一种结合远缘杂交和组织培养高效创制杜鹃新种质的方法

摘要

本发明提供了一种结合远缘杂交和组织培养高效创制杜鹃新种质的方法，该方法以东鹃系列品种‘胭脂蜜’为父本，春鹃系列品种‘春五宝’为母本进行杂交，收集当年杂交所得蒴果，剥离种子，并采用特定的组培技术在3个月内便可发育为7‑10个芽、8‑10cm左右高的无菌苗，经过继代生根后，可获得4‑6倍的扩繁系数，相比于传统的大田扦插或嫁接繁殖(1年的繁殖系数在20以内)能够大大缩短新品种选育的周期。

说明书

技术领域

本发明属于植物杂交选育技术领域，具体而言，涉及植物的远缘杂交及组织培养选育新种质的方法，尤其涉及一种结合远缘杂交和组织培养高效创制杜鹃新种质的方法。

背景技术

杜鹃花(Rhododendron spp.)为杜鹃花科杜鹃花属植物，俗称映山红，是中国“十大传统名花”之一，开花时花叶繁茂，花色艳丽，灿若云霞，具有很高的观赏价值和非常丰富的园林应用价值。中国是杜鹃起源与多样化分布中心，野生资源的分布有近571种，占到全世界杜鹃野生种质资源的将近2/3，这些野生种质在观赏性与适应性上有着极大的变异，是值得广泛利用的种质资源。

由于以英国、比利时等为代表的欧美国家从亚洲尤其是中国引种野生资源，通过近300年来不断的杂交工作，目前选育出的园艺杜鹃花品种已有近万个，其中最常见的可分为五大品种群，包括春鹃、夏鹃、东鹃、西鹃、高山杜鹃等品种群。其中，春鹃也常被称为毛鹃，因其先开花后发芽，四月中、下旬、五月初开花，因而被叫作春鹃。花开时十分绚丽，花开三朵，花大，直径可达8厘米左右，花冠较宽为喇叭状，颜色多样，是大白杜鹃、锦绣杜鹃及其近缘种的杂交后代，在我国南方有着较好的适应性。夏鹃于春天时长枝发叶，5～6月开花，其株型低矮，树冠丰满，耐修剪。叶片长3～4厘米花型为单瓣、重瓣和套瓣，也有不同的形状，它们是皋月杜鹃的杂交后代。西鹃是观赏性最高的一类，最早由比利时等国家选育而出，其树冠繁茂，花大色艳，花期较长，是市场上最受欢迎的一类杜鹃品种，是以映山红等为亲本经反复杂交选育成的品种。东鹃原是由日本引进，主要特征为植株低矮，枝条细软，叶片较薄，嫩绿有光泽。花开1～3朵，有时4～5朵，可谓是“只见枝叶不见花”，花色较为丰富，它们为石岩杜鹃及其杂交后代，部分品种也具有较好的适应性。

然而，由于欧洲国家气候多冷凉，品种选育针对的是当地的气候条件，以致目前的西洋杜鹃品种不能很好的在我国引种栽培。与些同时，近年来，国内有单位进行了成功的育种尝试，包括芽变选种与杂交等，目前已经有在国家林业局登记的杜鹃花新品种，但一方面数量非常少，另一方面它们目前无一能在我国南方地区大规模推广应用，究其原因，很大程度上是因为它们对我国长江以南的炎热夏季缺乏很好的适应性。

杂交选种是培育杜鹃品种最常用最有效的方法之一，由于杜鹃园艺栽培种的耐热性很差，所以育种家期望通过野生耐热杜鹃与栽培杜鹃的远缘杂交获得抗性强的杜鹃新品种，然而杜鹃属内远缘杂交不亲和限制了这种育种手段的应用。远缘杂交不亲和可能发生在受精前，也可能发生在受精后出现败育。如何克服杜鹃花属远缘杂交障碍，这一直是育种家重视并期待解决的问题。

对于打破杜鹃种间杂交受精前期不亲和的限制，国内外有一些相关的研究。例如，Kho和Ваёr等认为控制亲本处于较低的生长温度有助于有鳞杜鹃与无鳞杜鹃的杂交(Khoet al.,1993)，Lee和Ryu比较了花粉用热处理、去掉花柱、正乙烷预处理花粉等方法对克服R.yedoense×R.japonicum授精前障碍的作用，发现用正乙烷处理效果较好，杂交结实率高达86％(Lee et al.,1994)。克服杜鹃花远缘杂交障碍时，还应注重杂交方式。对于杂交前的不亲和障碍，通过优化亲本选配或选择桥梁亲本三交和回交也被证实是克服杜鹃花杂交障碍的较为有效手段(Ureshino et al.，1998；Ureshino et al.，2006)。

受精后的杂交障碍，主要表现为胚或者胚乳败育，最终无法获得有活性的杂交种子或者在杂交后期，小苗发育不良，表现为黄化或者根生长受到抑制，对于此种类型的杂交障碍，近年来有通过胚挽救获得成功的科学尝试。Eeckhaut等为了获得黄色、蓝色和橙色的品种，以R.tsutsusi为母本进行亚属间杂交发现，在WPM培养基里增加50mmol/LGA₃可提高胚珠培养的成活率，之后他以R.simsii‘Dogwood>3的WPM培养基中发现，补充145μmol/L>3可显著提高这些种子的萌发率，之后将得到的种苗在WPM+4.5μmol/L2iP的培养基上进行离体扩繁，最后大约有9％的组培苗炼苗成功(Eeckhaut>

现有技术中杜鹃进行杂交育种时，往往重视了亲本选配等合子胚形成前期的工作，但对后期的工作缺乏系统研究，限制了杜鹃杂交尤其是种间的远缘杂交在新种质资源创质方面的运用；这些因素不利于杜鹃花种间杂交的遗传育种工作。因此，通过研究获得一种实现杜鹃花远缘杂交与组织培养的方法，以解决杜鹃种间杂交后代种子萌发率差、成苗弱、生根不良及繁育周期偏长等问题，并实现杜鹃花优异种质的快速高效无菌培养，同时可以将春鹃品种的优良抗逆性性状转入杜鹃观赏品种中，有效的改良了杜鹃种质，对充分利用我国丰富的野生杜鹃花种质资源，丰富杜鹃花品种的遗传基础、优化育种技术发挥重要的积极作用，这对于杜鹃花的原创性育种工作及产业的可持续发展显得尤为重要。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于通过特定的父母本材料，而提供一种结合远缘杂交和组织培养高效创制杜鹃新种质的方法，从而实现杜鹃种间的杂交，并快速繁殖到综合性状优良的特异种质，进而创制杜鹃花新品种并为实现种质资源的快速繁育。

为了实现本发明的上述目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终获得了一种春鹃与东鹃之间杂交并结合组织培养高效创制杜鹃新种质的方法。该方法包括如下步骤：

(1)亲本材料的选择：父本为东鹃系列品种‘胭脂蜜’，母本为春鹃系列品种‘春五宝’，以它们为亲本材料进行杂交；

(2)花期杂交授粉：选择处于气球状时期的大花蕾，开花前对母本进行去雄套袋，并收集父本的新鲜花粉，于晴天上午9:00～12:00进行常规人工授粉，授粉后给母本套上硫酸纸袋，封好套袋口，标记父母本名称和授粉日期；

(3)杂交种子的无菌萌发与生根培养：于杂交当年11月中旬～12月底收集杜鹃杂交所得蒴果，将其在无菌环境下剥开，取得纯净无杂质的种子，将种子经过消毒处理后，置于3-5℃环境中预处理18-22天，然后铺于萌发培养基上进行萌发培养，培养条件是温度24～26℃、相对湿度65～75％、光周期16/8h，成苗后将小苗转移到生根培养基中，继续培养成约8～10cm高的的杜鹃无菌组培苗；

(4)组培苗的快速繁殖：将杜鹃无菌组培苗切取带芽茎段，将其接种至生根培养基中，进行继代生根培养，得到杂种苗；

(5)杂种苗的炼苗与移栽：待杂种苗生长至根系较壮后，揭开瓶盖进行炼苗，将炼苗后的幼苗移栽至盛有泥炭土的营养钵中，盖上薄膜遮荫，直至植株成活后，揭去薄膜，在温室中按常规杜鹃苗进行管理。

进一步优选地，如上所述的一种结合远缘杂交和组织培养高效创制杜鹃新种质的方法，其中步骤(3)所述的消毒处理的方式是1.5％NaClO溶液处理9-11min，75％乙醇浸泡25-35s，随后用无菌水洗涤2-3次。

进一步优选地，如上所述的一种结合远缘杂交和组织培养高效创制杜鹃新种质的方法，其中步骤(3)所述的萌发培养基为1/2WPM培养基+GA₃80～120mg/L，pH＝5.6。

进一步优选地，如上所述的一种结合远缘杂交和组织培养高效创制杜鹃新种质的方法，其中步骤(3)和步骤(4)所述的生根培养基为1/2WPM+IBA0.1～0.5mg/L+NAA0.4～0.6mg/L+活性炭0.04～0.06％，pH＝5.6。

进一步优选地，如上所述的一种结合远缘杂交和组织培养高效创制杜鹃新种质的方法，其中步骤(3)和步骤(4)所述的生根培养条件为：24～26℃、暗光培养28～32天后置于3000～4500lux下，16/8h光周期培养55～65天。

与现有技术相比，本发明涉及的春鹃与东鹃之间杂交并结合组织培养高效创制杜鹃新种质方法具有如下有益效果和突出优点：其一，能够高效创制新种质，春鹃根据其植物学分类来讲与东鹃不一样，二者在花期等观赏性状及抗旱耐热等适应性上也有很大差异，它们的杂交属于种间远缘杂交的范畴，虽然难度比种内杂交大，但易于产生新的基因组合，形成创新种质资源；其二，高效的快繁系统，获得成功的杂种后代无菌苗后，3个月内便可发育为7-10个芽、8-10cm左右高的无菌苗，经过继代生根后，可获得4-6倍的扩繁系数，以平均扩繁系数为5来计算，一年之内可继代4次，因此每个杂交后代能获得5⁴＝625倍的扩繁，对于优异杂交后代的大规模稳定生产，能够快速繁育是至关重要的环节，相比于传统的大田扦插或嫁接繁殖(1年的繁殖系数在20以内)能够大大缩短新品种选育的周期；其三，降低了栽培管理的难度，同时便于获得具备性状一致性和稳定性的无性无菌繁殖材料，相对于通过传统的大田扦插繁殖或嫁接繁殖，除了缩短繁育周期，更值得注意的一点是，由于是无菌和稳定可控的生长环境，使得新种质免受病虫害和高温、干旱、土壤营养与pH值等多种环境因素的制约，而杜鹃在生产中此类问题频发，包括营养成份缺乏导致的缺素症，对环境适应性相对较差导致的干旱和高温致死问题、易感红蜘蛛、叶螨、蚜虫、网蝽、军配虫、銹病、灰霉病、褐斑等多种病虫害，这些问题一方面增加了生产与栽培管理的成本，二来不利于保持无性繁殖性状的稳定一致性，不利于后期的性状评估与新品种申请和保护。综上所述，对于杜鹃花新种质的创制来讲，结合种间杂交和组织培养的方法具有较多优势，同时本发明的方法易于实施，便于推广。

附图说明

图1为离体萌发法测定花粉生活力；

图2为杜鹃花柱头可授性检测；其中，A为不同东鹃品种开花及柱头变化情况；B为联苯氨－过氧化氢检测柱头可授性；C为不同东鹃品种正常柱头与异常柱头对比。

图3为不同消毒处理对杜鹃杂交种子污染率的影响；

图4为不同消毒处理对杜鹃杂交种子发芽效果的影响；

图5为不同处理对种子萌发诱导的影响；

图6为不同培养基上杜鹃继代生根情况统计；

图7为春五宝(父本)×胭脂蜜(母本)的杂交后3周子房照片；

图8为南希玛丽×云景、霸王红×云景杂交后种子及本发明正常发育的杜鹃杂交种子照片，其中，图8A、8B的上面分别为霸王红×云景、南希玛丽×云景杂交后种子，图8A、8B的下面均为正常发育的杜鹃杂交种子。

具体实施方式

以下实施例进一步描述本发明方法的实施过程和有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变也包含在本发明范围之内。另外，本发明所采用的试剂，其中：

GA₃的化学成分为赤霉素，使用时配制成高浓度母液，即0.5mg/mL。具体配制方法：称取50mgGA₃，先用2-3mL95％酒精溶解，然后用蒸馏水定容至100mL，即可使用。

IBA的化学成分为吲哚丁酸，使用时配制成高浓度母液，即0.5mg/mL具体配制方法：准确称量IBA50mg，用2ml1mol/L氢氧化钠溶液使之完全溶解后，再加蒸馏水定容至100ml，即配成浓度为0.5mg/mL的母液。

NAA的化学成份为奈乙酸，使用时配制成高浓度母液，即0.5mg/mL具体配制方法：准确称量NAA50mg，用8-10ml 95％酒精使之完全溶解后，再加蒸馏水定容至100ml，即配成浓度为0.5mg/mL的母液。

实施例1：‘胭脂蜜’ב春五宝’杂交试验

根据花粉生活力试验结果(图1)和柱头可授性研究(图2)等，确定最终的亲本组合，其中，杂交父本为东鹃系列品种‘胭脂蜜’，母本为春鹃系列品种‘春五宝’，以它们为材料进行杂交试验。具体流程为选择处于气球状时期的大花蕾，开花前对母本进行去雄套袋，收集父本的新鲜花粉，于晴天上午9:00-12:00进行常规人工授粉，各组合至少重复20朵花，授粉后继续套袋并挂上标签，授粉后给母本套上硫酸纸袋，封好套袋口，标记父母本名称和杂交日期；于杂交当年11月中旬-12月底收集杜鹃杂交蒴果。

实施例2：杜鹃杂交种子不同消毒处理试验

取实施例1杂交试验得到的蒴果，将其在超净工作台进行剥开，并取得纯净无杂质的种子，将种子经过如表1所示的不同类型的消毒后，铺于萌发培养基(1/2WPM培养基+GA₃100mg/L，pH＝5.6)上进行萌发培养，将培养皿置于温度为24-26℃、相对湿度为65-75％、光周期为16/8h的恒温培养箱中培养，并顺利成苗，而后将小苗转移到生根培养基中继续培养成约8－10cm高的的杜鹃无菌组培苗。

表1杜鹃杂交种子不同消毒处理设计表

每个处理设3次重复，每次重复接种100粒种子。先将种子用吐温20的水溶液洗涤1次，然后分别用1％、1.5％、2％NaClO溶液(5/10/15/20min)，20％、30％双氧水(5/10/15/20min)消毒，随后用75％酒精浸泡洗涤30s，无菌水冲洗5次，每次1min，最后将种子接种于1/2WPM培养基，在25℃下培养7天后，记录菌落数，计算种子污染率；培养第14天统计种子发芽情况，计算萌发率。

由图3可知，随着NaClO溶液使用浓度的增加，其污染率逐渐降低。同时NaClO溶液浓度为1.5％和2.0％时，其污染率随着处理时间的延长而降低，而NaClO溶液浓度为1.0％时，其污染率在处理时间10min时最大，随后再随着时间增加而降低。随着H₂0₂溶液浓度和时间的增加，其污染率也有一定程度的降低。如图3所示可看出，NaClO溶液处理较之于H₂0₂溶液对于杜鹃杂交种子的消毒作用较好。

由图4可知，杜鹃杂交种子在经过不同浓度和时间的消毒方式处理后，种子的发芽率发生了很大的变化。1.0％NaClO溶液处理10min的种子发芽率最高，但综合图3所示，发现该消毒处理下的种子的污染率也是最高的。污染率最低的消毒方式为2.0％NaClO溶液处理20min，然而其发芽率同时也是最低的。因为杀菌效果好的杀菌剂毒性更大，浸泡时间长，种子容易受到毒害而影响发芽率。NaClO溶液处理后杜鹃杂交种子的发芽效果比H₂0₂溶液处理要好，综合图3所示结论，可以确定NaClO溶液更适合作为杜鹃杂交种子的消毒剂。同时，经过综合比较，得出杜鹃杂交种子的最佳消毒处理方式为1.5％NaClO溶液处理10min。

实施例3：杜鹃杂交种子组培用培养基的筛选

将实施例1杂交试验得到杜鹃杂交种子用1.5％NaClO溶液处理10min，75％乙醇浸泡30s，随后用无菌水洗涤2-3次后，将种子接种于不同培养基，在25℃下培养，生长5周后分级统计萌发小苗的生长状况(叶片颜色、株高、根长)。选用的培养基为：1/2MS,MS,1/2WPM,WPM,并以H₂O作为空白对照培养基。

如表2所示，四种培养基在一定程度上都有利于萌发小苗的生长，而WPM培养基明显优于MS培养基。同时1/2WPM培养基培养在叶色、株高、根长上都能稳定高效的促进小苗的生长，所以我们可以得出结论，1/2WPM培养基为杜鹃无菌播种的最适培养基。

表2不同培养基对幼苗生长的影响

注：叶片颜色：*(偏黄),**(浅绿),***(深绿)；株高：*(＜2mm),**(2mm～5mm),***(＞5mm)；根长：*(＜5mm),**(5mm～10mm),***(＞10mm)。

实施例4：杜鹃杂交种子萌发的诱导试验

为了筛选出更适合杜鹃杂交种子的诱导培养基，采用GA₃和NAA两种生长调节剂进行不同浓度的激素处理，以及不同时间的4℃低温处理。并以低温+激素组合处理的方法探索最合适的诱导杜鹃杂交种子萌发的培养基处理。

种子消毒后，接种到以下培养基，每个培养基接种100粒种子，三次重复。在25℃环境下培养14天，统计种子发芽数，计算萌发率。

A1：1/2WPM+4℃低温处理0d

A2：1/2WPM+4℃低温处理5d

A3：1/2WPM+4℃低温处理10d

A4：1/2WPM+4℃低温处理20d

B1：1/2WPM+GA₃0mg/L

B2：1/2WPM+GA₃5mg/L

B3：1/2WPM+GA₃20mg/L

B4：1/2WPM+GA₃100mg/L

C1：1/2WPM+NAA0mg/L

C2：1/2WPM+NAA0.1mg/L

C3：1/2WPM+NAA0.5mg/L

C4：1/2WPM+NAA 1.0mg/L

D1：1/2WPM+4℃低温处理10d+GA₃20mg/L

D2：1/2WPM+4℃低温处理10d+GA₃100mg/L

D3：1/2WPM+4℃低温处理20d+GA₃20mg/L

D4：1/2WPM+4℃低温处理20d+GA₃100mg/L

如图5所示，4℃低温处理、GA₃处理、NAA处理都在一定程度上可以促进种子的萌发。4℃低温处理后种子萌发率呈现一种先上升后下降再回升的曲线，并且在处理20天后萌发率达到最大值，为44.67％。GA₃处理随着处理浓度的增加，种子萌发率越高，最高达到46％。而NAA处理随着浓度增加，萌发率呈现一种先上升后略有下降的趋势，当0.5％NAA处理时，其萌发率达到最高，为41.67％。综合可见，GA₃处理后的种子萌发效果优于NAA处理。设置GA₃处理与低温处理组合试验，结果如图5所示，组合处理后，种子萌发率比单一处理时有一定程度的增高，在20天低温处理+100mg/L>3处理下，种子萌发率达到最高，为56.67％。

实施例5：杜鹃杂交种子的生根培养与快速繁殖

取实施例1杂交试验得到的蒴果，将其在超净工作台进行剥开，并取得纯净无杂质的种子，将用1.5％NaClO溶液处理10min，75％乙醇浸泡30s，随后用无菌水洗涤2-3次后，先置于4℃环境下预处理20天，再铺于萌发培养基(1/2WPM培养基+GA₃100mg/L，pH＝5.6)上进行萌发培养，将培养皿置于温度为24-26℃、相对湿度为65-75％、光周期为16/8h的恒温培养箱中培养，并顺利成苗，而后将小苗转移到普通生根培养基中继续培养成约8－10cm高的的杜鹃无菌组培苗。将杜鹃无菌组培苗在超净工作台上切下茎段，每个茎段带两个腋芽，将茎段基部插入含不同浓度组合的IBA与NAA(表3)的杜鹃组培苗继代生根培养基中，培养基基本配方为1/2WPM+IBA+NAA0.8％琼脂粉+活性炭0.05％，pH＝5.6。将培养基置于25℃条件下，暗光培养30天后置于3000－4500lux下，16/8h光周期培养。光周期下培养60天后，可根据需要，再次对长成的无菌杜鹃苗进行继代生根培养。

表3杜鹃组培苗生根培养基配方

经过1个月的暗光培养，然后将培养基进行2个月的光周期培养后，我们对不同培养基生根的效果进行了比较，由图6可以发现9种培养上继代生根的效果有很大差异，其中，5号培养基(1/2WPM+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.05％)具有最高的生根率，平均生根率达到38.37％，值得说明的是，因为较高浓度活性炭的加入，使得培养基不透光，导致萌发的小根未列入统计，同时，随着培养时间的延长，有更多的茎段底部着生出肉眼可见的根系，其生根率不断增加，以5号培养基为例，在经过2个月的光周期培养后，生根率超过90％。

实施例6：优良品系资源的移栽与评价

对实施例5的杂种苗进行炼苗后将其移栽至大田，将炼苗后的幼苗移栽至盛有泥炭土的营养钵中，盖上薄膜遮荫，直至植株成活后，揭去薄膜，在温室中按常规杜鹃苗进行管理。进行观赏性与耐热性的评估，结果显示：杜鹃杂交种质后代发生了显著的性状分离，包括叶色深绿－浅绿、株型紧凑－开张、株高低－高、高温适应性强－弱等分离，其耐热性在实验室表现较好，夏季高温期间叶片黄化脱落的比例较其它杂交组合低，同时，不易感各种生理性病害。

值得注意的是，在整个研究试验的过程中，我们遇到了多个失败试验，例如，在选取杂交亲本的时候，筛选出的杂交组合，胭脂蜜(父本)×春五宝(母本)能够正常完成双授精过程并结实，最终收获杂交种子并萌发成苗。然而，以它们为亲本进行反交试验，即春五宝(父本)×胭脂蜜(母本)的杂交组合，在授粉完成后3周左右，未见子房膨大(参见图7)，同时不能完成后期合子胚的发育，导致杂交失败。与此相似，杂交失败的例子较多，例如，以南希玛丽×云景、霸王红×云景等材料进行的杂交组合，虽然也都能获得杂交种子，但因其发育不良，种子干瘪(参见图8)，后期未见萌发。有的杂交后收获的杂交种子，在土播的情况下，萌发率很低或基本不萌发，在经过低温处理同时结合无菌培养的手段后，萌发率得到了提高，这样的例子可见于胭脂蜜(父本)×春五宝(母本)、红孩儿(父本)×云景(母本)等多个杂交组合；同时，以观赏性状特异的种质资源羊踯躅为父本，以春五宝等多个材料为母本，仅在羊踯躅(父本)×繁景(母本)的杂交组合中获得了最终的萌发苗，在2014－2017年的杂交试验中，种间远缘杂交的总体成功率低于20％。尤其是对于杜鹃花属多亚组之间的杂交，亲缘关系越远，越有可能获得特异新种质，然而，它们在杂交过程中越是容易遭遇失败，包括不能完成双受精过程、不能发育为饱满的合子胚或胚后发育不良，这说明杜鹃属远缘杂交之间的不亲合障碍是可由多种因素导致，包括需要结合亲本选配、组织培养等手段予以优化并解决一部分问题。