细胞用0.25％胰酶消化液消化，然后用10％FBS+DMEM培养基调整其密度为3×10⁴个细胞/mL，取2mL/孔置于6孔板中，24h后换为2mL/孔不含血清的DMEM培养，于37℃，5％CO₂条件下饥饿培养4～6h。

(2)磷酸化作用时间点检测时，用0.2％FBS+DMEM+12.5ng/mL bFGF培养基稀释样品Nb6至4nmol/L，将细胞于37℃，5％CO₂条件下培养0、0.5、1、3h，在这4个时间点收取细胞。

(3)收取细胞，1000g离心1min。去上清，用1X PBS重悬菌体。该步骤重复两次。

(4)按照说明书加入适量动物细胞裂解液(购自Sigma公司)至细胞沉淀，并按体积比1:100的比例加入蛋白酶抑制剂PMSF(100mM)，混匀后置于冰上30min，13,500g离心10min。

(5)去上清，用BCA法测量蛋白浓度。

(6)调整蛋白浓度，保证每个样品的浓度一致。向样品中加入适量5X LoadingBuffer，于100℃孵育10min。

(7)将样品进行SDS-PAGE电泳实验，跑胶完毕后进行转膜与封闭。

(8)孵育一抗：0.05％TBST洗涤NC膜1次，每次5min。按照所需检测蛋白(p-Erk1/2、p-Akt、t-Erk1/2、t-Akt和β-action)说明书，以1:5000比例稀释抗体，后于4℃条件下，40rpm摇床上用一抗孵育NC膜过夜。

(9)孵育二抗：0.05％TBST洗涤NC膜6次，每次5min。按照所需检测蛋白(也即带His标签蛋白)说明书，以1:10000比例稀释抗体，后于室温40rpm摇床上用二抗孵育NC膜1h。

(10)显影：0.05％TBST洗涤NC膜6次，每次5min。向清洗干净的NC膜喷洒显色液，至NC膜完全湿润。用BIO-RAD的凝胶成像系统进行显影和拍照。结果用Image J软件进行分析处理。

(11)若还需在同一张NC膜显影其他抗体，用Stripping Buffer清洗NC膜5min，后用0.05％TBST清洗5min X 5次，然后重复步骤3～5。结果见图9。

从图9中可以看出，4nmol/L Nb6作用时，在0.5h时能够显著抑制三株黑色素瘤细胞内p-Erk1/2和p-Akt的表达水平(**p<0.01)，但随着作用时间的推移，抑制磷酸化水平逐渐减弱。而t-Erk1/2和t-Akt水平随着作用时间的变化而未发生改变。

4、抗bFGF纳米抗体治疗小鼠黑色素瘤动物实验

于18只C57BL/6J小鼠(购自广东省医学实验动物中心，SPF级，6～7周龄，雌性)右后肢大腿外侧皮肤松软处接种密度为5X 10⁶个/mL的小鼠黑色素瘤B16细胞(购自中科院上海细胞库)，0.1mL/只。待肿瘤平均最长直径为1～3mm时，淘汰未见肿瘤生长的及最长直径大于5mm的小鼠。然后将小鼠随机分为阴性对照组，抗bFGF纳米抗体组(Nb6)，每组8只。采用瘤体周围皮下给药的方式对小鼠进行给药。PBS对照组给予1×PBS>

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 抗人bFGF纳米抗体在制备治疗黑色素瘤药物中的应用

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ser Asn Phe Ser Asn Asn Asp Met Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Ser Asn Phe Ser Ile Asn Asp Met Gly

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Asn Ile Phe Ser Val Asn His Met Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Arg Thr Phe Ser Ser Gly Ala Met Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ile Ser Ser Val Gly Arg Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ile Ser Ser Val Gly Arg Ala

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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His Leu Tyr Gly Asp Tyr Arg Gly Thr Gly Phe

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Tyr Leu Tyr Gly Asp Tyr Arg Gly Thr Gly Phe

1 5 10

<210> 11

<211> 9

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Asn Thr Trp Pro Tyr Glu Ser Ala Tyr

1 5

<210> 12

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ala Ala Arg Ser Tyr Ser Glu Ala Tyr Tyr Leu Ile Gly Ser Ser Asp

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Tyr Asn Tyr

<210> 13

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

1 5 1015

Leu Ser Cys Glu Val Ser

20

<210> 14

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

1 5 1015

Leu Ser Cys Lys Ala Ser

20

<210> 15

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg

1 5 1015

Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20

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<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Val Val Ala Gly

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<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Val Val Ala Gly

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<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Tyr Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Leu

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<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Phe Val Ala Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Met Tyr Gly Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 1015

Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Ala Lys Asp

202530

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

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<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Met Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

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Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp

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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Tyr Thr Ile Ser Arg Asp Asn

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35

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<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Met Tyr Gly Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

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<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

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Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Ser Asn Phe Ser Asn Asn Asp Met Gly

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

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<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

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<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

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Leu Ser Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Phe Ser Val Asn His Met Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg

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Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Gly Ala Met Gly

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Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Phe Val Ala Thr Ile

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<210> 33

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

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Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Ser Asn Phe Ser Ile Asn Asp Met Gly

202530

Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Val Val Ala Gly Ile

354045

Ser Ser Val Gly Arg Thr Met Tyr Gly Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe

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Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Leu Tyr Gly

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100 105 110

Ser Ser

<210> 34

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ctgcaggagt ctgggggaga cttggtgcag cctggggggt ctctgagact ctcctgtgaa 60

gtttctggaa gcaacttcag taacaatgac atgggctggt accgccaggc tccagggaag 120

cagcgcgagg tggtcgcagg tattagtagt gttggacgta caatgtatgg agaccccgtg 180

aagggccgat tcaccatctc cagagacaac gccaagaaca tggtgtatct gcaaatgaac 240

agactgaaag ctaaagacac ggccgtctat tactgtcacc tttatggtga ctataggggg 300

actggtttct ggggcaaggg gacccaggtc accgtctcgt cg 342

<210> 35

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ctgcaggagt ctgggggaga cttggtgcag cctggggggt ctctgagact ctcctgtgaa 60

gtttctggaa gcaacttcag tatcaatgac atgggctggt accgccaggc tccggggaag 120

cggcgcgagg tggtcgcagg tattagtagt gttggacgcg caatgtatgc agaccccgtg 180

aagggccgat tcaccatctc cagagacaac gccaagaaca tggtgtactt gcaaatgaac 240

agactgaaac ctgaggacac ggccgtttat tactgttacc tttatggtga ttataggggg 300

actggtttct ggggcaaggg gacccaggtc accgtctcgt cg 342

<210> 36

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ctgcaggagt ctgggggaga cttggtgcag cctggggggt ctctgagact ctcctgtgaa 60

gtttccggaa gcaacttcag tatcaatgac atgggctggt accgccaggc tccagggaag 120

cggcgcgagg tggtcgcagg tattagtagt gttggacgca caatgtatgc agaccccgtg 180

aagggccgat tcaccatctc cagagacaac gccaagaaca tggtgtatct gcaaatgaac 240

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gagcgcgagc tggtcgcgct tattactccc ggtggtacca gaaactatgc aaactccgtg 180

aagggccgat tcaccatctc caaagacaac gccaagaaca cggtgtatct gcagatgaac 240

agcctgcaac ctgaggacac ggccgtctat tactgtaata cctggccata tgagtctgcc 300

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcttactact taatcggctc gtccgattat aactactggg gtcaggggac ccaggtcacc 360

gtctcctca 369

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ctgcaggagt ctgggggaga cttggtgcag cctggggggt ctctgagact ctcctgtgaa 60

gtttctggaa gcaacttcag tatcaatgac atgggctggt accgccaggc tccagggaag 120

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aagggccgat tcaccatctc cagagacaac gccaagaaca tggtgtatct gcaaatgaac 240

agactgaaac ctgaggacac ggccgtctat tactgtcacc tttatggtga ctataggggg 300

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<212> DNA

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ataaaacata tgctgcagga gtctggggga 30

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<212> DNA

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<400> 41

ataaaacata tgctgcagca gtctggggga 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

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