解除PD-1对机体免疫抑制的靶向分子

摘要

本发明公开了一种解除PD‑1对机体免疫抑制的靶向分子，该靶向分子是阻断PD‑1功能的单克隆抗体及其编码基因。它包括重链和轻链，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。本发明新发现了一种能阻断PD‑1功能的单克隆抗体及其编码基因，该单克隆抗体能够与PD‑1抗原特异性结合，可以特异性阻断PD‑1/PD‑L抑制信号，因此可以将本发明的单克隆抗体作为PD‑1通路的阻断剂，从而成为肿瘤免疫治疗、慢性病毒感染性疾病及自身免疫性疾病的治疗一种新药物。

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤治疗、分子免疫学领域，涉及一种解除PD-1对机体免疫抑制的靶向分子，具体涉及一种特异性结合PD-1的单克隆抗体。

背景技术

适应性免疫应答包括称为T细胞和B细胞的两大类淋巴细胞的激活、选择和克隆增殖。在遭遇抗原之后，T细胞增殖并分化为抗原特异性效应细胞，而B细胞增殖并分化为抗体分泌性细胞。

T细胞激活是需要T细胞和呈递抗原细胞(APC)之间的数个信号传导事件的多步过程。为使T细胞激活发生，必须将两类信号递送给静息T细胞。第一类是由抗原特异性T细胞受体(TcR)介导的，并赋予免疫应答特异性。第二种共刺激类型，调控着应答的量级并且是通过T细胞上的辅助受体递送的。

初级共刺激信号是通过活化CD28受体经与其配体B7-1或B7-2的接合而递送的。相反，抑制性CTLA-4受体与相同的B7-1或B7-2配体的接合，则导致T细胞应答的削弱。从而，CTLA-4信号拮抗由CD28所介导的共刺激。在高抗原浓度下，CD28共刺激胜过CTLA-4的抑制效应。CD28和CTLA-4表达的时序调节维持了激活和抑制信号之间的平衡，并确保了有效免疫应答的形成，而同时预防了自身免疫性的发展。

最近业已鉴定了CD28和CTLA-4及其B-7样配体的分子同系物。ICOS为CD28-样共刺激受体。PD-1(程序性死亡1)为抑制性受体和CTLA-4的相似物。PD-1为50-55kDa的I型跨膜受体，其最初是在经历激活诱导的细胞凋亡的T细胞系中鉴定的。PD-1表达于T细胞、B细胞和巨噬细胞之上。PD-1的配体为B7家族成员PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)。PD-1是免疫球蛋白(Ig)超家族成员，在其胞外区含有单个Ig V-样结构域。PD-1胞浆结构域含有两个酪氨酸，其中最接近于膜的酪氨酸(小鼠PD-1中的VAYEEL)位于ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)之内。PD-1上ITIM的存在预示着该分子通过募集胞浆磷酸酶发挥作用以削弱抗原受体的信号传导。人和鼠PD-1蛋白共有大约60％的氨基酸同一性，具有保守的四个潜在的N-糖基化位点以及限定Ig-V结构域的残基。胞浆区中的ITIM以及羧基末端酪氨酸(人和小鼠中的TEYATI)周围的ITIM-样基序在人和鼠直向同源物(orthologue)之间也是保守的。

PD-1表达于激活的T细胞、B细胞和单核细胞之上。实验数据暗示了PD-1与其配体在下调中央和外周免疫应答中的相互作用。特别是，野生型T细胞中而非PD-1缺陷型T细胞中的增殖在PD-L1的存在下受到抑制。另外，PD-1缺陷型小鼠表现出自身免疫表型。C57BL/6小鼠中的PD-1缺陷导致慢性进行性狼疮样肾小球肾炎和关节炎。在Balb/c小鼠中，PD-1缺陷由于心组织特异性自身反应性抗体的存在而引起严重的心肌病。一般而言，存在着提供用于免疫紊乱的安全且有效的治疗方法的需要，所述免疫紊乱例如自身免疫病、炎性疾病、变态反应、移植物排斥、癌症、免疫缺陷症以及其它免疫系统相关紊乱。这些紊乱中所涉及的免疫应答的调节可通过操纵PD-1途径而实现。抗PD-1抗体是可操纵PD-1途径的重要策略。国外很多大公司正在角逐抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体，目前国外已上市的抗PD-1抗体药物是百时美施宝贵的Nivolumab、默沙东的Keytruda。但是由于进口大分子药物对于病人来说需要花费高昂的费用，因此，研发新的抗PD-L1单克隆抗体，减少病人负担，降低治疗费用是一个亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与PD-1结合的靶向分子，所述靶向分子通过阻断PD-1与其配体结合，逆转了机体免疫抑制状态。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种分离的靶向分子，所述靶向分子包括：

(1)SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2、SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；和/或

(2)SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。

作为本发明的一个方面，本发明的靶向分子包括：

(1)重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和/或

(2)轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

本发明的靶向分子中的CDR并不局限于上面提到的VH和VL的具体序列，并且可包括保留了特异性结合PD-1能力的这些序列的变体。此类变体可由熟练技术人员利用本领域众所周知的技术由上面提到的具体序列得到。例如，可在FRs和/或CDRs中进行氨基酸取代、缺失或添加。尽管FRs中的变化通常被设计用于改善抗体的稳定性和免疫原性，但CDRs中的变化一般被设计用于提高抗体对其靶的亲和力。FRs变体也包括天然存在的免疫球蛋白同种异型。此类提高亲和力的变化可通过常规技术凭经验确定，所述技术包括改变CDR并测试抗体对其靶的亲和力。例如，可在所公开的任一CDR内进行保守氨基酸取代。可依据AntibodyEngineering，第2版，Oxford University Press，Borrebaeck编，1995中描述的方法进行各种改变。这些包括但不限于通过取代序列内编码功能上等同的氨基酸残基的不同密码子而改变了的核苷酸序列，由此产生“沉默”变化。例如，非极性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。序列内的氨基酸取代可选自该氨基酸所属类别的其它成员。此外，多肽中的任何天然残基也可用丙氨酸取代。

本发明的“靶向分子”是指抗体分子及具有免疫学活性的片段，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的抗体分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、hIgA2)或亚类的抗体分子。抗体分子的免疫学活性部分包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包括VL或VH结构域的单域抗体。包括单链抗体在内的结合抗原的抗体片段可以包括单独的可变区或与以下的全部或一部分组合的可变区：绞链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明也包括抗原结合片段，其包括可变区与绞链区、CH1、CH2和CH3结构域的任一组合。

本发明的靶向分子还包括与多肽重组融合的或化学缀合的(包括共价和非共价缀合的)靶向分子。

多肽重组融合的例子包括将本发明的靶向分子与标记物序列融合，标记物序列包括但不限于HA标签、6xHis标签、c-Myc标签、flag标签。

化学缀合的例子包括将本发明的靶向分子与可检测物质缀合。通过将抗体偶联到可检测物质可以促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、利用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属、以及非放射性的顺磁性金属离子。利用本领域已知的技术，可检测物质可以直接地与抗体(或其片段)偶联或缀合，或经中间物(例如本领域已知的接头)间接地偶联或缀合。参见例如关于金属离子的美国专利No.4,741,900，其中所述金属离子可以与抗体缀合，用作本发明的诊断剂。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、dichlorotriazinylamine荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素、和水母发光蛋白；合适的放射性材料的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In或⁹⁹Tc。

本发明的靶向分子还包括前面所述的靶向分子的功能变体。如果变体能与亲代靶向分子竞争特异性结合PD-1或其蛋白片段，则认为该变体分子是本发明靶向分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合PD-1或其蛋白片段。所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然氨基酸。此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代靶向分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合PD-1或其片段。此后，当使用术语“靶向分子”时，其也涵盖所述靶向分子的功能变体。

作为本发明的另一方面，本发明还提供了前面所述的靶向分子的多核苷酸。本发明还包括在严格或较低严格的条件下能与编码本发明的靶向分子的多核苷酸杂交的多核苷酸。

本领域技术人员将意识到这些多核苷酸的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核甘酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。

可以利用本领域任一已知的方法得到多核苷酸序列，并确定出多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果已知抗体的核苷酸序列，就可以从化学合成的寡核苷酸装配出编码所述抗体的多核苷酸。

或者，可以从来自合适来源的核酸中产生编码抗体的多核苷酸。如果无法得到含有编码特定抗体的核酸的克隆，但已知所述抗体分子的序列，那么可以通过化学合成得到编码所述免疫球蛋白的核酸，或利用与所述序列的3’和5’末端可杂交的合成引物从合适的来源(例如抗体cDNA文库、或从表达所述抗体的任一组织或细胞例如所选择的用于表达本发明的抗体的杂交瘤细胞中所产生的cDNA文库，或从中所分离到的核酸，优选聚A+RNA)通过PCR扩增得到编码所述免疫球蛋白的核酸，或通过利用特异于所述特定基因序列的寡核苷酸探针通过克隆得到编码所述免疫球蛋白的核酸，以例如从cDNA文库中鉴定出编码所述抗体的cDNA克隆。然后可以利用本领域任一熟知的方法将PCR所产生的扩增核酸克隆到可复制的克隆载体内。

一旦确定了抗体的核苷酸序列以及相应的氨基酸序列，就可以利用本领域熟知的处理核苷酸序列的方法例如重组DNA技术、定位诱变、PCR等处理抗体的核苷酸序列以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失、和/或插入。

可以用熟知的方法检查重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列以鉴定出CDR的序列，所述方法例如通过与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列比较以确定出序列的高变异性区域。利用常规重组DNA技术，可以将一个或多个CDR插入到构架区内，例如插入到人构架区内以人源化非人抗体，如上面所述。构架区可以是天然发生的或共有的构架区，以及优选地是人构架区(见例如，293Tthiaeta l.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)中的人构架区的列表)。优选地，通过构架区和CDR的组合所产生的多核苷酸编码与本发明的多肽特异结合的抗体。优选地，如上面所讨论的，在构架区内可以进行一个或多个氨基酸取代，以及优选地所述氨基酸取代提高了抗体与其抗原的结合。另外，可以用这些方法对参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基进行取代或删除，以产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。本发明包括对多核苷酸的其它改变，这也在本领域人员的技术范围之内。

本发明还提供了一种含有前面所述的多核苷酸的重组载体。

利用熟知的技术可以制备含有编码本发明靶向分子的核苷酸序列的重组载体。所述载体包括与合适的转录或翻译调节核苷酸序列可操纵地连接的核苷酸序列，所述转录或翻译调节核苷酸序列例如那些起源于哺乳动物、微生物、病毒、或昆虫基因的序列。调节序列的实例包括转录启动子、操纵子、增强子、mRNA核糖体结合位点、和/或其它控制转录和翻译起始和终止的合适序列。当所述调节序列与合适的多肽的核苷酸序列功能性相关时，核苷酸序列是“可操纵地连接的”。因此，如果一个启动子核苷酸序列控制合适的核苷酸序列的转录，那么所述启动子核苷酸序列就是可操纵地连接于例如抗体重链序列的。

本发明还提供了一种含有前面所述的多核苷酸或前面所述的重组载体的宿主细胞。

可用于本发明的宿主细胞包括但不限于微生物，例如经含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；经含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母菌例如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；经含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；经重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)；烟草花叶病毒(TMV)感染的或经含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)。

在本发明的具体实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，更优选CHO细胞。

用重组DNA转化、转染宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。一些采用的转化、转染方法包括但并不限于：常规化学方法如磷酸钙共沉淀法、PEI转染法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，以表达本发明的靶向分子。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明的靶向分子优选的是采用哺乳动物细胞来生产，哺乳动物细胞通常需要在含血清的培养基中进行培养。需要对细胞进行无血清的适应过程后，方可让细胞在无血清培养基中正常的生长。

本发明提供了一种解除PD-1对机体免疫抑制的药物组合物，所述药物组合物包括有效量的本发明的靶向分子。

本发明也提供了包括一个或多个装有本发明的药物组合物的一种或多种组分的容器的药物包装或试剂盒。与这些容器任选地伴随的可以是以管理药物或生物产品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的说明，这些说明反映了管理人体施用的药物的生产、使用或销售的机构的认证。

本发明还提供了一种包括前面所述靶向分子的检测产品。

所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述靶向分子的能够检测出PD-1的检测产品均包括在本发明的范围之内。

本发明还提供了一种非诊断目的的检测PD-1水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)获取含有PD-1的样品；

(2)将步骤(1)获取的样品与前面所述的靶向分子接触；

(3)检测样品与靶向分子的结合反应。

本发明还提供了制备所述的靶向分子的方法，其包括在适合于引起从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下培养包含本发明的载体的宿主细胞，以及分离靶向分子。

本发明还提供了前面所述的靶向分子在制备解除PD-1对机体免疫抑制的药物中的应用。

本发明还提供了前面所述的靶向分子在制备治疗免疫障碍的药物中的应用。

本发明的靶向分子还可以与其他具有相同或者互补功能的药物联合应用，联合应用的效果可以是靶向分子与其他药物功能之和，还可以远远大于靶向分子与其他药物功能之和，这种情况表明该靶向分子与其他药物之间产生了协同作用。

其他具有相同或者互补功能的药物包括已知靶向抗肿瘤药与未知靶向抗肿瘤药，还可包括任意的化疗药或化合物。

靶向抗肿瘤药包括(但不限于)17-AAG、2-deoxyglucose、阿比特龙(Abiraterone)、ABT-263、AC-220、AT-406、AZD4547、AZD5363、AZD7762、BI-2536、Birinapant、BMS-754807、硼替佐米(Bortezomib)、BX-795、卡博替尼(Cabozantinib)、CAL-101、卡非佐米(Carfilzomib)、克唑替尼(crizotinib)、danusertib、达沙替尼(Dasatinib)、Dovitinib、Elesclomol、Embelin、恩替诺特(Entinostat)(MS-275)、Enzastaurin、依维莫司(Everolimus)、Foretinib、氟维司群(Fulvestrant)、Ganetespib、GDC0941、GSK429286A、JQ1、KU-55933、KX2-391、Lenvatinib、Linifanib、Linsitinib、LY2157299、Masitinib、MK-1775、MK-2206、MLN-4924、Neratinib、NU7441、Nutlin-3、NVP-BEZ235、NVP-BKM120、Orantinib、PCI-32765、PD-0325901、PD-0332991、PD-173074、PH-797804、PRT062607、R-406、Refametinib、瑞戈非尼(Regorafenib)、SCH900776、sgi-1776、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、TAE684、替西莫司(Temsirolimus)、TG-101348、Tideglusib、Tipifarnib、Tivantinib、Toremifene、Tozasertib、曲美替尼(Trametinib)、维甲酸(Tretinoin)、Triptolide、伐地考昔(Valdecoxib)、维莫德吉(Vismodegib)、Volasertib、伏立诺他(Vorinostat)、YM-155、CHIR-99021、NVP-BGJ398、LY2090314。

所述的化疗药包括(但不限于)六甲蜜胺、氨鲁米特、阿那罗唑、阿扎胞苷、苯达莫司汀、白消安、卡巴他赛、卡培他滨、卡铂、顺铂、克拉曲滨、氯法拉宾、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、柔红霉素、地西他滨、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊甙、伊西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、依达比星、异环磷酰胺、伊立替康、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、洛莫司丁、6-巯基嘌呤、美司钠、甲胺喋呤、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、奈拉滨、培美曲塞、喷司他汀、普拉曲沙、甲苄肼、雷替曲噻、链脲霉素、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、长春花碱、长春瑞滨、唑来膦酸。

附图说明

图1显示pcDNA^TM5/FRT的物理图谱；

图2显示利用琼脂糖电泳检测PCR产物和酶切产物的电泳图，其中：A：Kappa-BGHpoly A片段PCR产物，泳道1代表DL2000，泳道2代表PCR产物，B：Kappa-BGH poly A片段XbaI，BamHI酶切，泳道1代表DL2000，泳道2代表酶切片段，C：PCMV/T7片段PCR产物，泳道1代表DL2000，泳道2代表PCR产物，D：PCMV/T7片段BamHI，NotI酶切，泳道1代表DL2000，泳道2代表酶切片段，E：重链恒定区片段PCR产物，泳道1代表DL2000，泳道2代表PCR产物，F：重链恒定区片段NotI，PmeI酶切，泳道1代表DL2000，泳道2代表酶切产物。

图3显示利用显示利用琼脂糖电泳检测构建载体的酶切产物电泳图，其中泳道1代表DL2000，泳道2代表EcoRI酶切片段，泳道3代表HindIII酶切片段，泳道4代表Bsiwl酶切片段，泳道5代表ClaI酶切片段，泳道6代表NheI酶切片段，泳道7代表XbaI酶切片段，泳道8代表BamHI+NotI酶切片段，泳道9代表NotI+PmeI酶切片段；

图4显示PRT/KIgGl载体的结构示意图；

图5显示利用双夹心ELISA检测抗体表达量的统计图；

图6显示利用间接ELISA检测抗体结合能力的曲线图；

图7显示利用间接ELISA检测抗体结合特异性的统计图；

图8显示利用Biacore检测抗体亲和能力的曲线图；

图9显示利用ELISA检测抗体竞争结合抗原的结合曲线图；

图10显示利用ELISA检测抗体对T细胞IFN-γ表达的影响的统计图；

图11显示利用ELISA检测抗体对CD4⁺T细胞IFN-γ表达的影响的统计图。

具体实施方式

术语解释

本文所用术语“免疫障碍”是指由于PD-1与其配体结合介导的信号通路导致的机体免疫抑制。可用于本发明的免疫障碍的非限定性实例包括但不限于，类风湿性关节炎、多发性硬化、炎性肠病、克罗恩病、全身性红斑狼疮、I型糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、过度增生性免疫障碍、肿瘤和感染性疾病。本发明的靶向分子可以用于治疗的肿瘤种类没有特别限制，任何实体的、非实体的、恶性的或良性的肿瘤均包括在本发明的范围之内。肿瘤的实例包括但不限于：皮肤癌，白血病，肾上腺皮质癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑癌，乳腺癌，气管及支气管肿瘤，淋巴瘤，神经系统肿瘤，宫颈癌，肠癌，肛门癌，子宫内膜癌、食管癌，鼻咽癌，卵巢癌，肉瘤，眼癌，恶性纤维组织细胞癌，胆囊癌，胃癌，结直肠癌、胃肠道类癌瘤，胃肠道间质瘤，胚细胞瘤，头颈癌，肝癌，下咽癌，黑色素瘤，胰腺癌，肾癌，喉癌，唇癌，口腔癌，口咽癌，肺癌，间皮瘤，骨髓瘤，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜络细胞瘤，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，涎腺癌，皮肤癌，睾丸癌，喉癌，胸腺瘤，甲状腺癌，尿道癌，阴道癌，外阴癌。

本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体获得的抗体，除少数可能存在的天然发生的突变外，该群体中包含的单个抗体是相同的。修饰语“单克隆”仅表示抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不能解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。可变性集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区(可变区中较保守的部分)，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

术语“治疗”和“治疗方法”既指治疗性治疗又指预防/预防性措施。需要治疗的那些个体可包括早已患有特殊医学紊乱的个体，以及可能最终患有所述紊乱的那些个体(即需要预防性措施的那些个体)。

本文所述的“样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。该术语涵盖了得自任何物种的各种临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清和细胞溶解产物。

术语“分离的”是指基本上脱离其天然环境的分子。例如，分离的蛋白基本上不含来自得到它的细胞或组织源的细胞材料或其它蛋白。术语“分离的”也指其中分离的蛋白足够纯以至于能够作为药物组合物施用的制剂，或者至少70-80％(w/w)纯，更优选至少80-90％(w/w)纯，甚至更优选90-95％纯，并且最优选至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(w/w)纯。

术语“特异性结合”是指两分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合以高亲和力以及低度到中度的结合量为特征，这有别于通常具有低亲和力与中度到高度的结合量的非特异性结合。一般地，当亲和常数KA高于106M-1或更优选高于108M-1时，认为结合是特异性的。如必要，可通过改变结合条件降低非特异性结合而基本上不影响特异性结合。熟练技术人员可利用常规技术优化合适的结合条件，如抗体的浓度、溶液的离子强度、温度、允许结合的时间、封闭剂(如血清清蛋白、乳酪蛋白)的浓度等。

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1抗PD-1抗体制备

1、PRT/KIgG1全长抗体表达载体构建

构建全长抗体表达载体需要在pcDNA^TM5/FRT载体骨架(图1)的基础上依次引入轻链可变区克隆位点、CK基因、BGH>

采用overlap PCR、定点克隆等分子生物学手段构建全长抗体表达载体，所用引物如下：

Kappa-BGH poly A基因序列引物

P-Kappa-TY：

5’-CCTCTAGAGAATTCAAGCTTTAGCGTACGGTGGCTGCACCATC-3’

Kappa-BGH3：

5’-GTCGAGGCTGATCAGCGGCTAACACTCTCCCCTGTTG-3’

Kappa-BGH5：

5’-CAACAGGGGAGAGTGTTAGCCGCTGATCAGCCTCGAC-3’

Kappa3：

5’-CCGGATCCACATTCCACAGGGGCCATCC-3’

PCMV/T7基因序列引物

Pcmv/t7-up:5’-GGGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAA-3’

Pcmv/t7-down:5’-GCGGCCGCTTGGGTCTCCCTATAGTGAG-3’

Heavy链恒定区基因引物：

P-Ig G1H-TY：

5’-ATCGGCGGCCGCGAATTCATCGATTAGGCTAGCACCAAGGGCCCATC-3’

Heavy-3：

5’-GTTTAAACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTA-3’。

借助overlap PCR将轻链可变区克隆位点(酶A、酶B)、Kappa链恒定区、BGHPoly A序列进行拼接，获得大小为650bp目标片段，并构建T载体，酶切测序正确(图2A，B)，通过XbaI，BamHI酶切位点克隆入pcDNA^TM5/FRT载体。在此基础上，通过BamHI，NotI酶切位点，将测序正确的PCMV/T7启动子基因序列(图2C，D)克隆入载体中。

PCR拼接重链可变区克隆位点(酶C，酶D)，IgGl重链恒定区基因序列(CH1，CH2，CH3获得大小约1000bp的目标片段，克隆T载体，测序正确(图2E，F)，并通过NotI，PmeI酶切位点定向克隆入前述载体中。

根据载体构建过程，以及载体自身的酶切位点特征，选择EcoRI，HinIII，BsiwI，C1aI，NheI，Xbai对目标载体进行酶切鉴定(图3)。理论上，该载体中一共含有3个EcoRI酶切位点，EcoRI单酶切将载体切成三条线性片段，结果与预期相符；HinIII，BsiwI，C1aI，NheI，Xbai均为载体中单一酶切位点，将载体切成单一的线性片段，结果与预期相符。进一步分别用酶BamHI+NotI以及NotI+PmeI进行酶切(图3泳道8,9)，分别获得载体大片段与PCMV/T7(约650bp)以及Heavy表达盒(约1000bp)小片段，与预期一致。

上述结果表明，目标载体构建成功，命名为PRT/KIgGl，其结构示意图见图4。理论而言，该载体适用于各种全长抗体的表达。

2、抗PD-1抗体表达量测定

(1)利用基因合成的方法合成抗体重链可变区序列(序列如SEQ ID NO.7所示)、轻链可变区序列(序列如SEQ ID NO.8所示)，并将其利用分子克隆的方法将片段克隆入PRT/KIgGl中。

(2)瞬时转染

将处于对数生长期的293T细胞以5*10⁵个/孔密度接种于6孔板中，12h后弃换新鲜培养基。4μg抗体表达质粒加入250μL>TM>

(3)双夹心ELISA测定瞬时表达上清中抗体表达量

用包被液稀释GAH-IgG抗体至2μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭lh。1xPBS稀释Herceptin至0.5μg/mL，在此基础上进行2倍稀释获得8个浓度梯度，同时用1xPBS稀释瞬时表达上清至625倍、3125倍、15625倍。将Herceptin与瞬时表达上清按照100μL/每孔加入酶联板中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人酶标二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μLTMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以标准品浓度LN值为横坐标，相应的OD值为纵坐标，绘制一条标准曲线并添加线性回归曲线及其相关系数R²(R²>0.95)，并用y＝kx+b直线方程计算样品中抗体浓度。

(4)结果

结果如图5所示，利用上述方法能够表达出抗PD-1抗体。

实施例2抗PD-1抗体结合能力测定

1、抗体大量表达与纯化鉴定

将抗体表达质粒按照以上的转染方法大量转染293T细胞并利用Protein A纯化获得抗体的纯化样品。

2、间接ELISA检测抗体抗原结合能力

2.1步骤

包被液稀释PD-1/Fc抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭1h。用1xPBS稀释抗体至3μg/mL，并以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人(Fab')2-HRP二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。并以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制抗体-抗原结合曲线。利Graphpad分析软件拟合四参数方程曲线，方程为y＝(A-D)/(1+(X/C)^B)+D，其中B代表斜率，C代表EC50。

2.2结果

结果如图6所示，本发明制备的抗PD-1抗体结合活性与MIL75相近，能够特异性识别固相载体上的PD-1抗原分子，且随着抗体浓度的增加抗原一抗体之间结合具有良好的剂量依赖性。

3、抗体结合抗原特异性检测

3.1步骤

包被液稀释PD-1/Fc，CD28/Fc，CTLA4/Fc，BTLA/Fc，ICOS/Fc抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，以平行孔作为复孔。置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒中37℃封闭1h。用1xPBS稀释抗体至1μg/mL，并以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人(Fab')a-HRP二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应5min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。并以抗体名称为横坐标，OD值为纵坐标绘制柱形图。

3.2结果

结果如图7所示，本发明制备的抗PD-1抗体只特异性识别PD-1分子，而与其他分子不存在交叉识别现象。

4、抗PD-1抗体亲和力测定

4.1步骤

利用Biacore测定抗体的亲和力。

将抗人Fab抗体偶联到CM5芯片上，将抗体样品稀释到1-2μg/ml并以30ml/min流速进样60-150秒。将PD-1/Fc融合蛋白进行梯度稀释至浓度为3.125，6.25，12.5，25，50，100nM并以30μL/min流速进样抗原结合120秒，解离1200S。实验结束后用10mM Glycine-HClpH2.1进行再生60秒。利用Biacore T200分析软件分析结果。

4.2结果

结果如表1所示，本发明制备的抗PD-1抗体与MIL75的亲和力相当，图8是抗体的亲和力动力学曲线(选择3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM五个浓度进行拟合)。

表1抗体亲和力测定结果

Ka(1/Ms)Kd(1/s)KD(M)MIL755.594E+57.900E-51.412E-10本发明制备抗体2.946E+511.26E-53.821E-10

实施例3抗PD-1抗体阻断PD-1/PDL-1作用

1、ELISA检测PDL1/Fc-Biotin与PD-1结合活性

1.1步骤

包被液稀释PD-1/Fc抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭1h。用1xPBS稀释PDL-1/Fc-Biotin至48μg/mL，进行3倍稀释共获得12个浓度点。以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入Peroxidase-Labeled Streptavidin(1:4000)室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以PDL-1/Fc-Biotin浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制PD-1/PDL-1结合曲线，选取PDL-1结合PD-1最低饱和浓度进行抗体阻断实验。

1.2结果

摸索出PDL-1/Fc-Biotin参与结合固相抗原PD-1分子最低饱和浓度为5μg/mL。

2、抗体阻断PD-1/PDL-1相互作用

2.1步骤

包被液稀释PD-1/Fc抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭lh。用1xPBS稀释PDL-1/Fc-Biotin至5μg/mL，以上述溶液作为稀释液稀释抗体至抗体浓度500μg/mL，并进行5倍稀释共获得12个浓度梯度。100μL每孔加入酶联板中湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入Peroxidase-LabeledStreptavidin(1:4000)室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制结合曲线。

2.2结果

结果如图9所示，结果表明本发明制备的抗体可以有效阻断PD-1/PDL-1相互作用。

实施例4抗PD-1抗体的体外活性检测

1、外周血单个核细胞活性实验

取1名健康志愿者全血10-15mL，利用人淋巴细胞分离液分离人PBMC细胞，生理盐水洗细胞2遍，10％FBS 1640培养基重悬细胞并计数，以1*10⁵/孔接种于96孔板中，每孔接种50μL。将梯度的CD3抗体以及CD28抗体以25μL/孔加入对应的培养孔中至二者的终浓度均为1μg/mL，0.8μg/mL，0.6μg/mL，0.4μg/mL，0.2μg/mL，0.1μg/mL。同时在培养体系中以25μL/孔加入梯度PDL-1/Fc融合蛋白至终浓度为0μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL。置于37℃细胞培养箱培养72h，收获上清并利用人IFN-γELISA检测试剂盒测定上清中IFN-γ的表达情况。

基于上述方法测定刺激PBMC活化的最适CD3，CD28浓度以及PDL-1抑制浓度。同样的方法分离人PBMC细胞并以同样的细胞密度接种于96孔板中。配置最适抗体刺激浓度以及PDL-1抑制浓度加入相应的孔中。10％FBS 1640培养基稀释抗体至终浓度为0μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL、40μg/mL加入对应的反应体系，37℃细胞培养箱培养72h，收获上清并利用人IFN-γELISA检测试剂盒测定上清中IFN-γ的表达情况。

结果：结果如图10所示，CD3/CD28抗体能够有效激活T细胞，PDL-1的加入则在一定程度抑制T细胞活性，本发明制备的抗体的加入能够有效逆转T细胞被抑制的状态，进而上调IFN-γ的表达，而且抗体的逆转效果具有剂量依赖性。利用未配对t检验对各抗体浓度点IFN-γ的表达量进行统计学分析，结果显示本发明制备的抗体与MIL75各浓度点IFN-γ的表达水平无统计学差异。表明本发明制备的抗体与阳性抗体MIL75具有一致的体外生物学活性。

2、混合淋巴细胞活性实验

混合淋巴细胞活性实验是将分离的单核细胞诱导为成熟的DC细胞与异源CD4⁺T进行混合培养，抗PD-1抗体的加入能够有效激活T细胞的活性，通过检测上清中IFN-γ的表达水平间接反映抗体的细胞活性。实验不同时间点所用人全血来源于2名健康志愿者。

首先，利用人淋巴细胞分离液分离1名健康志愿者全血中PBMC细胞，并利用单核细胞磁珠分选试剂盒分选单核细胞。10％FBS>4/孔接种于96孔板，利用50ng/mL>十T细胞磁珠分选试剂盒分选CD4^十T阳性的细胞，10％FBS>5/孔接种于96孔板，同时用10％FBS>十T细胞一同加入96孔板中使得抗体的终浓度分别为50μg/mL，10μg/mL，2μg/mL，0.4μg/mL，0.08μg/mL，0.016μg/mL，设置无关抗体对照(本实验室制备的抗蓖麻毒素人源化抗体MIL50)和阴性对照(不加抗体)。继续置于37℃细胞培养箱培养5天收获上清，并利用人IFN-γELISA检测试剂盒测定上清中IFN-γ的表达情况。

结果如图11所示，本发明制备的抗体能够有效激活CD4^十T细胞释放IFN-γ，且抗体的激活效应随着抗体浓度增加具有良好的剂量依赖性。

虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 解除PD-1对机体免疫抑制的靶向药物

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Trp Tyr Asp Gly Ser Lys

1 5

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Gly Asp Tyr

1

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Thr Ser Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Asn Ser Asn Trp Pro Arg Thr

1 5

<210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

202530

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

354045

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Leu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65707580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Thr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 1015

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

202530

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

354045

Tyr Thr Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65707580

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ser Asn Trp Pro Arg

859095

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105