原奶中山羊和奶牛源性同步检测的引物和探针及试剂盒

摘要

本发明公开了一种原奶中山羊和奶牛源性同步检测的引物和探针及试剂盒，引物和探针序列如下：山羊源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示；奶牛源性检测正向引物序列如SEQ ID No.2所示；山羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.3所示；奶牛源性检测反向引物序列如SEQ ID No.4所示；山羊探针序列如SEQ ID No.5所示；奶牛探针序列如SEQ ID No.6所示；质控探针序列如SEQ ID No.7所示。本发明的引物、探针及试剂盒的特异性好、灵敏度高，可以实现原奶中山羊源性、奶牛源性以及质控同管检测，并且可以进行山羊源性和奶牛源性的定量检测。

说明书

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及原奶中动物源性检测领域。

背景技术

乳制品是人类膳食结构的重要组成部分，富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿 物质(包括微量元素)等营养物质。这些营养成分不仅是组成宏观人体和微观细胞的基础， 也是调控人体生命活动和细胞内生物化学反应的源泉。乳制品除了含有丰富的常规营养成分 之外，色、香、味俱佳的感官体验更是赋予其全球美食的内核。然而，伴随着日益增长的生 产量和消费量，乳制品成为在食品生产、加工、流通以及餐饮领域中造假掺假的主要目标。

我国对于乳制品真伪鉴别技术方面的研究起步晚，这一领域的研究还处于初步的阶段。 由此可见，当前在乳制品真伪鉴别技术方面的研究领域，实现具有我国自主产权的、安全高 效的检测技术是一个充满机遇同时极具挑战的研究课题。建立安全、高效、快速的检测技术 平台是乳制品真伪鉴别研究领域亟待解决的关键性问题。作为羊、马、牛、驼产品(乳制品) 基地的锡林郭勒盟迫切需要研发具有自主知识产权的羊奶和牛奶相关乳制品真伪鉴别技术及 检测标准，以此保护地方特色乳制品和维护消费者的合法权益。目前，乳制品真伪鉴别相关 的技术研究、检测标准、发明专利以及商业试剂盒主要集中在单一通道单一源性检测和异管 质控检测，同时多通道多源性检测和同管质控检测报道较少。假阴性一直是困扰PCR技术 在乳制品真伪鉴别中广泛应用的瓶颈。同管质控检测可以有效的防止假阴性的发生。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的原奶中山羊源性、奶牛 源性以及质控同管检测的引物、探针及试剂盒和方法，解决原奶中山羊和奶牛源性成分定性 和定量检测问题。

本发明的技术方案为：原奶中山羊源性、奶牛源性以及质控同管检测的引物和探针，引 物和探针序列如下：

山羊源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示；

奶牛源性检测正向引物序列如SEQ ID No.2所示；

山羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.3所示；

奶牛源性检测反向引物序列如SEQ ID No.4所示；

山羊探针序列如SEQ ID No.5所示；

奶牛探针序列如SEQ ID No.6所示；

质控探针序列如SEQ ID No.7所示。

进一步地，山羊探针、奶牛探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬 灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为TAMRA、 BHQ1或BHQ2中任意一种。

作为本发明的另一目的，提供了一种原奶中山羊源性、奶牛源性以及质控同管检测的试 剂盒，该试剂盒中含有：

SEQ ID No.1所示的山羊源性检测正向引物，

SEQ ID No.2所示的奶牛源性检测正向引物，

SEQ ID No.3所示的山羊源性检测反向引物，

SEQ ID No.4所示的奶牛源性检测反向引物，

SEQ ID No.5所示的山羊探针，

SEQ ID No.6所示的奶牛探针，

SEQ ID No.7所示的质控探针，

Probe qPCR预混液，

山羊阳性标准品，

奶牛阳性标准品。

当然，也可以单独检测山羊源性，为了节省成本，只需要去除奶牛源性相关的试剂即可 (SEQ ID No.2所示的奶牛源性检测正向引物、SEQ ID No.4所示的奶牛源性检测反向引物、 SEQ ID No.6所示的奶牛探针和奶牛阳性标准品)因此，作为本发明的另一目的，还提供了 一种原奶中山羊源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：

SEQ ID No.1所示的山羊源性检测正向引物，

SEQ ID No.3所示的山羊源性检测反向引物，

SEQ ID No.5所示的山羊探针，

SEQ ID No.7所示的质控探针，

Probe qPCR预混液，

山羊阳性标准品。

当然，也可以单独检测奶牛源性，为了节省成本，只需要去除山羊源性相关的试剂即可 (SEQ ID No.1所示的山羊源性检测正向引物、SEQ ID No.3所示的山羊源性检测反向引物、 SEQ ID No.5所示的山羊探针和山羊阳性标准品)因此，作为本发明的另一目的，还提供了 一种原奶中奶牛源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：

SEQ ID No.2所示的奶牛源性检测正向引物，

SEQ ID No.4所示的奶牛源性检测反向引物，

SEQ ID No.6所示的奶牛探针，

SEQ ID No.7所示的质控探针，

Probe qPCR预混液，

奶牛阳性标准品。

原奶中山羊源性、奶牛源性以及质控同管检测的方法，步骤如下：

(1)提取原奶的DNA；

(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100-200ng/μL；

(3)利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.7的引物和探针对稀释DNA进行多重荧光定量PCR扩增，利用山羊和奶牛阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；

(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取山羊、奶牛和质控相应 探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当质控Ct≤35和阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应两源性；

(5)利用山羊和奶牛阳性标准品做DNA定量的标准曲线；

(6)利用检测原奶的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到原奶中相应源性的 定量检测结果。

进一步地，Real-time PCR扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，31s，40循环。

进一步地，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR预混液10μL、SEQ ID No.1所示的 山羊源性检测正向引物0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.2所示的奶牛源性检测正向引 物0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.3所示的山羊源性检测反向引物0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.4所示的奶牛源性检测反向引物0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ IDNo.5所示的山羊探针1μL，浓度为10μmol/L；、SEQ ID No.6所示的奶牛探针1μL，浓度 为10μmol/L和SEQ ID No.7所示的质控探针1μL，浓度为10μmol/L；DNA模板1μL，灭 菌的去离子水4μL，总体积20μL。

本发明通过比对山羊、黄牛、绵羊、水牛、牦牛、猪、马、骆驼、驴、鸡、鸭、火鸡、 兔、狗、鸽子及鹌鹑等16种动物的线粒体基因组，每种动物选取多个品种或品系的线粒体 基因组序列。通过生物信息软件比对上述序列，筛选出山羊和奶牛保守和特异的序列，利用 引物设计软件进行引物和探针的设计。设计的创新性在于需要在100-150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，两端保守的位置设计引物，中间特异的位置设计探针。保守的引物和特异的探针可以有效的减少引物之间的错配以及多个PCR反应对反应资源的竞争，可以保证多重实时荧光定量PCR反应的进行。多重实时荧光定量PCR反应是多源性成分检测的基础。引物和探针的退火温度控制在55-60℃和65-70℃，并且没有影响退火效率的二级结构，而且要保证引物和探针在线粒体基因上具有高度的特异性，上述设计保证引物和探 针可以用于后续的定性和定量检测。

本发明研发了山羊、奶牛及质控等3通道检测引物和探针，优化多通道多源性检测和同 管质控检测的引物和探针组合。在此过程中克服了同一PCR反应体系中多种引物和探针之 间的影响以及对模板以及PCR反应资源的竞争的问题，达到PCR反应体系可以同时进行多 重实时荧光PCR的效果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的引物、探针及试剂盒的特异性好、灵敏度高，可以实现原奶中山羊和奶牛源性 的定性和定量检测，并且可以进行山羊、奶牛和质控的同时检测，节省了工序，降低了成本。

附图说明

图1利用HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性、FAM和TAMRA修饰探针标记奶牛 源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对山羊肉进行的实时荧光定量PCR的检测，山 羊肉中出现质控扩增曲线(质控-ROX)和山羊源性扩增曲线(山羊-HEX)。

图2利用HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性、FAM和TAMRA修饰探针标记奶牛 源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对黄牛肉进行的实时荧光定量PCR的检测，黄 牛肉中出现质控扩增曲线(质控-ROX)和牛源性扩增曲线(奶牛-FAM)。

图3利用HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性、FAM和TAMRA修饰探针标记奶 牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对绵羊肉、水牛肉、牦牛肉、猪肉、马肉、 骆驼肉、驴肉、鸡肉、鸭肉、火鸡肉、兔肉、狗肉、鸽子肉及鹌鹑肉等14种动物肌肉组织 (其它肉)进行的实时荧光定量PCR的检测，其他肉(除了山羊肉和牛肉)中只出现质控 扩增曲线(质控-ROX)。以上结果说明山羊和奶牛探针在肉中的源性检测方面具有高度的特 异性。

图4利用HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性、FAM和TAMRA修饰探针标记奶牛 源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对对山羊奶、牛奶和马奶进行的实时荧光定量 PCR的检测，山羊奶中出现质控扩增曲线(质控-ROX)和山羊源性扩增曲线(山羊-HEX)。

图5利用HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性、FAM和TAMRA修饰探针标记奶牛 源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对对山羊奶、牛奶和马奶进行的实时荧光定量 PCR的检测，牛奶中出现质控扩增曲线(质控-ROX)和奶牛源性扩增曲线(奶牛-HEX)。

图6利用HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性、FAM和TAMRA修饰探针标记奶 牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对对山羊奶、牛奶和马奶进行的实时荧光定 量PCR的检测，马奶中只出现质控扩增曲线(质控-ROX)。以上结果说明山羊和奶牛探针 在原奶中的源性检测方面具有较高的特异性。

图7利用HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性对山羊奶DNA(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，山羊源性 探针可以检测到0.1pg的山羊源性DNA。以上结果说明山羊探针在原奶的源性检测方面具 有较高的灵敏度。

图8利用FAM和TAMRA修饰探针标记奶牛源性对牛奶DNA(100ng、10ng、1ng、 0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，奶牛源性 探针可以检测到10pg的奶牛源性DNA。以上结果说明奶牛探针在原奶的源性检测方面具 有较好的灵敏度。

图9山羊源性检测标准曲线：用于原奶中山羊源性的定量检测。

图10奶牛源性检测标准曲线：用于原奶中奶牛源性的定量检测。

图11利用HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性、FAM和TAMRA修饰探针标记奶 牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对山羊奶和牛奶梯度混合样品(1％、5％、 10％、30％、70％、90％、95％和99％)进行山羊、奶牛和质控的同时检测，结果显示山 羊探针都可以检测到10％以上水平混合样品，奶牛探针都可以检测到5％以上水平混合样品。 以上结果说明混合探针(山羊、奶牛以及质控对照)具有山羊源性、奶牛源性以及质控对照 同时同管检测能力。

具体实施方式

1、检测方法：

(1)提取原奶的DNA，设立提取空白对照(后续做提取方法的对照组)。

(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100-200ng/μL。

(3)利用多重荧光定量PCR引物和探针对DNA稀释液进行扩增检测，利用山羊和奶牛阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组，Real-time PCR反应体系如表1所示，Real-time PCR扩增参数如表4所示。

表1 Real-time PCR反应体系(山羊、奶牛和质控的同时检测)

成分体积(微升)Probe qPCR预混液10山羊源性检测正向引物0.5奶牛源性检测正向引物0.5山羊源性检测反向引物0.5奶牛源性检测反向引物0.5山羊探针1奶牛探针1质控探针1DNA1灭菌的去离子水4总体积20

表2 Real-time PCR反应体系(山羊源性以及质控同时检测)

成分体积(微升)Probe qPCR预混液10山羊源性检测正向引物1山羊源性检测反向引物1山羊探针1质控探针1DNA1灭菌的去离子水5总体积20

表3 Real-time PCR反应体系(奶牛源性以及质控同时检测)

表4 Real-time PCR扩增参数

(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取山羊、奶牛和质控相应 探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当质控Ct≤35和阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应两源性。

(5)利用山羊和奶牛阳性标准品(稀释10¹到10⁷倍)做DNA定量的标准曲线。

(6)利用检测原奶的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到原奶中相应源性的 定量检测结果。

2、引物和探针序列的设计

由于线粒体在组织中的拷贝数高，而且在原奶中相对稳定，所以选择线粒体基因设计山 羊、奶牛和质控检测引物和探针。引物和探针的合成方法：委托北京睿博兴科生物公司按照 发明的序列进行合成和纯化。

山羊源性检测正向引物：5'TTGAATCAGGCCATGAAGC 3'(SEQ ID No.1)，

奶牛源性检测正向引物：5'TTGAATTAGGCCATGAAGC 3'(SEQ ID No.2)，

山羊源性检测反向引物：5'CTTACCTTGTTACGACTTATCTC 3'(SEQ ID No.3)，

奶牛源性检测反向引物：5'CTTACCTTGTTACGACTTGTCTC 3'(SEQ ID No.4)，

山羊探针：5'TCTCATGTAGTTGATGCGTGTTAATAGGCT 3'(SEQ ID No.5)，

奶牛探针：5'CTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTAAATAGGG 3'(SEQ ID No.6)，

质控探针：5'ACACACCGCCCGTCACCCT 3'(SEQ ID No.7)；

山羊、奶牛和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报 告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述淬灭基团为TAMRA、BHQ1或 BHQ2中任意一种。

3、引物和探针的特异性检测

单源性检测的Real-time PCR反应体系如下表所示

成分体积(微升)Probe qPCR预混液10山羊或奶牛源性检测正向引物1山羊或奶牛源性检测反向引物1相应源性探针1质控探针1DNA1灭菌的去离子水5总体积20

利用HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性、FAM和TAMRA修饰探针标记奶牛源性 及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对山羊肉、黄牛肉、绵羊肉、水牛肉、牦牛肉、猪 肉、马肉、骆驼肉、驴肉、鸡肉、鸭肉、火鸡肉、兔肉、狗肉、鸽子肉及鹌鹑肉进行qPCR 的检测

检测结果如下：

Ct值：平均值(三组数据)±标准差

结果说明：Ct小于35(不为0)说明样品中有相应源性。检测结果符合样品动物来源。 在山羊肉中检测出山羊源性，在黄牛肉中检测出奶牛源性，而在其他肉中没有检测到山羊和 奶牛源性。

利用HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性、FAM和TAMRA修饰探针标记奶牛源性 及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对山羊奶、牛奶及马奶进行qPCR的检测

检测结果如下：

Ct值：平均值(三组数据)±标准差

结果说明：Ct小于35(不为0)说明样品中有相应源性。检测结果符合样品动物来源。 在山羊奶中检测出山羊源性，在牛奶中检测出奶牛源性，而在其马奶中没有检测到山羊和奶 牛源性。

4、相应源性检测的引物和探针的检测限度实验

将山羊奶和牛奶的基因组DNA分别稀释10¹到10⁷倍(共8个模板浓度梯度)进行引物和探针的检测限度扩增实验。由以下结果可知，山羊源性探针可以检测到样品中0.1pg的山羊源性DNA，奶牛源性探针可以检测到样品中10pg的奶牛源性DNA。以上结果说明自>

检测结果如下：

Ct值：平均值(三组数据)±标准差；N/A:不适用于检测

5、利用HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性、FAM和TAMRA修饰探针标记奶牛 源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对山羊奶和牛奶梯度混合样品(1％、5％、 10％、30％、70％、90％、95％和99％)进行山羊、奶牛和质控的同时检测。

检测结果如下：

Ct值：平均值(三组数据)±标准差

结果说明：Ct小于35(不为0)说明样品中有相应荧光对应源性。结果显示山羊探针都可以检测到10％以上水平混合样品，奶牛探针都可以检测到5％以上水平混合样品。以上结果说明混合探针(山羊、奶牛以及质控对照)具有山羊源性、奶牛源性以及质控同管检测能力。

6、试剂盒制作

(1)山羊源性、奶牛源性同时检测试剂盒试剂如下表所示：

试剂说明Probe qPCR预混液反应体系(酶、dNTP、Mg²⁺)山羊源性检测正向引物浓度为10μmol/L奶牛源性检测正向引物浓度为10μmol/L山羊源性检测反向引物浓度为10μmol/L奶牛源性检测反向引物浓度为10μmol/L山羊探针浓度为10μmol/L奶牛探针浓度为10μmol/L质控探针浓度为10μmol/L山羊阳性标准品浓度为100ng/μL，用于山羊阳性对照及标准曲线奶牛阳性标准品浓度为100ng/μL，用于奶牛阳性对照及标准曲线灭菌的去离子水补充反应体系

(2)山羊源性检测试剂盒试剂如下表所示：

试剂说明Probe qPCR预混液反应体系(酶、dNTP、Mg²⁺)山羊源性检测正向引物浓度为10μmol/L山羊源性检测反向引物浓度为10μmol/L山羊探针浓度为10μmol/L质控探针浓度为10μmol/L山羊阳性标准品浓度为100ng/μL，用于山羊阳性对照及标准曲线灭菌的去离子水补充反应体系

(3)奶牛源性检测试剂盒试剂如下表所示：

序列表

<110> 申请人名称:锡林郭勒职业学院

<120> 原奶中山羊和奶牛源性同步检测的引物和探针及试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgaatcagg ccatgaagc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgaattagg ccatgaagc 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttaccttgt tacgacttat ctc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttaccttgt tacgacttgt ctc 23

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctcatgtag ttgatgcgtg ttaataggct 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctctcatgta gctagtgcgt ttaaataggg 30

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acacaccgcc cgtcaccct 19