缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2C)基因序列及功能鉴定

摘要

本发明涉及缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2C)基因序列(如SEQ ID NO:7所示)及其应用。其特点表现在：MiDGAT2C不同于本课题组已克隆到的另外两个DGAT2基因。将该基因转化至酵母的TAG合成缺陷株H1246中表达，发现该基因的转入确实能使该酵母缺陷株H1246恢复合成TAG，证明了该基因编码蛋白具有合成TAG的功能。并发现MiDGAT2C对花生四烯酸‑CoA没有催化活性，但能将亚油酸‑、γ‑亚麻酸‑或α‑亚麻酸‑CoA的酰基转至DAG甘油骨架的sn‑3位以产生TAG，且能力相近。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2C)基因序列及功能鉴定。

背景技术

随着石油、煤、天然气等有限自然资源的不断耗尽，人类对可再生能源的需求日益强烈。科学家们急需寻求一种占地资源少、产业性能强、对环境污染可控的新型可再生能源。生物柴油，特别是微藻生物柴油以其得天独厚的优势越来越被科学家们所青睐。生物柴油的主要原料为三酰甘油(TAG)，它以油滴的方式存在于真核生物的细胞中。本发明有关的微藻是缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl H4301)，它是一种淡水单细胞微藻，隶属绿藻门(Chlorophyta)。该藻能大量积累TAG，特别在缺氮培养条件下，是潜在的微藻生物柴油藻种。

TAG的合成有三条途径，其中Kennedy途径是唯一一条依赖于酰基-辅酶A(CoA)的途径，也是TAG合成的主要途径，该途径通过各种酰基转移酶依次把酰基-CoA的酰基链转移到甘油骨架的sn-1、sn-2和sn-3位置。酰基-CoA:二酰基甘油酰基转移酶(DGAT，EC2.3.1.20)作用于TAG生物合成的最后一步。它以酰基-CoA为底物，催化并使sn-1，2-二酰基甘油(DAG)甘油骨架的sn-3位酰化，从而形成TAG。同时，它也是一种限速酶，它有可能被用来增加含油植物包含微藻的含油量。到目前为止，发现DGAT有三个家族，分别为DGAT1、DGAT2和DGAT3。

专利号为ZL201210477507.7的中国专利公开了一种缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2A)，专利号为ZL201310668330.3的中国专利公开了一种缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2B)，专利号为ZL201510646709.3的中国专利公开了一种缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶1(MiDGAT1)。但是，本发明的缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2C)还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种DNA序列。

本发明的第二个目的是，提供一种DNA序列的应用。

本发明的第三个目的是，提供一种蛋白。

本发明的第四个目的是，提供一种蛋白的应用。

本发明的第五个目的是，提供一种重组表达载体。

本发明的第六个目的是，提供一种重组表达载体的应用。

本发明的第七个目的是，提供一种cDNA序列。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种分离的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列为：

a)如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或

b)与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的DNA序列在生产三酰甘油中的应用。

将亚油酸-、γ-亚麻酸-或α-亚麻酸-CoA的酰基转至DAG甘油骨架的sn-3位以产生三酰甘油。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：上述DNA序列编码的蛋白。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：所述的蛋白在生产三酰甘油中的应用。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：一种重组表达载体，所述的重组表达载体中含有上述的DNA序列。

所述的重组表达载体是由上述的DNA序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。

所述的质粒是pYES2质粒。

为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：所述的重组表达载体在生产三酰甘油中的应用。

为实现上述第七个目的，本发明采取的技术方案是：一种分离的cDNA序列，其特征在于，所述的cDNA序列为：

a)如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；或

b)与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明优点在于：

基于缺刻缘绿藻转录组测序数据，我们得到了一条长为533bp的片段(Contig8563)，它与Auxenochlorella protothecoides(GenBank登录号：XP_011397007.1)的DGAT基因有54％同源性且通过基因序列比对发现其不同于本课题组已经公开的基因序列(专利号分别为ZL201210477507.7、ZL201310668330.3及ZL201510646709.3)。基于该片段序列并利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆到该基因的全长cDNA序列，通过同源序列比对及聚类分析确定该基因为DAGT2家族，并且不同于本课题组已克隆到的另外两个DGAT2基因(专利号分别为ZL201210477507.7和ZL201310668330.3)，我们将此命名为MiDGAT2C。将该基因转化至酵母的TAG合成缺陷株H1246中表达，即进行基因功能互补实验，发现该基因的转入确实能使该酵母缺陷株H1246恢复合成TAG，证明了该基因编码蛋白具有合成TAG的功能。为了进一步了解MiDGAT2C与MiDGAT2A和MiDGAT2B在功能上是否存在差异，我们对它们进行了体外酶活性及底物偏好性分析，发现MiDGAT2C对花生四烯酸(ArA)-CoA没有催化活性，但能将亚油酸(LA)-、γ-亚麻酸(GLA)-或α-亚麻酸(ALA)-CoA的酰基转至DAG甘油骨架的sn-3位以产生TAG，且能力相近。

附图说明

附图1：基于DGAT基因所编码的氨基酸序列构建的系统进化树。

节点处的数值为自举值，基因的登录号放在拉丁学名后面的括号中，箭号指明本研究的基因。

附图2：缺刻缘绿藻MiDGAT2C基因结构示意图。

灰线是非翻译区，黑线为内含子，黑框为外显子。

附图3：酵母油脂的TLC图谱。

从左道到右道依次为TAG标准品(英国Nu-Chek公司)，缺陷株H1246，携带pYES2的转基因株，转MiDGAT2C的细胞株。

附图4：酵母细胞的Bodipy染色图片。

从左到右依次为酵母出发株Scy62，酵母缺陷株H1246，携带pYES2的转基因株，转MiDGAT2C的细胞株。图中的标尺长度相当于5μm。

附图5：MiDGAT的底物偏好性分析结果。

横坐标为酰基供体的脂肪酸，纵坐标为产生的TAG量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例

1、材料

1)缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl H4301)购自捷克布拉格查理斯大学藻类培养中心(CAUP)。在温度为25℃、光照强度为115μmol photons/(m²·s)、光/暗比为12h/12h的条件下培养，培养基为BG-11。

2)pYES2载体购自Invitrogen公司。酵母缺陷株H1246和出发株Scy62购自瑞典农业科技大学Dr.Stymne实验室。将酵母接种于SC培养基，在30℃下以200转/分钟(rpm)转速振荡培养。

3)胶回收试剂盒、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司；pMD-19T质粒、反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；SMART^TMRACE>

2、方法

1)取100mg刚收集的缺刻缘绿藻藻细胞置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。

2)分别利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和TRIzol试剂法提取缺刻缘绿藻的基因组DNA和总RNA，-20℃保存备用。

3)自转录组测序数据库(Ouyang et al.,2013)中筛选到一条长533bp的片段(编号为Contig8563)，它与Auxenochlorellaprotothecoides(GenBank登录号：XP_011397007.1)的DGAT基因有54％同源性，根据该片段序列设计引物，利用Clontech公司的SMART^TM>

4)利用天根生化科技(北京)有限公司生产的胶回收试剂盒并按照其说明步骤从琼脂糖凝胶中回收PCR产物。然后，按照宝生物工程(大连)有限公司提供的说明，将PCR产物过夜连接至pMD-19T载体。连接体系为：5μL的solution I(试剂盒携带)，4μL的胶回收产物，1μL的pMD-19T载体。

利用热激法将携带目的片段的pMD-19T转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化过程如下：将连接反应液加入到100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻涡旋震荡离心管的内容物；将离心管完全埋入冰中冰浴30min；42℃热激90s后，冰上放置1min；将每个离心管加890μL含氨苄青霉素钠(Amp)的LB液体培养基，在37℃下以180rpm的转速震荡培养2～3h，然后保存于4℃冰箱中。

通过蓝白斑筛选挑取阳性克隆菌落。方法如下：取100μL转化液平铺于含有5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal，40μg/mL)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，200μg/mL)、Amp(50μg/mL)的LB琼脂平板培养基上，37℃倒置静止培养10h～14h，形成单菌落；挑取3～5个单个白斑菌落，于2～3mL含Amp(50μg/mL)的LB液体培养基中，在37℃下以180rpm的转速震荡培养10～16h。

利用菌落PCR验证阳性克隆的菌体是否含有目的基因。其反应体系为：2×RTPrimer Mix 12.5μL，无RNase的水9.5μL，目的基因片段克隆相同的上游和下游引物各1μL，菌液模板1μL。菌落PCR反应程序为：94℃预变性3min，30个循环包含94℃变性50s、64℃退火45s、72℃延伸2min，最后72℃延伸10min。

分装1mL已验证的阳性克隆菌液送到上海生工生物工程有限公司测序，获得目的基因的序列。将测序得到的5’-和3’-片段与已知的序列片段进行拼接，并重新设计引物进行PCR扩增以验证，就得到MiDGAT2C基因的全长cDNA序列(SEQ ID NO:4)。

5)根据MiDGAT2C的cDNA全长序列设计一对引物(5’-ATGCCTTCTCTGGATAGCTTGCTGACA-3’(SEQ ID NO:5)，5’-TTAAGCCATGACGAGCTCCACGTCA-3’(SEQ ID NO:6))，以缺刻缘绿藻DNA为模版进行PCR扩增。扩增条件为94℃预变性5min，35个循环包含94℃变性45s、65℃退火45s、72℃延伸2min，最后72℃延伸10min。PCR产物按步骤4)经胶回收、TA克隆，送上海生工生物工程公司测序，得到缺刻缘绿藻MiDGAT2C的DNA全长序列(SEQ ID NO:7)。

6)根据MiDGAT2C的cDNA全长序列及质粒pYES2多克隆位点序列设计引物(上游引物：GAATTCATGCCTTCTCTGGATAGCTTG(SEQ ID NO:8)，下游引物：TCTAGATTAAGCCATGACGAGCTCCAC(SEQ ID NO:9))，它们含有XbaI和EcoRI的酶切位点，利用PCR扩增到带酶切位点的MiDGAT2C开放阅读框(ORF)序列。25μL的PCR扩增反应体系包含2.5μL的Ex Taq缓冲液、2μL的dNTP、2μL的Mg²⁺、2μL的cDNA模版、引物各1μL、0.25μL的Ex>

7)从大肠杆菌DH5α中抽提pMD19T-MiDGAT2C质粒，用限制性内切酶XbaI和EcoRI进行双酶切消化反应，同时对pYES2质粒也进行同样的双酶切反应。反应体系为4μL的10×M缓冲液，4μL的0.1％BSA，DNA约2μg，XbaI和EcoRI各1μL，加无RNase水至20μL。37℃消化反应4h。然后进行琼脂糖凝胶电泳并割胶回收酶切后的目的片段，用T₄DNA连接酶将酶切后的MiDGAT2C片段与pYES2片段连接得到重组载体pY-MiDGAT2C。连接反应体系为2.5μL的缓冲液，插入片段(MiDGAT2C)DNA约0.3pmol，载体pYES2片段DNA约0.03pmol，1μL的T₄DNA连接酶，加无RNase水至25μL。16℃连接过夜。连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，按照步骤4)进行克隆、菌落PCR验证和测序。从大肠杆菌DH5α中抽提pY-MiDGAT2C质粒，-20℃保存备用。

8)酵母感受态细胞制备。将酵母接种于SC培养基中，30℃复苏培养过夜，然后按1:100的比例接种，以200rpm的转速振荡培养至细胞密度约为1×10⁸个细胞/mL(约4～5h)。冰上冷却15min使细胞停止生长，4℃条件下以5000rpm的转速离心5min收集酵母细胞，用在4℃下预冷无菌水洗涤细胞3次，同样条件下离心收集。20mL预冷的1M山梨醇洗涤细胞1次，然后溶于0.5mL预冷的1M山梨醇，调整细胞的浓度在1×10¹⁰个细胞/mL。冰上保存细胞，便于电击使用。

9)利用电穿孔仪(Bio-Rad)电击，将重组的载体pY-MiDGAT2C转化酵母H1246感受态细胞。取在冰上预冷的待转化重组表达载体pY-MiDGAT2C的DNA5～10μL(约5～200ng)与感受态细胞混匀，并与0.2cm的电击杯一起冰上预冷，然后将DNA与细胞混合液转移到预冷的电击杯轻轻混匀，冰浴5min后，选择程序Sc2电击一次。移走电击杯，立刻加入1mL预冷的1M山梨醇，轻轻转移到新的YPD培养基中，30℃轻微振荡培养5h。将菌液涂布于含有1M山梨醇的尿嘧啶缺陷合成培养基(SC-U)上，30℃静止倒置培养48～72h。挑取菌落于液体SC-U培养基中培养。菌落PCR验证后，用含2％葡萄糖的SC-U培养基保存菌种。另外，按上述同样方法将空载体pYES2电转到H1246上。

10)将保存的转基因和非转基因酵母菌液接种于SC培养基中，在30℃下以200rpm的转速振荡培养72h，收集酵母，冻干。

11)冻干酵母的总脂提取。准确称量50mg酵母粉置于试管中，加入1mL氯仿:甲醇(1/2，v/v)，再加入200-300μL酸洗的玻璃珠，涡旋震荡15min，镜检观察细胞壁是否破碎完全。以4000rpm的转速离心15min，将上清移至新离心管中，加入400μL 50mM柠檬酸及600μL氯仿，充分混匀后，以4000rpm的转速离心15min，小心吸取下层溶液，放入酯化瓶中用氮气吹干。

12)薄层色谱(TLC)检测转基因酵母的TAG。所用展开剂为己烷:乙醚:冰醋酸(80/20/1，v/v/v)，显色剂为10％(w/v)的CuSO₄·5H₂O加到8％(v/v)的磷酸溶液。在提取的酵母总脂中加入30μL氯仿，用毛细管将样品点到硅胶60F254板(Merck公司)上，将薄板放入层析缸中展开。40min左右取出薄板，喷显色剂，140℃烘焙10min。对照三油酸甘油酯的TAG标准品(Nu-Chek公司)进行分析。

13)取诱导培养好的新鲜酵母菌液1mL，直接加入1μL的油体特异荧光染料Bodipy(Genmed Scientifics Inc.,USA)染色，暗室孵育10min后，用激光共聚焦显微镜(Leica公司)观察，拍照。激发波长490nm，发射波长515nm。

14)①在酵母诱导表达培养至细胞浓度为1×10⁷个细胞/mL时，吸取5mL新鲜的酵母菌液，移入到15mL锥形离心管中；②放进台式离心机离心10min，速度为3500×g离心力；③小心移去上清液，加入5mL灭菌水，混匀细胞颗粒群；④重复步骤②，移走上清后加入500μL细胞裂解液，混匀细胞颗粒群后加入100μL酸珠液；⑤强力涡旋震荡5min后，放进冰槽里孵育30min，再强力涡旋震荡2min；⑥转移到1.5mL离心管，放入微型台式离心机离心10min，速度为16000×g离心力；⑦小心吸取上清液至新离心管中，-80℃保存备用。

15)400μL的体外TAG合成反应体系中含有50mM(pH 7.5)的磷酸钾缓冲液、10mM的MgCl₂、100μg的粗蛋白提取液、750μM的酰基-CoA和750μM的DAG。30℃下反应1h后，按上述酵母的总脂提取方法提取总脂。

16)提取的总脂用氮气吹干后，加入50μL的氯仿进行复溶。采用雅特隆薄层色谱分析仪(Iatroscantm MK-6S TLC-FID)定量分析样品的TAG含量。由于标样的上样量是已知的，所以我们可以利用样品峰面积/标样峰面积×标样上样量，来求得TAG的量。

3、结果

1)根据Contig8563这条长533bp片段序列设计引物，利用RACE技术并经过PCR扩增验证，得到缺刻缘绿藻一条不同于MiDGAT1(两者氨基酸序列的同源性为32％)、MiDGAT2A(两者氨基酸序列的同源性为32％)和MiDGAT2B(两者氨基酸序列的同源性为30％)的cDNA全长序列(SEQ ID NO:4)，它的5’-非翻译区(UTR)长225bp，3’-UTR长743bp，ORF长1935bp，编码一个由644个氨基酸组成的蛋白质。基于它及相应物种的DGAT氨基酸序列，我们构建了它们的聚类图(图1)，结果显示它位于DGAT2家族，因此，将该基因命名为MiDGAT2C。利用缺刻缘绿藻基因组DNA为模版进行PCR扩增反应，产物经克隆、测序、拼接并验证，得到MiDGAT2C的DNA全长序列(SEQID NO:7)。它长5325bp，具有10个内含子，它们的长自5’-端开始分别为534bp、187bp、119bp、118bp、259bp、301bp、216bp、211bp、229bp和248bp，从而将该基因的ORF分成11个外显子(图2)。

2)根据MiDGAT2C的ORF及pYES2载体多克隆位点序列设计带有XbaI和EcoRI酶切位点的引物(SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9)，利用缺刻缘绿藻cDNA作模板进行PCR扩增，胶回收目的片段并进行TA克隆和测序验证，获得pMD19T-MiDGAT2C克隆质粒。将该克隆质粒和pYES2载体，用限制性内酶切XbaI和EcoRI进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后胶回收目的片段并利用T₄DNA酶进行连接，得到了重组表达载体pY-MiDGAT2C。利用电穿孔技术将该重组表达载体转入到TAG合成缺陷型酵母菌株H1246细胞进行互补实验，用SC-U固体培养基筛选转化子Y-MiDGAT2C。转基因酵母Y-MiDGAT2C经半乳糖诱导培养后，TLC检测结果(图3)显示，在转基因酵母Y-MiDGAT2C的总脂中检测到TAG的存在，说明MiDGAT2C所编码的蛋白具有TAG的合成功能，能够使TAG合成缺陷的酵母株H1246恢复TAG的合成能力；鉴于它在序列上不同于MiDGAT2A和MiDGAT2B，该结果也表明MiDGAT2C是缺刻缘绿藻DGAT2家族的一个新成员。

3)利用油体特异荧光染料Bodipy对转基因酵母Y-MiDGAT2C进行细胞染色，与酵母TAG合成缺陷株H1246相比较，发现转基因酵母Y-MiDGAT2C重建了油体(图4)，从而进一步说明了MiDGAT2C所编码的蛋白具有TAG的合成功能。

4)为了揭示MiDGAT2C在功能上不同于已报道的MiDGAT1(专利号ZL201510646709.3)、MiDGAT2A(专利号ZL201210477507.7)和MiDGAT2B(专利号ZL201310668330.3)，本研究自分别携带这4个目的基因的转基因酵母中提取粗蛋白，然后添加不同的酰基-CoA，构建体外的TAG合成反应体系，并利用棒状色谱检测TAG的生成量。结果(图5)显示，当用LA-CoA作为酰基供体时，MiDGAT2B合成的TAG量是最高的；当用ALA-CoA作为酰基供体时，MiDGAT1合成的TAG量是最高的；当用GLA-CoA作为酰基供体时，MiDGAT2A和MiDGAT2B合成的TAG量都较高；当用ArA-CoA作为酰基供体时，MiDGAT2A合成的TAG量是最高的，而MiDGAT2C却不能利用ArA-CoA合成TAG。这些结果表明：本研究的MiDGAT2C不能利用ArA-CoA但可以利用LA-CoA、ALA-CoA或GLA-CoA中的酰基来合成TAG，且对ALA-CoA和GLA-CoA利用能力相差不明显(P＝0.533＞0.05)；MiDGAT1偏好利用ALA-CoA中的酰基来合成TAG，MiDGAT2A偏好利用GLA-CoA或ArA-CoA中的酰基来合成TAG，而MiDGAT2B偏好利用GLA-CoA中的酰基来合成TAG。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海海洋大学

<120> 缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶（MiDGAT2C）基因序列及功能鉴定

<130> /

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaggcgatga gcgtgacggg gtt 23

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caggccggca tgagcggcag gtag 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcgtggagg tcgtgcgaga ggg 23

<210> 4

<211> 2920

<212> DNA

<213> 缺刻缘绿藻（Myrmecia incisa Reisigl H4301）

<400> 4

aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg gaaaaggaac ggagacaagc gataggcctt 60

gcacctttct attcgtcgca tactgactat cagaacaggg caatagccgg tggcggagag 120

caatgaactt ccgaaaccag atgacgtagt tgctacgtga tttcttgctt tacggctttc 180

gacagcttgg agtgtgcaga agcaacgctg gtagcagcga cgagaatgcc ttctctggat 240

agcttgctga caccgttcac ctttgcagca gtctacatat tcattcctag cgttcccctt 300

acgcacggcc tgggcctggt cgcgcattgt ccacggtctg ccaaagccaa gcacctattg 360

ctttacccag tcaaaggagg cagaaaccac tttatcttcc aagtcatctc ttgggctgtg 420

tgggcagctg cggtcttggt cgcactgcca gtggtgatac gcaagccctg gattgtcatc 480

cctgcatccc atgtagagct cctgtcgggc gccgccgcag tgggcggcgt gtttgccgag 540

ctcttcatga tcaagtcgct gctggtcttt gatcctgacg aggaccgagc gaccaggaag 600

aagagcgaca cgctgaccga cgatgacatc gaggacatgc ctgcctcccc caagtggaac 660

cggtccaggc tgccttccaa gcggagctcc tccgccgcgg tggtggctat gggggtgttg 720

tgggccgtca tgggcggtgc gctgctgctg gccacagagt acctggcaga gcagtccacc 780

agggagatgt attacatcct gtcgggcatc tgcctgctga tcggcgcgac caccacgcat 840

gggctgggcg gcaagctgcg ccatgacacg gcgcgggaag caggagcaga atccgcgcct 900

agctggcagt ttttccaacc cttcaggggc gggacgtggt ttgtagcgac gcaggcgctg 960

ggctgggtgc tgttcagcct gtccatcatg ggcctcatct ggctcatctc ccaggtcgcc 1020

gtcggtgtcg cttactgcat gcgctgctgg gcctgggccg tgggcgccgc catgttcacc 1080

gcccagctgg tgctcggcat gtccgtgctg accttcaacg cgcgcccgct gtcccgcaag 1140

gtgctgagcg tggtcgggcc cgtcaagccc atccggcgcg tgccctggct gaccgcctgg 1200

ctgcccatcc tcatgttcta cacgcccatc cactgcttcg tgtttgtgct gacgctgacg 1260

ttcatggtga tgccgcctaa ctttgccgtc gcgttctggg tcggctcgct catcatgtac 1320

tacagcctca ccagcggcat ggagccgcat cacacaggcc gtcgccagtg gccagcatgc 1380

cggaagtggc tgacggcaaa cctgcaggac tcattagagt cctggtttgg gagcgtggag 1440

gtcgtgcgag agggggacca gccgcttgat cctaatggca aatacatctt cggctaccag 1500

cctcatggcc tctttcccat aggcgcggcc tacctgccgc tcatgccggc ctgggcaaag 1560

ctgttcccgg gcatcaaccc cgtcacgctc atcgcctcgg tcgtcttcca caccccgctc 1620

atccgcgacc tgtgctcctg gtcgggcctg cgccaggtca gccggcgcac cttcatccac 1680

acgctgagcg agcgcggcag cgtggtcctc gtgcccggcg gacaggcgga gctggtgcat 1740

acatggcgca tgtttcagaa gcgccagtgg gtctgctaca ccaagcacag aggcttcatc 1800

cgcctggcga tcgagcaggg cgccagcctg gtgccgatcg tggtgtttgg cgagatcaac 1860

gcgctgcgca acctgatcag catcccgcag ctgcagcagt ggacctacaa gaagatcggg 1920

ttccccgtgc cctacctgct ggtcgggcgc tggggcatct cgccgctgcc cagccagacg 1980

ggcctgaagt ttgttatcgg cgagcccatc gcgccgccca agcacgagcc cggcacaccg 2040

gtggatgatg cacccttgaa ggagatgcac gacaagtact acgaggctgt ggccgccctt 2100

ttcaccaagc acaagcccag cttccccagc tatgctgacg tggagctcgt catggcttaa 2160

ggcaatgcgc tgatcttgtt caagatcagt gttaccactg tagtaacagg ggtgttgggg 2220

tgacgtctga catgctcagg gtgataaatt ggtgtcgtat atggttcggc agaaaccttg 2280

ttatgaactc aagcacggag tggcagcgta acgcgaagct cccaataagc aagctgcacc 2340

tcttgcggta tcagcaggcg caagtttttc aggtggaagg tcaagaatgt gttcttcaag 2400

taccttgtca tgcatgtgta tgcatgcagt ccatcgcaag tatactggtg gctgggtagt 2460

gccatggtgc acattttctg cctgcaaacg ttccgcctgc agcctcgatg gccaagaatt 2520

ctgtggttgc tggcggatca gctggtccgt tccttaaatg caatttggtt gcttgcactg 2580

gccttgtttg ttctgtcctt gctaataggt gcaccagctg tctagtgagc agttgtgatc 2640

atgagggttc cgcatatgtt gcgctgcaat aggcgtaact gagggtgtct gtcacgtcag 2700

tgcatgatcc tgttgacacc acatgtggtt ctctgcgggt ttggagctcg agtgtgcgag 2760

gcctgatgca attgtgtgca tgtatgagca gcctgctttg tagcacctgc ggagtgataa 2820

cgtatgacca acattgctat tcaggtcctt gtacgggacg tatgggttgt tggactcgat 2880

atgctgtaaa ctactgcacg gggaaaaaaa aaaaaaaaaa 2920

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgccttctc tggatagctt gctgaca 27

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttaagccatg acgagctcca cgtca 25

<210> 7

<211> 5325

<212> DNA

<213> 缺刻缘绿藻（Myrmecia incisa Reisigl H4301）

<400> 7

aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg gaaaaggaac ggagacaagc gataggcctt 60

gcacctttct attcgtcgca tactgactat cagaacaggg caatagccgg tggcggagag 120

caatgaactt ccgaaaccag atgacgtagt tgctacgtga tttcttgctt tacggctttc 180

gacagcttgg agtgtgcaga agcaacgctg gtagcagcga cgagaatgcc ttctctggat 240

agcttgctga caccgttcac ctttgcagca gtctacatat tcattcctag cgttcccctt 300

acgcacggcc tgggcctggt cgcgcattgt ccacggtctg ccaaagccaa gcacctattg 360

ctttacccag tcaaaggagg cagaaaccac tttatcttcc aagtcatctc ttgggtaagc 420

ctggtcgata ccttggtcgt ccagcctgtg tcgctcaatt gtttggcccc aggcttgggt 480

ttgcggcagc gccagcagta aacagcagca taacccgtgc tcgcttgtat atgcgtttgt 540

tgtcagtgct tggccttcgc cggtggtgcc agatcatctg caaccatgca ccctgtatgg 600

tggtggttgg ttagcccagg gcttggcgtt cactatattc agggcagcag ggagtatgtg 660

gcagctggct tggctcccgt ttgcacaata accggtcact gcggccttta aactgaccct 720

cggctgcagc tccacatgcc tggtcagcgt tagcttccct ggcagttgga accctcagcc 780

tgcccaataa tatgtgccag ctcaaactct tcagcaaagc acctgtcagc ctgaaggcgg 840

ccaactatgc cctggggttc tgaccacccc cccaagcgca cagcacggtc ccttcggtca 900

gcagccagcc agagtggcct tgctgacctg gcctgggctg ctgtgcaggc tgtgtgggca 960

gctgcggtct tggtcgcact gccagtggtg atacgcaagc cctggattgt catccctgca 1020

tcccatgtag agctcctgtc gggcgccgcc gcagtgggcg gcgtgtttgc cgagctcttc 1080

atgatcaagt cgctgctggt ctttgatcct gacgaggacc gagcgaccag gaagaagagc 1140

gacacgctga ccgacgatga catcgaggac atgcctgcct cccccaagtg gaaccggtcc 1200

agggtaggtg ctgcacaatg gccctgcgct ctgaactgca tgaccaaggg tctggcgact 1260

gcgccatgta ttgccgcttg cgtatgctga atgctctgca caacagccag gttgtacagc 1320

acaggccgcc ggcatgctgc gggaacgtgc atgcaggcag tgatgcaatg cccccctgtg 1380

cactgtgcag ctgccttcca agcggagctc ctccgccgcg gtggtggcta tgggggtgtt 1440

gtgggccgtc atgggcggtg cgctgctgct ggccacagag tacctggcag agcagtccac 1500

caggtgaact gcgtgttgtg tcatatgccc tgctaccgct gccactggtg gcctgctgtt 1560

gtggtgcaaa ctatagtgcg cgtgtcttgc tcctagattc tatggctttg actcctgcgc 1620

agggagatgt attacatcct gtcgggcatc tgcctgctga tcggcgcgac caccacgcat 1680

gggctgggcg gcaagctgcg ccatgacacg gcgcgggaag caggagcaga atccgcgcct 1740

agctggcagt ttttccaacc cttcaggtgg gggagatgtg cagatcagca ggtgcatgtg 1800

ccagctgggt acagcaccca gcagcctggt gcaccataaa cccaccaccc ttgttctgac 1860

gtgctttggg cgtgtcgatg gcaggggcgg gacgtggttt gtagcgacgc aggcgctggg 1920

ctgggtgctg ttcagcctgt ccatcatggg cctcatctgg ctcatctccc aggtcgccgt 1980

cggtgtcgct tactgcatgc gctgctgggc ctgggccgtg ggcgccgcca tgttcaccgc 2040

ccagctggta cgccatctgg agcccaaccc ctttcattga gctgcatgca gctcaaactt 2100

gtcgagctgc agatgacggt ctggtgcttg gccggtctgg cgccctgcct tgcgccattg 2160

tcaaagagct caaggcctgt ggccgaagat cagggtgtcc tgatcgatgc acaacggccg 2220

ttcttgacct gcaaccatct gtacagcggg ctgtggggct tgcactggct gctgtgatgc 2280

tgacaccacc catctgcacg ttgcaggtgc tcggcatgtc cgtgctgacc ttcaacgcgc 2340

gcccgctgtc ccgcaaggtg ctgagcgtgg tcgggcccgt caagcccatc cggcgcgtgc 2400

cctggctgac cgcctggctg cccatcctca tgttctacac gcccatccac tgcttcgtgt 2460

ttgtgctgac gctgacgttc atggtgatgc cgcctaactt tgccgtcgcg ttctgggtcg 2520

gctcgctcat catgtactac agcctcacca gcggcatgga gccgcatcac acaggtatgc 2580

gaggcccatt tagaagctgg gcaccggttg ccatggtctt gcatgtacgg ctggtagttt 2640

ctgatgacac aggctgacat gtgcctgctc tgcatgcatc gcccttcgca tctgactgtg 2700

gacgcatggc taccagcttg gcttggcttg ggcgtggcca ccactggatg cagcgttgcc 2760

tgtacatcac tactgttgca cagccaacct gcaagagctt cactggcaca cccgcgtgcg 2820

cacttgttgc gacatgctga taacattcga gtcatggctt ttgtgccgcg cacaggccgt 2880

cgccagtggc cagcatgccg gaagtggctg acggcaaacc tgcaggactc attagagtcc 2940

tggtttggga gcgtggaggt cgtgcgagag ggggaccagc cgcttgatcc taatggcaaa 3000

tacatcttcg gctaccagcc tcatggcctc tttcccatag gttagccgtg atctgggcac 3060

ttgtactatg ctcacatgct gcatgggtcc agtgtgccct ctgtagggtt tcatgatgca 3120

gcctatgcca ggtccaggtg cctgccagcc ccctttgcgg tgacgcaaac tcctgagact 3180

ctgcagctct attgtcatgc tagtcgtagc aggggttgat gcatcgagat gctgagtgct 3240

gccatccgca ttgcaggcgc ggcctacctg ccgctcatgc cggcctgggc aaagctgttc 3300

ccgggcatca accccgtcac gctcatcgcc tcggtcgtct tccacacccc gctcatccgc 3360

gacctgtgct cctggtcggg cctgcgccag gtcagctgct gcatccctac ctgctccgct 3420

cggctgcatt gagctgacca ggcccgtttt cgtggtcacg atgttttggt tgttggtaag 3480

cttcatcatt ggcccagtgt caaggagggt cagtggggcg ctgtacgctt taacatgcaa 3540

atgcttggct tgctcgcctt ggtaattgct ggtgttgaac ctgctgcttt aacgcctgca 3600

ggtcagccgg cgcaccttca tccacacgct gagcgagcgc ggcagcgtgg tcctcgtgcc 3660

cggcggacag gcggagctgg tgcatacatg gcgcatgttt cagaagcgcc agtgggtctg 3720

ctacaccaag cacagaggtg ggccgcctgc aaggcacaca gctggaacag acataggccc 3780

attgccgtgc cccaagggag ctgacttgtg atcttctgca gccctgctgg cgttgctcct 3840

ccacctgcca cacacgctgt ccattggctg actccactcg ctgacataaa atctgcgctg 3900

gtgagcataa cttgccgtac atgtcatttg gaagctcatg gagctgcccc tgccattccc 3960

ttgcaggctt catccgcctg gcgatcgagc agggcgccag cctggtgccg atcgtggtgt 4020

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agcccggcac accggtgcgc tgcgcctgct gggacatgca tgtgatctgc tcttgttttt 4260

tgcacctgtc cggcccgcat ctgcgtaata aggcaaacct gcaaaggacc tgggtagcag 4320

ctgatccttt ggatcaccac tgctgctttg ccctgcacac ttgtgttcac gtgcctgttc 4380

tgcacgcctc gtgtgcagct tgtgcagtct actgtgttgc actcagtgtt cctgttgaca 4440

agtagctgat ggggcgttgt aggtggatga tgcacccttg aaggagatgc acgacaagta 4500

ctacgaggct gtggccgccc ttttcaccaa gcacaagccc agcttcccca gctatgctga 4560

cgtggagctc gtcatggctt aaggcaatgc gctgatcttg ttcaagatca gtgttaccac 4620

tgtagtaaca ggggtgttgg ggtgacgtct gacatgctca gggtgataaa ttggtgtcgt 4680

atatggttcg gcagaaacct tgttatgaac tcaagcacgg agtggcagcg taacgcgaag 4740

ctcccaataa gcaagctgca cctcttgcgg tatcagcagg cgcaagtttt tcaggtggaa 4800

ggtcaagaat gtgttcttca agtaccttgt catgcatgtg tatgcatgca gtccatcgca 4860

agtatactgg tggctgggta gtgccatggt gcacattttc tgcctgcaaa cgttccgcct 4920

gcagcctcga tggccaagaa ttctgtggtt gctggcggat cagctggtcc gttccttaaa 4980

tgcaatttgg ttgcttgcac tggccttgtt tgttctgtcc ttgctaatag gtgcaccagc 5040

tgtctagtga gcagttgtga tcatgagggt tccgcatatg ttgcgctgca ataggcgtaa 5100

ctgagggtgt ctgtcacgtc agtgcatgat cctgttgaca ccacatgtgg ttctctgcgg 5160

gtttggagct cgagtgtgcg aggcctgatg caattgtgtg catgtatgag cagcctgctt 5220

tgtagcacct gcggagtgat aacgtatgac caacattgct attcaggtcc ttgtacggga 5280

cgtatgggtt gttggactcg atatgctgta aactactgca cgggg 5325

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaattcatgc cttctctgga tagcttg 27

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tctagattaa gccatgacga gctccac 27